一種同時(shí)測(cè)定舒血寧中黃酮類(lèi)化合物和萜內(nèi)酯類(lèi)化合物含量的檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及藥物檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種同時(shí)測(cè)定銀杏葉(或其提取物)或其制劑中黃酮類(lèi)化合物和萜內(nèi)酯類(lèi)化合物含量的高效液相色譜檢測(cè)方法。本發(fā)明建立了HPLC?DAD?ELSD法可同時(shí)對(duì)銀杏葉(或其提取物)及其制劑中8種黃酮類(lèi)化合物以及3種萜內(nèi)酯類(lèi)化合物進(jìn)行測(cè)定的方法，并對(duì)其測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了分析，為銀杏葉提取物及其制劑的質(zhì)量控制提供了新的分析方法并提供依據(jù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種同時(shí)測(cè)定舒血寧中黃酮類(lèi)化合物和萜內(nèi)酯類(lèi)化合物含量 的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及藥物檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種同時(shí)測(cè)定舒血寧注射液 中黃酮類(lèi)化合物和萜內(nèi)酯類(lèi)化合物含量的高效液相色譜檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 舒血寧注射液在臨床用于心血管病及周?chē)h(huán)障礙性疾病的治療，是通過(guò)多靶點(diǎn) 多環(huán)節(jié)起作用的。它可以降低高同型半胱氨酸(Hey)帶來(lái)的心血管風(fēng)險(xiǎn);降低與動(dòng)脈粥樣硬 化發(fā)生、演變和發(fā)展有關(guān)的促炎因子血漿C反應(yīng)蛋白（CRP);降低具有強(qiáng)烈的收縮血管和促 進(jìn)血小板聚集的血栓素B2(TXB2);降低對(duì)細(xì)胞及細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能可造成種種損傷的血 清過(guò)氧化脂質(zhì)（L0P);降低廣泛存在于各種組織和細(xì)胞中內(nèi)源性縮血管活性物質(zhì)內(nèi)皮素 (ET);降低作為血小板和內(nèi)皮細(xì)胞活化程度的血液測(cè)定指標(biāo)P選擇素(P-s);降低參與動(dòng)脈 粥樣硬化的初始、發(fā)展、斑塊糜爛、破裂及血栓并發(fā)癥全過(guò)程的可溶性血管外周血粒細(xì)胞表 面粘附分子(CD 1 la);降低應(yīng)激狀態(tài)下增高的神經(jīng)內(nèi)分泌激素(ACTH、ET、C0RT、TXB2、PGI2)， 避免血管損傷加重；降低增高的血液流變學(xué)指標(biāo)；降低病理?yè)p傷時(shí)升高的血漿腦鈉肽 (BNP);降低促使神經(jīng)細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，在細(xì)胞凋亡與細(xì)胞生存調(diào)節(jié)中發(fā)揮 極其重要作用的糖原合成酶激酶邪;阻止白細(xì)胞的活化，抑制白細(xì)胞變形性的下降及黏附 性的增加而減輕腦缺血后腦損傷;降低影響細(xì)胞順利吸收營(yíng)養(yǎng)、氧氣、削弱細(xì)胞正常功能的 蘊(yùn)粵;降低引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性的丙二醛(MDA)。同 時(shí)，能提高患者體內(nèi)消除生物體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，源于生命體的活性物 質(zhì)一S0D;升高能舒張血管，抑制血小板黏附聚集、清除自由基、維持正常的心排血量，具有 細(xì)胞保護(hù)作用的一氧化氮。
[0003] 舒血寧注射液的活性成分為銀杏葉提取物，其有效成分主要為黃酮苷類(lèi)和萜類(lèi)內(nèi) 酯活性物質(zhì)，舒血寧質(zhì)量控制方法普遍是測(cè)定這兩類(lèi)成分的含量。王京輝等提供了一種舒 血寧注射液、銀杏葉提取物及銀杏葉指紋圖譜(藥物分析雜志，2008，28(7) 1026~1030頁(yè)）； 周欣等提供了一種銀杏葉片劑中銀杏黃酮的HPLC指紋圖譜（中國(guó)藥學(xué)雜志，2005年1月第40 卷第2期，93~95頁(yè)）；帥麗英等提供了一種銀杏葉提取物的HPLC/UV指紋圖譜（中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo) 報(bào)，2011年5月第8卷第15期，55~57頁(yè))等。上述指紋圖譜可以對(duì)銀杏葉提取物或銀杏提取 物相關(guān)制劑的質(zhì)量控制起到一定作用。但是指紋圖譜的缺點(diǎn)是無(wú)法定量的評(píng)價(jià)其有效成分 的含量。
