專利名稱：分離的25kd突觸相關(guān)蛋白及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于基因工程領域。具體地說，其是分離的25KD突觸相關(guān)蛋白及其應用，其涉及一個硬骨魚鱸魚(Lateolabrax japonicus)的位于細胞膜的受體25kD突觸相關(guān)蛋白(簡稱SNAP-25)的DNA序列，還涉及含有該蛋白基因的重組質(zhì)粒以及表達該蛋白的重組菌株和細胞系。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有技術(shù)中，細胞胞吐及分泌作用是生物體最基本的生命現(xiàn)象之一。它維系著個體正常的新陳代謝和生命活動，涉及到生物體從細胞到個體的不同層次，涵蓋生長、發(fā)育、生殖及防御等各個方面。在生命活動中，分泌蛋白首先是在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，然后運輸?shù)礁郀柣w進行修飾與包裝，最后轉(zhuǎn)運到細胞膜分泌；分泌物質(zhì)在各個亞細胞結(jié)構(gòu)之間的運輸，以及從亞細胞結(jié)構(gòu)到細胞膜的運輸都是由分泌運輸囊泡完成的。在神經(jīng)科學領域的研究發(fā)現(xiàn)，分泌作用中運輸囊泡的組裝、填充、貼附以及融合的整個過程，都在分子水平上受到精確的控制。一些與分泌有關(guān)的蛋白相繼被發(fā)現(xiàn)，它們的功能逐漸被確認。其中之一就是首先在神經(jīng)系統(tǒng)的突觸發(fā)現(xiàn)的SNAP-25。此蛋白為調(diào)控分泌作用的一類膜受體蛋白質(zhì)家族-SNARE蛋白家族的核心成員之一。該蛋白通過與其它SNARE蛋白的相互協(xié)調(diào)，共同作用，在分子水平，從空間上和時序上對細胞內(nèi)運輸和細胞外分泌——這一基本生命現(xiàn)象進行嚴格精密的調(diào)控。SNAP-25是1990年由Clary于牛腦膜中首先發(fā)現(xiàn)的一種膜蛋白。它主要在神經(jīng)組織表達，在神經(jīng)以外組織通常采用SNAP-23(Syndet)作為替代形式。SNAP-25的蛋白結(jié)構(gòu)較為簡單，一般由基因組中8個外顯子共同表達，含202到206個氨基酸。在低等生物(如擬南芥、線蟲)要更長一些(可達260個氨基酸)。目前對其序列已經(jīng)有了清楚的認識。
有關(guān)海洋動物SNAP-25的研究進行不多。對SNARE蛋白的研究相對集中在精卵融合這一生理現(xiàn)象。Schulz等人(1998)在研究棘皮動物海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)精子頂體反應等受精過程中發(fā)現(xiàn)了SNAP-25的同工型，其基因序列與哺乳動物SNAP-25有71％的堿基相同，它們參與了精子與卵子的識別與融合過程。對水生生物魚類的研究方面，Rinsinger等人(1993)從電鰩神經(jīng)末梢發(fā)現(xiàn)SNAP-25的同工型基因的表達。在1994年，Risinger，C.等人還從另一種水生生物-金魚(Carassiusauratus)的cDNA文庫中篩選出SANP-25a，SANP-25c和SNAP-25d三種基因，并對其基因型進行了比較分析。他還于1998年從斑馬魚cDNA文庫中成功篩選出SNAP-25基因，對其基因組結(jié)構(gòu)方面進行了分析，并與哺乳動物加以比較。同年，Sutton R.B.等研究了SNAP-25與其它SNARE蛋白之間的相互作用，極大地深化了對SNAP-25結(jié)構(gòu)的認識。在我國，迄今為止尚沒有有關(guān)SNAP-25研究的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個分離的25KD突觸相關(guān)蛋白及其應用，該25KD突觸相關(guān)蛋白具有調(diào)控細胞離子通道作用的受體蛋白——SNAP-25，及其基因結(jié)構(gòu)和相應的氨基酸序列。該基因表達產(chǎn)物，在HIT細胞中，可以抑制延遲反應器型鉀離子通道的活性。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，克隆了一種分離的25KD突觸相關(guān)蛋白(SNAP-25)基因。該25KD突觸相關(guān)蛋白基因來源于硬骨魚鱸魚(Lateolabraxjaponicus)，該25KD突觸相關(guān)蛋白(SNAP-25)的基因，它具有SEQ NO.1所示核苷酸序列，該基因含615個堿基對的DNA。
