專利名稱：一種9-蒽酮螺環(huán)內(nèi)酯類化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用灰綠曲霉HBl-19 (Aspergillus glaucus HB1-19)(保藏編號是 CCTCC M206022)生產(chǎn)9-蒽酮螺環(huán)內(nèi)酯類化合物的方法；本發(fā)明還涉及該類化合物在制備 細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。 本發(fā)明人曾經(jīng)從灰綠曲霉HBl-19 (Aspergillus glaucus HB1-19)(保藏編號是 CCTCC M206022)液體發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)具有明顯抗腫瘤活性的9-蒽酮內(nèi)酯類化合物灰綠霉 素A，在進一步對灰綠曲霉HBl-19 (Aspergillus glaucus HB1-19)發(fā)酵條件進行優(yōu)化的過 程中，獲得具有新穎螺環(huán)結(jié)構(gòu)的9-蒽酮螺環(huán)內(nèi)酯類化合物。研究發(fā)現(xiàn)所示9-蒽酮螺環(huán)內(nèi) 酯類化合物具有細胞增殖抑制活性，目前尚未見對該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及細胞增殖抑制活 性的報道，因此市場上也尚未見有與此有關(guān)的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種結(jié)構(gòu)獨特的具有抑制腫瘤細胞增殖作用，具有抗腫瘤活性的 新化合物。其結(jié)構(gòu)式 其結(jié)構(gòu)特征是含螺環(huán)和不飽和內(nèi)酯環(huán)的9-蒽酮螺環(huán)內(nèi)酯，其中R-R5為氫、氨基、 羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。本發(fā)明優(yōu)選的式I化合物其中R_R4為羥基、R5為氫。 本發(fā)明的式I化合物可通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)來獲取含有9-蒽酮螺環(huán)內(nèi)酯類化合 物的發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中采用硅膠柱層析、制備HPLC等方法分離純化得到。
本發(fā)明的下述實施例中列舉了利用灰綠曲霉HBl-19(Aspergillus glaucus HBl-19)(保藏編號是CCTCC M 206022)制備本發(fā)明式I化合物的實例。
具體實施例方式
在如下的實施例中所指的化合物I的化學(xué)結(jié)構(gòu)
背景技術(shù)：
3<formula>formula see original document page 4</formula>
化合物I 實施例1化合物I的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制
l發(fā)酵生產(chǎn) 生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取灰綠曲霉 HBl-19 (Aspergillusgla腦s HB1-19)(保藏編號是:CCTCC M 206022)適量，接種到固體斜 面培養(yǎng)基[將普通的PDA培養(yǎng)基中的淡水換成人工海水，將土豆汁換成50g/L甘薯粉，其他 成份不變]上，在28攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。 用無菌水從灰綠曲霉孢子斜面上洗下孢子，制成孢子懸浮液，用血球計數(shù)板計數(shù) 后，每50ml種子培養(yǎng)基[人工海水、麥芽糖2%、甘露醇2%、葡萄糖1%、味精1%、酵母膏 0.6%、MgS04 0 . 03%、KH2P04 0 . 05%]接種孢子數(shù)為10X 107個，28°C ， 175rpm，搖床培養(yǎng) 約40h，作為發(fā)酵種子。將發(fā)酵種子按14% 16%接種量接入裝有50ml培養(yǎng)基[人工海 水、可溶性淀粉4% 、蔗糖4% 、麥芽糖3 % 、蛋白胨0. 2 % 、酵母膏0.1%、黃豆粉0.05%、味 精0.2X、MgS04 0 . 03%、KH2P04 0 . 05%?？扇苄缘矸巯扔梅兴笤偌尤肱囵B(yǎng)基中]的 250ml發(fā)酵搖瓶中，28°C ， 175rpm，搖床培養(yǎng)7d左右，獲得菌絲體和發(fā)酵液。
2浸膏的獲得 用棉布將菌絲體和發(fā)酵液分離。將菌絲體用丙酮浸提三次，減壓濃縮至不含丙酮， 所得水層用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得粗浸膏。發(fā)酵液減 壓濃縮為四分之一體積后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌絲體和發(fā)酵液的浸膏，共41. 0克。