[0004] CN104034826提供了一種使用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)銀杏葉萜類(lèi) 內(nèi)酯的方法，采用該方法可以同時(shí)檢測(cè)4種萜類(lèi)內(nèi)酯；劉會(huì)等公開(kāi)了一種以HPLC-UV法測(cè)定 銀杏葉提取物中3個(gè)黃酮醇苷含量，并以HPLC-ELSD法測(cè)定4個(gè)萜類(lèi)內(nèi)酯含量的方法（中華中 醫(yī)藥雜志(原中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào))2015年2月第30卷第2期，第598~601頁(yè)）。上述方法是采用不同 的檢測(cè)方法分別檢測(cè)萜類(lèi)內(nèi)酯和黃酮醇苷，缺點(diǎn)是需要采用不同的儀器、不同的樣品處理 條件分別進(jìn)樣，從而導(dǎo)致操作步驟繁雜，工藝簡(jiǎn)便性不足。
[0005] 崔大明等公開(kāi)了一種采用RP-HPLC測(cè)定銀杏葉提取物類(lèi)脂質(zhì)體中的3種銀杏黃酮 苷(槲皮素、山奈素、異鼠李素）以及4種萜類(lèi)內(nèi)酯(銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、白果 內(nèi)酯)含量的方法(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,35(4): 446~449,462);任艷平等公開(kāi)了一種 采用HPLC-MS同時(shí)測(cè)定舒血寧注射液中銀杏內(nèi)酯A(GA)、銀杏內(nèi)酯B(GB)、銀杏內(nèi)酯C(GC)、 白果內(nèi)酯、（BB)以及槲皮素(QCT)、異鼠李素（ISR)和山柰酚(KAE)等7個(gè)成分含量的方法(藥 物分析雜志，2013,33(2)第220~224頁(yè)）。上述方法與指紋圖譜方法相比，可以檢測(cè)并標(biāo)定 有效成分含量，能夠更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量。另外，由于可以同時(shí)檢測(cè)黃酮苷和萜類(lèi)內(nèi)酯，大 大簡(jiǎn)化了操作流程。
[0006] 為了更好地控制舒血寧注射液的質(zhì)量，保證用藥的安全性，更好的指導(dǎo)生產(chǎn)，使工 藝控制更加嚴(yán)格合理，使消費(fèi)者能全面認(rèn)識(shí)產(chǎn)品質(zhì)地，需要不斷研究和摸索更有利于產(chǎn)品 質(zhì)量檢測(cè)、明確具體有效成分種類(lèi)和含量的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種采用雙檢測(cè)器的高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定舒血寧注 射液中8種黃酮類(lèi)化合物和3萜內(nèi)酯類(lèi)化合物含量的檢測(cè)方法。使用這種方法，可以更好的 控制制劑的質(zhì)量，保證用藥的安全性，能夠更好地指導(dǎo)生產(chǎn)，使生產(chǎn)工藝控制更加嚴(yán)格合 理，使消費(fèi)者能夠全面認(rèn)識(shí)產(chǎn)品質(zhì)地。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0009] -種采用雙檢測(cè)器的高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定舒血寧注射液中銀杏內(nèi)酯和黃酮 苷的含量的方法，采用的色譜條件為：固定相是以十八烷基鍵合硅膠為填料的色譜柱;洗脫 流速為0.5~2. OmL/min;流動(dòng)相A是0.05 %四氫呋喃-0.1 %甲酸-5 %甲醇-水的混合溶劑， 體積比是0.1~2:1~5:5~15:900~1000;流動(dòng)相B是0.1 %四氫呋喃-甲醇乙腈溶液的混合 溶劑，體積比為〇 . 5~3:1000~1200，其中所述甲醇乙腈溶液為甲醇和乙腈體積比1:1的溶 液;進(jìn)行梯度洗脫，梯度條件為：
[0011];紫外檢測(cè)器與ELSD檢測(cè)器串聯(lián)，其中紫外檢測(cè)波長(zhǎng)355~365nm，ELSD條件為：漂 移管溫度115~105°C，載氣流速為2~3L/min，增益值為1。
[0012]在一些實(shí)施方案中，梯度條件優(yōu)選：

[0014]在一些實(shí)施方案中，梯度條件優(yōu)選：
[0016]在一些實(shí)施方案中，梯度條件優(yōu)選為：
[0019] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述流動(dòng)相A，0.05%四氫呋喃-0.1 %甲酸-5%甲醇-水的體積比是1:2:10:950。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的流動(dòng)相B，0.1%四氫呋喃-甲醇乙腈溶液體積比 為1:1000,其中所述甲醇乙腈溶液為甲醇和乙腈體積比1:1的溶液。
[0021] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm。
[0022] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述洗脫流速為lmL/min。
[0023] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述漂移管溫度為110°C。
[0024]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述載氣流速為2.5L/min。