該25KD突觸相關(guān)蛋白的氨基酸序列與SEQ NO.2所示氨基酸序列具有至少80——90％的同源性。
所述的該25KD突觸相關(guān)蛋白的編碼是一個由204個氨基酸組成的活性蛋白質(zhì)；其具有抑制HIT細胞延遲反應器型鉀離子通道(delayed rectifier K+channel，KDR)生物學活性的功能。
所述的該25KD突觸相關(guān)蛋白的氨基酸序列的肽鏈分為四部分在靠氨基有兩個螺旋卷曲A和B，均含約40個氨基酸；羧基末端也有一相似螺旋卷曲C，該螺旋卷曲B和C之間是一段具疏水性無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)；其間第85-92個氨基酸序列之間為一段特殊的序列是4個半胱氨酸富集區(qū)，該4個半胱氨酸通過十六烷?；^定在細胞膜內(nèi)側(cè)一面；在羧基端的末尾肽段上有細菌性神經(jīng)毒素-肉毒桿菌毒素(BoNT/A和BoNT/E)的酶切降解位點。
在所述的該25KD突觸相關(guān)蛋白，其在SNARE循環(huán)中以兩個螺旋臂結(jié)構(gòu)與另外兩個SNARE蛋白VAMP2和Syntaxin1形成穩(wěn)定的三聚體——7S復合體，該7S復合體是促進運輸泡膜和靶膜靠攏的主要推動力。
本發(fā)明的SNAP-25的應用效果在于該SNAP-25能抑制胰臟β細胞延遲反應器型鉀離子通道的活性。SNAP-25被神經(jīng)毒素A特異性地降解，可以解除細胞自身或是外源表達的SNAP-25對鉀離子通道的抑制作用。延遲反應器型鉀離子通道是神經(jīng)和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞膜表面電流重要的調(diào)節(jié)蛋白。該離子通道的調(diào)節(jié)直接影響鈣離子通道開啟的時間和強度。在胰臟β細胞，SNAP-25通過抑制延遲反應器型鉀離子通道，從而開啟鈣離子通道，導致β細胞分泌胰島素。由于對血糖敏感的胰島素分泌在β細胞是由延遲反應器型鉀離子通道調(diào)控的，因而SNAP-25這一抑制鉀通道，開啟鈣通道，從而促進胰島素分泌的作用，具有將SNAP-25開發(fā)成為新的促進胰島素分泌的治療糖尿病藥物的前景。
附圖及其實施例

圖1為鱸魚SNAP-25蛋白基因結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為25KD突觸相關(guān)蛋白的基因序列圖(SEQ NO.1所示核苷酸序列圖)。
圖3為25KD突觸相關(guān)蛋白的氨基酸序列圖(SEQ NO.2所示氨基酸序列圖)。
圖4為HIT細胞的全細胞鉀離子通道電流圖。
圖5為HIT細胞電壓電流曲線圖。
本發(fā)明的保護范圍不僅局限于以下實施例中。參見圖1——5，本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下本發(fā)明是從鱸魚腦組織得到總RNA，通過RT-PCR得到cDNA鏈。設計引物得到部分序列。重新設計引物進行RACE，克隆得到25kD突觸相關(guān)蛋白基因。它是615bp的DNA，編碼一個由204個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。通過分子生物學方法可以獲得含有該基因的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌或者真核細胞系，表達具有生物學活性的該基因。
