耐堿嗜鹽類型的灰綠曲霉菌株及其在環(huán)境治理中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物工程與【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種耐堿嗜鹽的曲霉菌株，該菌株已于2012年4月20日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏名稱為灰綠曲霉JL，保藏號碼為CGMCC?6025。該菌株具有在高鹽堿環(huán)境降解秸稈等生物物質(zhì)的特性，可用于鹽堿地改良與環(huán)境污染處理。
【專利說明】耐堿嗜鹽類型的灰綠曲霉菌株及其在環(huán)境治理中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于微生物工程與【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及一種具有耐堿嗜鹽特性的灰綠曲霉菌株，及其在鹽堿地改良與環(huán)境治理中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】:
[0002]微生物是自然界生存環(huán)境極廣的生物，無論原核或真核生物，無論環(huán)境條件怎樣惡劣，地球上幾乎無處不能找到它們的存在。嗜鹽或(和)耐堿真菌是從高鹽、高堿或高鹽堿共存環(huán)境中分離的微生物資源，由于其具有重要研究、應(yīng)用與開發(fā)價(jià)值歷來備受關(guān)注。目前，隨著嗜鹽耐堿菌的微生物資源發(fā)掘，人們正開始將這些嗜鹽耐堿菌應(yīng)用于高鹽堿環(huán)境中的各種危害消除和污染治理，如鹽堿地的修復(fù)改造、淤泥污水的凈化處理，以及農(nóng)業(yè)廢棄物循環(huán)利用等。
[0003]長期以來，科學(xué)界普遍認(rèn)為只有原核生物才可存活在極端環(huán)境，但自2000年，Gunde-Cimerman等(2000)從自然鹽堿土中分離出真菌后,人們才開始把目標(biāo)集中到在高鹽環(huán)境中發(fā)掘新的耐鹽真菌資源(Casamayor et al.2002;Petrovi et al.2002;Zalaret al.2005)ο Debaryomyces hansenii, Hortaea werneckii 和 Wallemia ichthyophaga是從自然高鹽環(huán)境中分離的耐鹽真菌，研究發(fā)現(xiàn)它們生長的鹽濃度上限高達(dá)5.2mol/L(Norkrans.1966; Prista et al.2005 ； Plemenitas et al.2008 )。隨著大量耐鹽真菌的發(fā)掘，人們發(fā)現(xiàn)有些曲霉屬(Aspergillus)真菌在其有性態(tài)(Eurotium)極具耐鹽性，如Nevo等(2003)從死海及沿岸分離得到3種耐鹽曲霉Aspergillus versicolor>Aspergillus niger 和 Eurotium herbariorum。后來，Butinar 等(2005)也篩選至Ij了系列的耐鹽曲霉:Eurotiumamstelodam1、Eurotiumrepens> Eurotiumherbariorum、Eurotiumrubrum> Eurotium chevalieri 和一個(gè)新種 Eurotium halotolerans,其中E.amstelodami和E.halotolerans可在含27.5%NaCl的培養(yǎng)基條件下生長。但遺憾的是，目前發(fā)現(xiàn)的耐堿真菌，特別是嗜鹽耐堿的真菌換相對較少。在許多鹽堿環(huán)境中，由于鹽堿共存，這些單純以嗜鹽或耐鹽為 優(yōu)勢的真菌其應(yīng)用范圍無疑受到限制。
[0004]土壤微生物及其分泌的酶類作為土壤的活性單位，能夠直接參與并促進(jìn)土壤惰性有機(jī)成分的生理生化反應(yīng)，它們既是土壤生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化的前提，也是土壤生態(tài)系統(tǒng)發(fā)育成熟度以及系統(tǒng)資源能否高效持續(xù)利用的重要標(biāo)志。鹽堿地特別是重度鹽堿土壤中的微生物群落極其簡單，而且處于非活化狀態(tài)，盡管在秸桿還田過程中，加入一定的菌制劑可以加速秸桿的降解，增加了土壤中有機(jī)質(zhì)含量，明顯改善土壤理化性狀，對維持農(nóng)田良好的生態(tài)環(huán)境體系和作物營養(yǎng)體系，減少環(huán)境污染，增產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等方面效果明顯，但本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)這些菌劑在正常土壤中可以發(fā)揮很好的作用，而在鹽堿土壤中，由于高濃度的鹽和高PH值的環(huán)境，這些菌株很難發(fā)揮應(yīng)有的作用。因此，篩選抗(耐)鹽堿發(fā)酵微生物是決定鹽堿地秸桿高效利用的關(guān)鍵所在。