[0025] 本發(fā)明提到的測(cè)定方法，其洗脫流速設(shè)定為一般技術(shù)人員公知的常識(shí)，常見(jiàn)的范 圍一般為0.5ml/min至2ml/min，本發(fā)明優(yōu)選0.9~1. lml/min，更優(yōu)選1 .Oml/min。
[0026] 本發(fā)明所述的8種黃酮苷分別為蘆丁、異槲皮苷、水仙苷、3-0-{2-0-[6-0_(對(duì)羥 基-反-香豆酰)_葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖 苷、3-0- {2-0- [ 6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、山奈酚-7-O-0-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-0-蕓香糖苷，3種內(nèi)酯分別為銀杏內(nèi)酯A(GA)、銀杏內(nèi)酯B(GB)、銀杏內(nèi) 酯C(GC)。
[0027] 本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果：
[0028] (1)本發(fā)明的方法能在同一個(gè)高效液相色譜條件下同時(shí)測(cè)定舒血寧注射液中8種 黃酮類(lèi)化合物和3萜內(nèi)酯類(lèi)化合物含量，避免了在檢測(cè)中頻繁更換液相條件，提高了工作效 率，適合工業(yè)大生產(chǎn)的要求。
[0029] (2)本發(fā)明的方法耐用性好，容易實(shí)現(xiàn)，所用儀器設(shè)備及試劑均是常規(guī)用品，試驗(yàn) 參數(shù)也是常規(guī)參數(shù)，無(wú)苛刻條件，成本低，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的條件均能滿(mǎn)足。
[0030] 附圖
[0031] 附圖1:8種黃酮類(lèi)化合物對(duì)照品色譜圖，其中1為蘆丁、2為異槲皮苷、3為水仙苷、4 為3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、5為槲皮素_ 3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、6為3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李 糖基}槲皮素、7為山奈酚-7-O-0-D-葡萄糖、8為山奈酚-3-0-蕓香糖苷；
[0032] 附圖2:3種萜內(nèi)酯類(lèi)化合物對(duì)照品色譜圖，其中9為銀杏內(nèi)酯GC、10為銀杏內(nèi)酯GA、 11為銀杏內(nèi)酯GB;
[0033] 附圖3:舒血寧注射液紫外檢測(cè)色譜圖，其中1為蘆丁、2為異槲皮苷、3為水仙苷、4 為3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、5為槲皮素_ 3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、6為3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李 糖基}槲皮素、7為山奈酚-7-O-0-D-葡萄糖、8為山奈酚-3-0-蕓香糖苷；
[0034]附圖4:舒血寧注射液ELSD檢測(cè)色譜圖，其中9為銀杏內(nèi)酯GC、10為銀杏內(nèi)酯GA、11 為銀杏內(nèi)酯GB;
[0035]附圖5:舒血寧注射液紫外檢測(cè)色譜圖，其中1為蘆丁、2為異槲皮苷、3為水仙苷、4 為3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、5為槲皮素_ 3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、6為3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李 糖基}槲皮素、7為山奈酚-7-O-0-D-葡萄糖、8為山奈酚-3-0-蕓香糖苷；
[0036]附圖6:舒血寧注射液ELSD檢測(cè)色譜圖，其中9為銀杏內(nèi)酯GC、10為銀杏內(nèi)酯GA、11 為銀杏內(nèi)酯GB。 具體實(shí)施方案
[0037]下述是結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但這些實(shí)施例僅限于說(shuō)明本發(fā)明而不 是用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī) 條件。
[0038] 實(shí)施例1:
[0039] (1)色譜條件：固定相是以十八烷基鍵合硅膠為填料的色譜柱;紫外檢測(cè)器與ELSD 檢測(cè)器串聯(lián);紫外檢測(cè)波長(zhǎng)360nm;流速為lmL/min;流動(dòng)相A是0.05 %四氫呋喃-0.1 %甲酸-5%甲醇-水的混合溶劑，體積比是1:2:10:950;流動(dòng)相B是0.1%四氫呋喃-甲醇乙腈溶液的 混合溶劑，體積比為1:1000,其中所述甲醇乙腈溶液為甲醇和乙腈體積比1:1的溶液;進(jìn)行 梯度洗脫，梯度條件為：
[0042] ;ELSD條件為:漂移管溫度110°C，載氣流速為2.5L/min，增益值為1。