3化合物的分離精制 浸膏(41.0克)用氯仿-甲醇混合溶劑溶解后，加300克200-300目硅膠(青島海 洋化工集團公司產(chǎn)品)拌樣，減壓除去溶劑后，用硅膠柱層析，以石油醚、石油醚-氯仿，氯 仿_甲醇為溶劑進行梯度洗脫，分為7個流份。Fr-6 (12. 0g，氯仿-甲醇10 : 1洗脫物)， 先后以氯仿-甲醇(l : 1)為溶劑進行LH20柱層析，再經(jīng)加壓硅膠柱層析以石油醚丙酮 (5 : 5)為溶劑，最后經(jīng)半制備反相高效液相色譜(甲醇3。；TFA水溶液二 70 : 30)得 化合物I (200mg)。 化合物I紅色無定形固體，分子式C29H1601Q， HR-ESI-MS m/z :523. 0684[M_H]—，計 算值523. 0665. UVA隨nm(log e ) in MeOH :210(4. 40) ， 243 (4. 46) ， 329 (4. 08) ，485(3. 85)， 517(3.88)。 IR v隨cm—、KBr) :3193， 2925， 1742， 1644， 1604， 1540， 1472， 1397， 1331， 1260， 1191， 1050. ^和"C-NMR數(shù)據(jù)見表1。表1化合物I的^和13C NMR數(shù)據(jù)(600和150MHz ， inDMS0_d6)aNo.<5H (JinHz)HMBC (H—C)
1154.1 s
2111.2s
145.5 s
4128.6 s
5124.0 s
6161.8 s
76.61 s107.1 d5, 6, 8, 9
8164.8 s
9106.6 s
10187.0 s
11107.8 s
12159.2 s
137.44 s126.9 d11, 12, 15, 17
14136.9 s
15147.3 s
16113.3 s
172.41 s15.8 q13, 14， 15
18189.0 s
1967.8 s
20199.3 s
21106.4 s
22164,4 s
236.20 s101.1 d21,22,24, 25
24166.2 s
256.35 d, 2.2107.2 d21,23,24， 27
26141.8 s
276.65 s124.1 d19,21,26, 29
28140.2 s
291.56 s19.1 q19, 27, 28
OH隱612.03 s
OH-812.74 s7， 8,9
OH-1212.18 s11, 12, 13
OH-2212.07 s21,22, 23
OH-2410.98 s a)本表信號歸屬基于DEPT、 HMQC及HMBC圖譜解析結(jié)果。碳信號的多重度利用 DEPT方法確定并分別用s (單重峰)、d( 二重峰)、t (三重峰)和q(四重峰)表示。
b)此欄中的數(shù)字和代號分別代表在HMBC譜中與相應(yīng)行中的^給出偶合相關(guān)信號 的"C核。
OH O OH 穩(wěn)定同位素標(biāo)記試驗結(jié)果(將[1-13C]_乙酸鈉，[2-13C]_乙酸鈉和[1，2-13C]_乙酸鈉分別添加到發(fā)酵培養(yǎng)
基中，從發(fā)酵產(chǎn)物中分離提取同位素標(biāo)記的化合物I進行13C NMR測試，比較不同碳的豐度
和偶合常數(shù)來判斷化合物碳骨架的生合成來源)
實施例2體外抗腫瘤活性的測試
細胞增殖抑制活性測試
1實驗樣品及實驗方法 被測樣品溶液的配制測試樣品為上述實施例1中分離精制的化合物I純品。精密 稱取適量樣品，用甲醇配制成所需濃度的溶液，供測活性。 細胞系及細胞的繼代培養(yǎng)采用人肺癌A549細胞、人肝癌BEL-7402細胞、人白血病 HL60細胞及小鼠白血病P388細胞等癌細胞系。各種細胞均用含10% FBS的RPMI-1640培 養(yǎng)基，在32t: (P388細胞)或在37t: (A549、HL60及BEL-7402細胞)于通入5%二氧化碳
的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。 細胞增殖抑制活性測試方法 麗絲胺羅丹明B(SRB)法取對數(shù)生長期的人肺癌A549細胞、人肝癌BEL-7402細 胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升2 X 105個細胞的細胞懸液，按每孔200 微升接種于96孔板中，每孔加入2微升不同濃度的樣品或空白溶液，37t:下培養(yǎng)24小時。 取藥物作用下培養(yǎng)后的細胞，首先在光學(xué)顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態(tài)學(xué)變化，判斷 有無細胞周期抑制，細胞凋亡或細胞壞死的形態(tài)學(xué)特征，繼而在4°C 、3000轉(zhuǎn)/分鐘離心3 分鐘，吸去上清。每孔細胞中加入20%三氯醋酸50微升，置于4t:固定1小時，用水沖洗5 次并空氣干燥。每孔加入0. 4% SRB的醋酸溶液50微升并在室溫靜置30分鐘。用1%醋 酸水清洗4次，除去未結(jié)合的游離SRB染料。