【發(fā)明內(nèi)容】
:[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種耐堿嗜鹽類型的灰綠曲霉(Aspergi Ilusglaucus)菌株幾，保藏號碼為CGMCC6025。
[0006]本發(fā)明提供的耐堿嗜鹽類型灰綠曲霉菌株于2012年4月20日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號；保藏名稱為灰綠曲霉JL,分類命名為灰綠曲霉(Aspergillus glaucus);保藏編號為CGMCCN0.6025。
[0007]本發(fā)明的耐堿嗜鹽類型的灰綠曲霉菌株具有嗜鹽特性:菌株適宜生長在Na鹽環(huán)境，最適生長鈉鹽濃度為10-20% (克/升)，高鹽環(huán)境條件下菌株可以長期存活。
[0008]本發(fā)明的耐堿嗜鹽類型的灰綠曲霉菌株還同時(shí)具有耐堿特性:在堿性(pH=7_12)培養(yǎng)基條件下，菌株能夠通過分泌檸檬酸、蘋果酸等有機(jī)酸，調(diào)節(jié)PH值至適宜的生長中性條件。
[0009]本發(fā)明的耐堿嗜鹽類型的灰綠曲霉菌株在鹽堿條件下通過分泌水解酶，高效降解有機(jī)物質(zhì)。
[0010]本發(fā)明同時(shí)提供了一種耐堿嗜鹽類型的灰綠曲霉菌株可用于環(huán)境污染處理。
[0011]本發(fā)明還同時(shí)提供了一種耐堿嗜鹽類型的灰綠曲霉菌株可用于鹽堿地改造。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0012]圖1、曲霉菌落形態(tài)特征
[0013]圖2、分生孢子梗及分生孢子
[0014]圖3、胞外纖維素酶和葡聚糖酶活性檢測
[0015]圖4、堿性環(huán)境菌體分泌的有機(jī)酸GC-MS檢測
[0016]以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1、嗜鹽耐堿菌株的分離與鑒定
[0018]菌株的分離:分離菌株的土壤樣品來自吉林省鎮(zhèn)賚縣。選取該地荒蕪多年且高度鹽堿化的地塊，取土壤表層2cm以下土壤，裝入已滅菌處理的玻璃瓶帶回實(shí)驗(yàn)室備用。采用稀釋涂布法，將稀釋后澄清的土壤上清液涂布于添加NaCl至250.0g/L的PDA培養(yǎng)基上(PH=IO)培養(yǎng)4天，經(jīng)過3輪篩選分離到一株嗜鹽耐堿的真菌菌株(本發(fā)明的耐堿嗜鹽類型的灰綠曲霉菌株編號為CGMCC6025)。
[0019]菌株形態(tài)鑒定:將篩選得到的嗜鹽耐堿菌株接種到查氏瓊脂培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)一周，觀察菌落形態(tài)并鏡檢其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和菌絲形態(tài)。25°C在查氏瓊脂平板上培養(yǎng)I周后，菌體發(fā)育成墨綠色或灰綠色菌落，圓形菌落半徑約3.5-4cm，氣生菌絲發(fā)達(dá)，中心平展，邊緣擴(kuò)展菌絲白色，生長速度較快，老熟菌體顏色變深，期間，部分特異化為分生孢子梗，集結(jié)成肉眼可見的黃色顆粒，不均勻分布在菌落表層(圖1);用挑針取菌落表層菌絲，制成玻片，進(jìn)行顯微觀察:菌絲直立，表面光滑，分生孢子球形單胞，著生在產(chǎn)孢梗頂部，極易脫落，脫落后，產(chǎn)孢梗頂部呈半球形光禿(圖2)。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為灰綠曲霉。
[0020]實(shí)施例2、菌株灰綠曲霉JL嗜鹽、耐鹽性及最適鹽濃度鑒定
[0021]配制梯度NaCl含量的PDA培養(yǎng)基(pH7.0)，其鹽濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))由1%增加到31%(飽和濃度)，每級增加2%，以不添加NaCl的PDA為對照。將等量的菌株接種于培養(yǎng)基中心位置，25°C，培養(yǎng)I周。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株在不含NaCl的培養(yǎng)基上沒有生長(生長極為緩慢)，1-5%濃度下生長相對較緩慢；5%-19%濃度下菌株生長加快，但在9-19%范圍內(nèi)增速變緩，菌落大小接近；21-27%濃度下菌株生長急劇變慢，29-31%濃度下菌體幾乎沒有生長，因此，該菌株屬于嗜鹽、且抗高鹽特性的真菌。
[0022]為了確定菌株生長的最適鹽濃度，用上述系列鹽梯度ro(馬鈴薯液體培養(yǎng)基，不加瓊脂)(pH=7.0)培養(yǎng)菌株，25°C搖培一周后，離心收集菌絲，用去離子水反復(fù)沖洗4次，105°C下烘干，測定菌絲干重，比較發(fā)現(xiàn)菌株在9-15%濃度下的干重最大，其最適生長的鹽濃度為9-15%。