(一)鱸魚總RNA的提取取鱸魚腦組織100mg，加入液氮研磨成細粉狀，再加入1ml TRIZOL試劑，置室溫下勻化5分鐘后，加入200μl氯仿劇烈振蕩15秒，室溫下溫育3分鐘。4℃下以12,600rpm轉(zhuǎn)速離心15分鐘。獲取界面上層液體加入250μl高濃度鹽溶液(0.8M乙酸鈉和1.2M氯化鈉)和250μl異丙醇，混勻后于室溫下沉淀10分鐘，再在4℃以12,600rpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘。移去上清后用1ml 70％乙醇漂洗沉淀和離心。以20μlDEPC處理過的雙蒸水(無RNase)55℃溶解RNA沉淀10分鐘?？俁NA溶液于紫外分光光度計測定A260nm/280nm波長的紫外吸收值，確定提取RNA的濃度及純度。
(二)逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈取2.0ug總RNA，加入1μl 50pM的隨機引物，以雙蒸水(無RNase)稀釋，70℃ 5分鐘破壞RNA二級結(jié)構(gòu)后置冰上驟冷。依次加入5μlM-MLV5×轉(zhuǎn)錄緩沖液，1.3μl 10mMdNTP，24U rRNA酶抑制劑和200U M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。于37℃反應1小時后在94℃終止反應，反應體系稀釋后于4℃保藏。
(三)PCR擴增部分cDNA片段建立標準的PCR反應體系，引物按SNAP-25保守序列設計，正反向引物均為19bp。Mg2+濃度控制在最適值2.0mM。熱啟動后執(zhí)行以下程序94℃解鏈5分鐘；之后進行30個熱循環(huán)，包括94℃變性30秒，52.1℃退火30秒，72℃延伸40秒；最后在72℃延伸7分鐘。所得PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體(購自TaKaRa公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α(購自Clonetech公司)，提取整合質(zhì)粒pMD18-JSPS25后測序。
(四)5`RACE擴增基因5`末端序列設計反向引物設計合成19bp的基因特異性反向引物，將一致序列(ConsensusSequence)和已克隆出的SNAP-25片段的5`端鏈接，再鏈接上引物adaptor-d(T)17的序列為正向PCR引物38bp。重新進行cDNA反鏈的合成，逆轉(zhuǎn)錄反應與前大致相同。延伸溫度升高到42℃。反應結(jié)束后取15μl逆轉(zhuǎn)錄溶液，加入10μl 10×雜交RNA降解緩沖液，稀釋至100μl后加入60U的RNase H，37℃降解20分鐘除去DNA-RNA雜合體中的RNA。再以乙醇-乙酸銨沉淀法回收純化cDNA鏈，溶于10μl滅菌雙蒸水中。20μl的加尾反應體系包括10μl純化的cDNA，1×TDT緩沖液，200μM的dATP(Promega)，以及15·U末端轉(zhuǎn)移酶。于37℃溫育1小時后在70℃保持10分鐘終止加尾反應。最后將含有加尾cDNA模板的體系稀釋后于4℃保存。
(五)以正鏈cDNA為模板的第一輪擴增反應首輪PCR擴增體系為10xPCR緩沖液5μl，MgCl2(25mM)4μl，dNTP(10mM)7.5μladaptor-d(T)17(10μM)1μl，adaptor(10μM)2.5μl，特異性引物(10μM)2.5μl，模板cDNA1μl，Taq+Pfu0.5μl。反應程序為80℃以上熱啟動加入聚合酶，94℃，5分鐘，50.2℃2分鐘，72℃40分鐘。循環(huán)94℃40秒，50.2℃1分鐘，72℃3分鐘共30次。72℃15分鐘后4C保存。
將首輪擴增產(chǎn)物稀釋20倍作為模板建立次輪PCR擴增體系表示如下，反應程序為80℃以上熱啟動加入聚合酶，94℃5分鐘后循環(huán)94℃，40秒50.6℃1分鐘，72℃3分鐘共30次，72℃15分鐘后終止反應，產(chǎn)物經(jīng)電泳后染色分析。根據(jù)5`RACE原理及擴增條大小分析找出最為可能的擴增結(jié)果。將5`RACE克隆結(jié)果與先前進行的RT-PCR克隆結(jié)果中重合序列加以拼接，得到鱸魚SNAP-25基因的全長編碼序列。