[0043] (2)對(duì)照品儲(chǔ)備液:精密稱(chēng)取蘆丁、異槲皮苷、水仙苷、3-0- {2-0- [ 6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)_葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、 3-0- {2-0- [ 6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、山奈酚-7-O-0-D-葡 萄糖苷、山奈酚-3-0-蕓香糖苷、銀杏內(nèi)酯A(GA)、銀杏內(nèi)酯B(GB)、銀杏內(nèi)酯C(GC)對(duì)照品 5mg，分別加甲醇配成濃度為lmg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，置4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0044] (3)樣品制備:將舒血寧注射液以14000r. mirT1的速度離心10min，取上清液，將上 清液再以14000r .mirT1的速度離心10min，取上清液，作為舒血寧注射液樣品儲(chǔ)備液置4°C冰 箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0045] (4)標(biāo)準(zhǔn)曲線:將上述蘆丁對(duì)照品配制成濃度為250ug/ml，水仙苷、山奈酚-3-0-蕓 香糖苷對(duì)照品配制成濃度為200iig/ml，3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]_ (1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)_葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素對(duì)照品濃度為l〇〇μg/ml，異槲皮苷、山奈酚-7-0-0-D-葡萄糖苷對(duì)照品濃度為50μg/ml的混合母液，并以0.6倍逐級(jí)稀釋成8個(gè)點(diǎn)。將GA、GB、GC 配制成濃度分別為250ug/ml的混合母液，并以0.7倍逐級(jí)稀釋成8個(gè)點(diǎn)。將上述兩混合母液 按照上述色譜條件進(jìn)樣15yl，記錄峰面積。ELSD條件下以進(jìn)樣濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以峰 面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)。求得11種化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，線性范圍及r值，線性關(guān)系 結(jié)果如表1所示。8種黃酮類(lèi)化合物的對(duì)照品色譜圖如圖1所示;3種萜內(nèi)酯類(lèi)化合物的對(duì)照 品色譜圖如圖2所示。
[0046]表1線性關(guān)系結(jié)果
[0049] (5)精密度實(shí)驗(yàn):精密取適量舒血寧注射液供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣15yL，按 照上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次。峰面積的RSD在1.46%~3.57 %，均小于5 %。試驗(yàn)結(jié)果表 明：所建立的方法精密度良好。
[0050] (6)重復(fù)性實(shí)驗(yàn):精密取6份舒血寧注射液供試品溶液，按"上述色譜條件進(jìn)樣15y L，連續(xù)進(jìn)樣6次。計(jì)算各化合物峰面積，RSD在0.76%~3.65%，均小于5%。試驗(yàn)結(jié)果表明： 測(cè)定方法重現(xiàn)性良好。
[0051] (7)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取同一批供試品溶液，分別在0,2,4,8，12,2處后按照上述色譜條 件，進(jìn)樣15yL，測(cè)定化合物峰面積。結(jié)果峰面積RSD在0.75~4.83%，均小于5%，可見(jiàn)樣品在 24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
[0052] (8)加樣回收率試驗(yàn):將蘆丁、異槲皮苷、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、 山奈酚-7-CH3-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-0-蕓香糖苷、水仙苷、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基_反_ 香豆酰)_葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]_ (1-2)鼠李糖基}山奈酚、GA、GB、GC配制成濃度分別為650ug/ml、51μg/ml、173μg/ml、25yg/ ml、475μg/ml、413μg/ml、346μg/ml、273μg/ml、810iig/ml、760iig/ml、330iig/ml 的混合母液， 取100yl的混合溶液加入500yl的舒血寧注射液供試品溶液中，再加入400ul甲醇，渦旋，以 14000r/min的速度離心10min，取上清液，再以14000r/min的速度離心10min，取上清液，標(biāo) 為樣品1，平行6次，按色進(jìn)樣15此。另取樣品加甲醇稀釋一倍，渦旋，以14000r/min的速度離 心lOmin，取上清液，再以14000r/min的速度離心10min，取上清液標(biāo)為樣品2,平行3次，按色 譜條件進(jìn)樣15yL。計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示回收率RSD值在0.24 %~2.44%范圍以?xún)?nèi)，均 小于5%，平均回收率在95.0%~105.0%范圍內(nèi)，表明本方法的準(zhǔn)確度良好。