[0023]實(shí)施例3、菌株灰綠曲霉JL生長pH測定
[0024]配制pHl.0-13.0的酸堿梯度PDA培養(yǎng)基，添加NaCl至終濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))9%，接菌，25°C培養(yǎng)I周后記錄菌株的生長情況。研究發(fā)現(xiàn)，菌株在PH3-11都可生長，但以pH5-9范圍生長較快，PH10-12可以生長，但生長速度明顯變慢，因此，該菌株屬于耐鹽真菌。
[0025]為了確定該菌株生長的最適pH范圍，利用上述pH梯度進(jìn)一步用H)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，25°C搖培I周后，離心收集菌絲，用去離子水反復(fù)沖洗4次，105°C下烘干，比較菌絲干重。菌株在PH6-8范圍內(nèi)，菌體干重最大，因此，該菌株的最適pH范圍為6-8。
[0026]實(shí)施例4、菌株胞外水解酶的分析域鑒定
[0027]配制以5%粉碎的秸桿(水稻、玉米或高粱)為主要碳源、以80%蘇打鹽堿土壤(取自吉林省鎮(zhèn)賚縣)為基質(zhì)、以10%粉煤灰(粗細(xì)比=1:5)為分散透氣介質(zhì)的固態(tài)培養(yǎng)基，以5%PD培養(yǎng)基為菌體擴(kuò)繁營養(yǎng)的混合物，`滅菌處理后調(diào)節(jié)PH值至7.0，接種曲霉菌株，在簡易發(fā)酵系統(tǒng)中25°C發(fā)酵3-4周。觀察秸桿發(fā)酵效果，與未加該菌株的秸桿相比，菌株灰綠曲霉幾明顯加快了秸桿的降解。然后用無菌水浸潤發(fā)酵物2小時(shí)，離心保留上清，即為菌株胞外酶溶液，并用90% (飽和濃度)硫酸銨沉淀上清液中蛋白，裝入透析袋透析過夜，用聚乙二醇濃縮，最后用DNS法測定纖維素酶、葡聚糖酶等酶活性。結(jié)果表明，灰綠曲霉幾發(fā)酵液顯著降解纖維素和葡聚糖(圖3)，因此，該菌株可以用于環(huán)境中秸桿的降解，從而對環(huán)境污染進(jìn)行處理。
[0028]實(shí)施例5、菌株耐堿過程分泌的主要有機(jī)酸
[0029]配制pH12.0的酸堿梯度PDA培養(yǎng)基，添加NaCl至終濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))9%，接菌，25°C培養(yǎng)30天后進(jìn)行抽濾將菌體和發(fā)酵液分開。將菌體烘干，粉碎后用甲醇提取，提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40°C蒸干，蒸干后與各自的發(fā)酵液合并，再用石油醚，乙酸乙酯分別萃取，將發(fā)酵液中的物質(zhì)按照極性不同分為石油醚萃取部分、乙酸乙酯萃取部分和萃取后的發(fā)酵液部分。用GC-MS進(jìn)行鑒別對其差異物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，鑒定結(jié)果表明，灰綠曲霉幾能夠分泌蘋果酸(見圖4)，因此，該菌株可以用于中和鹽堿地中的堿，從而對鹽堿地進(jìn)行改造。
【權(quán)利要求】
1.一種灰綠曲霉菌株，其特征在于該菌株保藏名稱為灰綠曲霉幾，保藏號碼為CGMCC6025。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于該菌株具有嗜鹽特性:菌株適宜生長在Na鹽環(huán)境，最適生長鈉鹽濃度為10-20% (克/毫升)，高鹽環(huán)境條件下菌株可以長期存活。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于該菌株具有耐堿特性:在堿性(pH=7?12)培養(yǎng)基條件下，菌株能夠通過分泌有機(jī)酸，調(diào)節(jié)pH值至適宜的生長中性條件。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述菌株，其特征在于該菌株具有通過分泌系列水解酶對有機(jī)質(zhì)降解的特性。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-3所述的任意一條特性的應(yīng)用，其特征在于該菌株可用于鹽堿地改造。
6.根據(jù)權(quán)利要求2和4所述的任意一條特性的應(yīng)用，其特征在于該菌株可用于環(huán)境污染處 理。
【文檔編號】C09K109/00GK103436450SQ201310162347
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月6日
【發(fā)明者】魏毅, 劉曉丹, 賈保磊, 張世宏, 劉金亮, 高文彬 申請人:吉林大學(xué)