(六)構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化鱸魚的SNAP-25基因可以克隆到表達質(zhì)粒如pcDNA3(Invitrogen)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α。對陽性菌落用堿裂解法提取重組質(zhì)粒pcDNA3-S25，用限制型內(nèi)切酶BamH1和Xba1(購自NBS)水解重組質(zhì)粒，根據(jù)電泳結(jié)果證實有插入片斷，其大小約為615bp。此重組質(zhì)?？梢岳弥|(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)在哺乳動物細胞系如胰島素分泌細胞系HIT和魚類胰臟原代細胞中表達。
(七)25KD突觸相關(guān)蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測本發(fā)明的25KD突觸相關(guān)蛋白的二級結(jié)構(gòu)是依據(jù)相關(guān)軟件和因特網(wǎng)預測方法所得的結(jié)果。即，本發(fā)明應用DNASIS軟件，DNA Star軟件，Omiga軟件，對25KD突觸相關(guān)蛋白的α-螺旋(α-helix)，β-折疊(β-sheet)，β-轉(zhuǎn)角(β-turn)等主要二級結(jié)構(gòu)進行預測，同時依靠因特網(wǎng)法國國家科研中心的獨特預測方法(GOR、Levin同源預測方法、雙重預測方法、PHD方法以及SOPMA方法)進行預測，并將結(jié)果匯集整理成一個“一致預測結(jié)果”，對該蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預測。所測得結(jié)果25KD突觸相關(guān)蛋白的氨基酸序列的肽鏈分為四部分在靠氨基端有兩個螺旋卷曲A和B，均含約40個氨基酸；羧基末端也有一相似螺旋卷曲C，該螺旋卷曲B和C之間是一段具疏水性無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)；在第80-95個氨基酸序列之間有一段特殊的序列是4個半胱氨酸富集區(qū)，該4個半胱氨酸通過十六烷酰化錨定在細胞膜內(nèi)側(cè)一面；在羧基端的末尾肽段上有細菌性神經(jīng)毒素-肉毒桿菌毒素(BoNT/A和BoNT/E)的酶切降解位點。
(八)25KD突觸相關(guān)蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測本發(fā)明還提交鱸魚SANP-25氨基酸序列至ExPASy服務器，依靠SWISS-MODEL(Protein Modelling)工具將文件轉(zhuǎn)換為PBD格式。借助Vector NIT Insuite 9.0軟件中的3D Molecular Viewer瀏覽器識別演示鱸魚SNAP-25蛋白肽鏈三維結(jié)構(gòu)，如25KD突觸相關(guān)蛋白在SNARE循環(huán)中以兩個螺旋臂結(jié)構(gòu)與另外兩個SNARE蛋白VAMP2和Syntaxin1形成穩(wěn)定的三聚體——7S復合體。
(九)SNAP-25抑制延遲反應器型鉀離子通道的活性實驗本實驗應用EPC-10型膜片鉗放大儀以及TAC和IGOR Pro4.0通道分析軟件記錄全細胞通道電流。膜片鉗電極外液組成為(mM)140NaCl、4KCl、1MgCl2、2CaCl2、10HEPES、pH7.4；內(nèi)液組成為140KCl、1MgCl2、10HEPES、4Na2ATP、0.3EGTA以及8nMCaCl2，pH7.2。用同時轉(zhuǎn)化SNAP-25和綠色熒光蛋白的HIT細胞作為實驗材料，在熒光顯微鏡下以觀察到熒光細胞確認外源基因轉(zhuǎn)化成功。未轉(zhuǎn)化外源基因的HIT細胞作為對照。實驗細胞浸潤在電極內(nèi)液中，玻璃電極充斥電極外液，利用微電極操作儀將電極與實驗細胞貼附。每3min以10mV間隔施加30S電脈沖由-70mV靜息膜電位，去極化升至+50mV，并記錄全細胞電流，至少重復記錄5個細胞。實驗數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學處理以電壓為橫坐標，電流為縱坐標繪制電流電壓曲線。延遲反應器型鉀離子通道的確認是通過施加通道特異性阻斷劑iberiotoxin(0.1mM)或tetraethylammonium(20mM)而實現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化SNAP-25的HIT細胞，其延遲反應器型鉀離子通道的活性受到抑制。