[0053] (9)含量檢測(cè)
[0054] 按照上述(3)所述條件處理樣品，按上述（1)所述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得峰面積，代入 相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)線，分別計(jì)算舒血寧注射液樣品中11種化合物的含量。樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。圖3 為舒血寧注射液紫外檢測(cè)色譜圖；圖4為，舒血寧注射液ELSD檢測(cè)色譜圖。
[0055]表2舒血寧注射液樣品含量測(cè)定結(jié)果
[0057] 實(shí)施例2:
[0058] (1)色譜條件：固定相是以十八烷基鍵合硅膠為填料的色譜柱;紫外檢測(cè)器與ELSD 檢測(cè)器串聯(lián);紫外檢測(cè)波長(zhǎng)360nm;流速為lmL/min;流動(dòng)相A是0.05 %四氫呋喃-0.1 %甲酸-5%甲醇-水的混合溶劑，體積比是1:2:10:950;流動(dòng)相B是0.1%四氫呋喃-甲醇乙腈溶液的 混合溶劑，體積比為1:1000,其中所述甲醇乙腈溶液為甲醇和乙腈體積比1:1的溶液;進(jìn)行 梯度洗脫，梯度條件為：
[0060] ; ELSD條件為:漂移管溫度110 °C，載氣流速為2.5L/min，增益值為1。
[0061 ] (2)對(duì)照品儲(chǔ)備液:精密稱(chēng)取蘆丁、異槲皮苷、水仙苷、3-0- {2-0- [ 6-0-(對(duì)羥基- 反-香豆酰)_葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、 3-0- {2-0- [ 6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、山奈酚-7-O-0-D-葡 萄糖苷、山奈酚-3-0-蕓香糖苷、銀杏內(nèi)酯A(GA)、銀杏內(nèi)酯B(GB)、銀杏內(nèi)酯C(GC)對(duì)照品 5mg，分別加甲醇配成濃度為lmg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，置4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0062] (3)樣品制備：將舒血寧注射液用乙醇溶解，配制成濃度為5mg/ml的溶液，以 14000r.min-1的速度離心10min，取上清液，將上清液再以14000r.min-1的速度離心10min， 取上清液，作為舒血寧注射液供試品溶液樣品儲(chǔ)備液置4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0063] (4)標(biāo)準(zhǔn)曲線:將上述蘆丁對(duì)照品配制成濃度為250ug/ml，水仙苷、山奈酚-3-0-蕓 香糖苷對(duì)照品配制成濃度為200iig/ml，3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]_ (1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)_葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素對(duì)照品濃度為l〇〇μg/ml，異槲皮苷、山奈酚-7-0-0-D-葡萄糖苷對(duì)照品濃度為50μg/ml的混合母液，并以0.6倍逐級(jí)稀釋成8個(gè)點(diǎn)。將GA、GB、GC 配制成濃度分別為250ug/ml的混合母液，并以0.7倍逐級(jí)稀釋成8個(gè)點(diǎn)。將上述兩混合母液 按照上述色譜條件進(jìn)樣15yl，記錄峰面積。ELSD條件下以進(jìn)樣濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以峰 面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)。求得11種化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，線性范圍及r值，線性關(guān)系 結(jié)果如表3所示。
[0064]表3線性關(guān)系結(jié)果
[0066] (5)精密度實(shí)驗(yàn):精密取適量舒血寧注射液供試品溶液，按譜條件進(jìn)樣15yL，按照 上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次。峰面積的RSD在1.64%~4.17%，均小于5%。試驗(yàn)結(jié)果表明： 所建立的方法精密度良好。
[0067] (6)重復(fù)性實(shí)驗(yàn):精密取6份舒血寧注射液供試品溶液，按"上述色譜條件進(jìn)樣15y L，連續(xù)進(jìn)樣6次。計(jì)算各化合物峰面積，RSD在0.83 %~4.04%，均小于5 %。試驗(yàn)結(jié)果表明： 測(cè)定方法重現(xiàn)性良好。