每孔加入150微升Tris緩沖液(10mmol/L，pH 10.5)溶解蛋白結(jié)合染料并利用MD公司產(chǎn)SPECTRA MAX Plus型酶標(biāo)儀測定每孔在520nm 處的光密度(0D)值。在同一塊96孔板中樣品的每個濃度均設(shè)置三孔，另設(shè)三孔空白對照 和無細胞調(diào)零孔(如果藥物有顏色要做相應(yīng)藥物濃度無細胞調(diào)零)。各孔OD值先做相應(yīng)無 細胞調(diào)零，再取三孔平均0D值按IR% = (0D站對照-0D樣品)/0D空自對照X100X式計算每個濃度 下的細胞增殖抑制率(IR% )。 四氮唑鹽(MTT)法取對數(shù)生長期的人白血病HL60細胞和小鼠白血病P388細胞， 將細胞密度調(diào)至每毫升2 X 105個細胞，按每孔200微升接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，于37°C 通入5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時。每孔加樣品液或空白液各2微升，培養(yǎng)24小時后，每 孔加MTT液(MTT的每毫升5毫克生理鹽水溶液)10微升，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，37°C 、2000轉(zhuǎn)/ 分鐘離心8分鐘，吸去上清。每孔加入匿SO各100微升，在微量振蕩器上振蕩15分鐘，至 結(jié)晶完全溶解后，利用MD公司產(chǎn)SPECTRA MAX Plus型酶標(biāo)儀測定每孔在570nm處的吸光 值(OD值)。在同一塊96孔板中樣品的每個濃度均設(shè)置三孔，另設(shè)三孔空白對照和無細胞 調(diào)零孔(如果藥物有顏色要做相應(yīng)藥物濃度無細胞調(diào)零)。各孔OD值先做相應(yīng)無細胞調(diào) 零，再取三孔平均OD值按IR% = (0D空自對照-0D縣)/0D空自對照X100X式計算每個濃度下的細 胞增殖抑制率(IR% )。
2.實驗結(jié)果
細胞增殖抑制活性測試結(jié)果 在SRB法或MTT法測試中，不同濃度的化合物I對人肺癌A549細胞、人肝癌 BEL-7402細胞、人白血病HL60細胞和小鼠白血病P388細胞的增殖抑制結(jié)果見表2。
表2不同濃度的化合物I對癌細胞增殖的抑制率(％ )
細胞株化合物I
lxlO^MIxl0-5Mlxl (T6MIxl0-7Mlxl(T8M
A54936.0%0.9%0.5%0.9%0.9%
BEL-74023.0%0%0%0%0%
HL6075.4%0%0%3.5%7.4%
P38867.3%11.2%5.4%1.5%9.0%
3結(jié)論
化合物I具有較明顯的腫瘤細胞增殖抑制作用，可作為細胞增殖抑制劑或抗腫瘤
劑用于抗腫瘤的研究c
權(quán)利要求
式I化合物式I其中R-R4為羥基、R5為氫。F2008101806170C0000011.tif
2. 權(quán)利要求1所述式I化合物的制備方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)灰綠曲霉 HBl-19 (Aspergillus glaucus HBl-19)(中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號是CCTCC M 206022)，獲取含有上述式I的發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分離純化出式I化合物。
3. 權(quán)利要求2所述的制備方法，其中將所述發(fā)酵物經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚、石油 醚-氯仿，氯仿_甲醇為溶劑進行梯度洗脫，分為7個流份，其中第6個洗脫流份氯仿_甲 醇(10 : 1)洗脫部分，再經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，S印hadex LH20凝膠柱層析和半制備反相高 效液相色譜分離純化得式I化合物。
4. 權(quán)利要求1所述的式I化合物在制備細胞增殖抑制劑中的用途。
5. 權(quán)利要求1所述的式I化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種9-蒽酮螺環(huán)內(nèi)酯類化合物的制備方法和用途。本發(fā)明用采自海洋樣品中的灰綠曲霉HB1-19(Aspergillus glaucus HB1-19)生產(chǎn)出結(jié)構(gòu)新穎的9-蒽酮螺環(huán)內(nèi)酯類化合物。經(jīng)實驗證實，該類化合物可作為細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑。
文檔編號C12R1/66GK101735193SQ20081018061
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月18日
發(fā)明者朱天驕, 杜林 , 顧謙群 申請人:中國海洋大學(xué)