本領域的普通技術(shù)人員都會理解，在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)，對于上述實施例進行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種分離的25KD突觸相關(guān)蛋白(SNAP-25)的基因，其特征在于該基因來源于硬骨魚鱸魚(Lateolabrax japonicus)，該25KD突觸相關(guān)蛋白的基因序列與SEQ NO.1所示核苷酸序列具有至少80--90％的同源性，該基因含615個堿基對的DNA。
2.一種分離的25KD突觸相關(guān)蛋白(SNAP-25)，其特征在于該25KD突觸相關(guān)蛋白來源于硬骨魚鱸魚(Lateolabrax japonicus)，該25KD突觸相關(guān)蛋白的氨基酸序列與SEQ NO.2所示氨基酸序列具有至少80--90％的同源性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述分離的25KD突觸相關(guān)蛋白(SNAP-25)，其特征在于所述的該25KD突觸相關(guān)蛋白的編碼是一個由204個氨基酸組成的活性蛋白質(zhì)；其具有抑制HIT細胞延遲反應器型鉀離子通道(delayed rectifier K+channel，KDR)生物學活性的功能。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述分離的25KD突觸相關(guān)蛋白(SNAP-25)，其特征在于所述的該25KD突觸相關(guān)蛋白的氨基酸序列的肽鏈分為四部分在靠氨基端有兩個螺旋卷曲A和B，均含約40個氨基酸；羧基末端也有一相似螺旋卷曲C，該螺旋卷曲B和C之間是一段具疏水性無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)；其與B螺旋之間有一特殊的肽段，在第80-95個氨基酸序列之間有一段特殊的序列是4個半胱氨酸富集區(qū)，該4個半胱氨酸通過十六烷?；^定在細胞膜內(nèi)側(cè)一面；在羧基端的末尾肽段上有細菌性神經(jīng)毒素—肉毒桿菌毒素(BoNT/A和BoNT/E)的酶切降解位點。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述分離的25KD突觸相關(guān)蛋白(SNAP-25)，其特征在于在所述的該25KD突觸相關(guān)蛋白，其在SNARE循環(huán)中以兩個螺旋臂結(jié)構(gòu)與另外兩個SNARE蛋白VAMP2和Syntaxinl形成穩(wěn)定的三聚體——7S復合體，該7S復合體是促進運輸泡膜和靶膜靠攏的主要推動力。
全文摘要
本發(fā)明克隆了一種分離的25KD突觸相關(guān)蛋白(SNAP－25)基因。該25KD突觸相關(guān)蛋白來源于硬骨魚鱸魚(Lateolabrax japonicus)，該25KD突觸相關(guān)蛋白(SNAP－25)的基因，它具有SEQ NO.1所示核苷酸序列，該基因含615個堿基對的DNA。該25KD突觸相關(guān)蛋白的氨基酸序列與SEQ NO.2所示氨基酸序列具有至少80——90％的同源性。所述的該25KD突觸相關(guān)蛋白的編碼是一個由204個氨基酸組成的活性蛋白質(zhì)；其具有抑制HIT細胞延遲反應器型鉀離子通道(delayed rectifier K
文檔編號C07H21/04GK1763191SQ20041008369
公開日2006年4月26日 申請日期2004年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月18日
發(fā)明者黃曉航, 陳魁, 紀俊之, 海勃特-杰薩諾 申請人:國家海洋局第一海洋研究所