[0068] (7)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取同一批供試品溶液，分別在0,2,4,8，12,2處后按照上述色譜條 件，進(jìn)樣15yL，測(cè)定化合物峰面積。結(jié)果峰面積RSD在0.89~4.87%，均小于5%，可見(jiàn)樣品在 24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
[0069] (8)加樣回收率試驗(yàn):將蘆丁、異槲皮苷、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、 山奈酚-7-CH3-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-0-蕓香糖苷、水仙苷、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基_反_ 香豆酰)_葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]_ (1-2)鼠李糖基}山奈酚、GA、GB、GC配制成濃度分別為650ug/ml、51μg/ml、173μg/ml、25yg/ ml、475μg/ml、413μg/ml、346μg/ml、273μg/ml、810iig/ml、760iig/ml、330iig/ml 的混合母液， 取100yl的混合溶液加入500yl的舒血寧注射液供試品溶液中，再加入400ul甲醇，渦旋，以 14000r/min的速度離心10min，取上清液，再以14000r/min的速度離心10min，取上清液，標(biāo) 為樣品1，平行6次，按色進(jìn)樣15此。另取樣品加甲醇稀釋一倍，渦旋，以14000r/min的速度離 心lOmin，取上清液，再以14000r/min的速度離心10min，取上清液標(biāo)為樣品2,平行3次，按色 譜條件進(jìn)樣15yL。計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示回收率RSD值在0.37 %~2.76 %范圍以?xún)?nèi)，均 小于5%，平均回收率在94.0%~106.0%范圍內(nèi)，表明本方法的準(zhǔn)確度良好。
[0070] (9)含量檢測(cè)
[0071] 按照上述(3)所述條件處理樣品，按上述(1)所述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得峰面積，代入 相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)線，分別計(jì)算舒血寧注射液樣品中11種化合物的含量。樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。
[0072] 表4舒血寧注射液樣品含量測(cè)定結(jié)果

[0075] 實(shí)施例3:
[0076] (1)色譜條件：固定相是以十八烷基鍵合硅膠為填料的色譜柱;紫外檢測(cè)器與ELSD 檢測(cè)器串聯(lián);紫外檢測(cè)波長(zhǎng)360nm;流速為lmL/min;流動(dòng)相A是0.05 %四氫呋喃-0.1 %甲酸-5%甲醇-水的混合溶劑，體積比是1:2:10:950;流動(dòng)相B是0.1%四氫呋喃-甲醇乙腈溶液的 混合溶劑，體積比為1:1000,其中所述甲醇乙腈溶液為甲醇和乙腈體積比1:1的溶液;進(jìn)行 梯度洗脫，梯度條件為：
[0078] ;ELSD條件為:漂移管溫度110°C，載氣流速為2.5L/min，增益值為1。
[0079] (2)對(duì)照品儲(chǔ)備液:精密稱(chēng)取蘆丁、異槲皮苷、水仙苷、3-0- {2-0- [ 6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)_葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、 3-0- {2-0- [ 6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、山奈酚-7-O-0-D-葡 萄糖苷、山奈酚-3-0-蕓香糖苷、銀杏內(nèi)酯A(GA)、銀杏內(nèi)酯B(GB)、銀杏內(nèi)酯C(GC)對(duì)照品 5mg，分別加甲醇配成濃度為lmg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，置4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0080] (3 )樣品制備：將舒血寧注射液用乙醇溶解，配制成濃度為5mg/m 1的溶液，以 14000r .min-1的速度離心10min，取上清液，將上清液再以14000r .min-1的速度離心10min， 取上清液，作為舒血寧注射液供試品溶液樣品儲(chǔ)備液置4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0081 ] (4)標(biāo)準(zhǔn)曲線:將上述蘆丁對(duì)照品配制成濃度為250ug/ml，水仙苷、山奈酚-3-0-蕓 香糖苷對(duì)照品配制成濃度為200iig/ml，3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]_ (1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)_葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素對(duì)照品濃度為l〇〇μg/ml，異槲皮苷、山奈酚-7-0-0-D-葡萄糖苷對(duì)照品濃度為50μg/ml的混合母液，并以0.6倍逐級(jí)稀釋成8個(gè)點(diǎn)。將GA、GB、GC 配制成濃度分別為250ug/ml的混合母液，并以0.7倍逐級(jí)稀釋成8個(gè)點(diǎn)。將上述兩混合母液 按照上述色譜條件進(jìn)樣15yl，記錄峰面積。ELSD條件下以進(jìn)樣濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以峰 面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)。求得11種化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，線性范圍及r值，線性關(guān)系 結(jié)果如表5所不。
[0082]表5線性關(guān)系結(jié)果
[0084] (5)精密度實(shí)驗(yàn):精密取適量舒血寧注射液供試品溶液，按譜條件進(jìn)樣15yL，按照 上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次。峰面積的RSD在2.74%~4.31 %，均小于5%。試驗(yàn)結(jié)果表明： 所建立的方法精密度良好。
[0085] (6)重復(fù)性實(shí)驗(yàn):精密取6份舒血寧注射液供試品溶液，按"上述色譜條件進(jìn)樣15y L，連續(xù)進(jìn)樣6次。計(jì)算各化合物峰面積，RSD在1.28%~4.31 %，均小于5%。試驗(yàn)結(jié)果表明： 測(cè)定方法重現(xiàn)性良好。
[0086] (7)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取同一批供試品溶液，分別在0,2,4,8，12,2處后按照上述色譜條 件，進(jìn)樣15yL，測(cè)定化合物峰面積。結(jié)果峰面積RSD在1.14~4.80%，均小于5%，可見(jiàn)樣品在 24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
[0087] (8)加樣回收率試驗(yàn):將蘆丁、異槲皮苷、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、 山奈酚-7-CH3-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-0-蕓香糖苷、水仙苷、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基_反_ 香豆酰)_葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]_ (1-2)鼠李糖基}山奈酚、GA、GB、GC配制成濃度分別為650ug/ml、51μg/ml、173μg/ml、25yg/ ml、475μg/ml、413μg/ml、346μg/ml、273μg/ml、810iig/ml、760iig/ml、330iig/ml 的混合母液， 取100yl的混合溶液加入500yl的舒血寧注射液供試品溶液中，再加入400ul甲醇，渦旋，以 14000r/min的速度離心10min，取上清液，再以14000r/min的速度離心10min，取上清液，標(biāo) 為樣品1，平行6次，按色進(jìn)樣15此。另取樣品加甲醇稀釋一倍，渦旋，以14000r/min的速度離 心lOmin，取上清液，再以14000r/min的速度離心10min，取上清液標(biāo)為樣品2,平行3次，按色 譜條件進(jìn)樣15此。計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示回收率RSD值在0.31 %~3.95%范圍以?xún)?nèi)，均 小于5%，平均回收率在96.0%~108.0%范圍內(nèi)，表明本方法的準(zhǔn)確度良好。
[0088] (9)含量檢測(cè)
[0089] 按照上述(3)所述條件處理樣品，按上述（1)所述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得峰面積，代入 相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)線，分別計(jì)算舒血寧注射液樣品中11種化合物的含量。樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。 [0090]表6舒血寧注射液樣品含量測(cè)定結(jié)果
[0092] 實(shí)施例4:
[0093] (1)色譜條件：固定相是以十八烷基鍵合硅膠為填料的色譜柱;紫外檢測(cè)器與ELSD 檢測(cè)器串聯(lián);紫外檢測(cè)波長(zhǎng)360nm;流速為lmL/min;流動(dòng)相A是0.05 %四氫呋喃-0.1 %甲酸-5%甲醇-水的混合溶劑，體積比是1:2:10:950;流動(dòng)相B是0.1%四氫呋喃-甲醇乙腈溶液的 混合溶劑，體積比為1:1000,其中所述甲醇乙腈溶液為甲醇和乙腈體積比1:1的溶液;進(jìn)行 梯度洗脫，梯度條件為：
[0095] ; ELSD條件為:漂移管溫度110 °C，載氣流速為2.5L/min，增益值為1。
[0096] (2)對(duì)照品儲(chǔ)備液:精密稱(chēng)取蘆丁、異槲皮苷、水仙苷、3-0- {2-0- [ 6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)_葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、 3-0- {2-0- [ 6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、山奈酚-7-O-0-D-葡 萄糖苷、山奈酚-3-0-蕓香糖苷、銀杏內(nèi)酯A(GA)、銀杏內(nèi)酯B(GB)、銀杏內(nèi)酯C(GC)對(duì)照品 5mg，分別加甲醇配成濃度為lmg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，置4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0097] (3 )樣品制備：將舒血寧注射液用乙醇溶解，配制成濃度為5mg/ml的溶液，以 14000r.min-1的速度離心10min，取上清液，將上清液再以14000r.min-1的速度離心10min， 取上清液，作為舒血寧注射液供試品溶液樣品儲(chǔ)備液置4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0098] (4)標(biāo)準(zhǔn)曲線:將上述蘆丁對(duì)照品配制成濃度為250ug/ml，水仙苷、山奈酚-3-0-蕓 香糖苷對(duì)照品配制成濃度為200iig/ml，3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]_ (1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)_葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素對(duì)照品濃度為l〇〇μg/ml，異槲皮苷、山奈酚-7-0-0-D-葡萄糖苷對(duì)照品濃度為50μg/ml的混合母液，并以0.6倍逐級(jí)稀釋成8個(gè)點(diǎn)。將GA、GB、GC 配制成濃度分別為250ug/ml的混合母液，并以0.7倍逐級(jí)稀釋成8個(gè)點(diǎn)。將上述兩混合母液 按照上述色譜條件進(jìn)樣15yl，記錄峰面積。ELSD條件下以進(jìn)樣濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以峰 面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)。求得11種化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，線性范圍及r值，線性關(guān)系 結(jié)果如表7所不。
[0099]表7線性關(guān)系結(jié)果
[0102] (5)精密度實(shí)驗(yàn):精密取適量舒血寧注射液供試品溶液，按譜條件進(jìn)樣15yL，按照 上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次。峰面積的RSD在2.67%~4.71 %，均小于5%。試驗(yàn)結(jié)果表明： 所建立的方法精密度良好。
[0103] (6)重復(fù)性實(shí)驗(yàn):精密取6份舒血寧注射液供試品溶液，按"上述色譜條件進(jìn)樣15y L，連續(xù)進(jìn)樣6次。計(jì)算各化合物峰面積，RSD在1.56%~4.78%，均小于5 %。試驗(yàn)結(jié)果表明： 測(cè)定方法重現(xiàn)性良好。
[0104] (7)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取同一批供試品溶液，分別在0,2,4,8，12,2處后按照上述色譜條 件，進(jìn)樣15yL，測(cè)定化合物峰面積。結(jié)果峰面積RSD在1.42~4.81 %，均小于5%，可見(jiàn)樣品在 24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
[0105] (8)加樣回收率試驗(yàn):將蘆丁、異槲皮苷、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、 山奈酚-7-CH3-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-0-蕓香糖苷、水仙苷、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基_反_ 香豆酰)_葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]_ (1-2)鼠李糖基}山奈酚、GA、GB、GC配制成濃度分別為650ug/ml、51μg/ml、173μg/ml、25yg/ ml、475μg/ml、413μg/ml、346μg/ml、273μg/ml、810iig/ml、760iig/ml、330iig/ml 的混合母液， 取100yl的混合溶液加入500yl的舒血寧注射液供試品溶液中，再加入400ul甲醇，渦旋，以 14000r/min的速度離心10min，取上清液，再以14000r/min的速度離心10min，取上清液，標(biāo) 為樣品1，平行6次，按色進(jìn)樣15此。另取樣品加甲醇稀釋一倍，渦旋，以14000r/min的速度離 心lOmin，取上清液，再以14000r/min的速度離心10min，取上清液標(biāo)為樣品2,平行3次，按色 譜條件進(jìn)樣15此。計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示回收率RSD值在0.86%~3.67%范圍以?xún)?nèi)，均 小于5%，平均回收率在96.0%~107.0%范圍內(nèi)，表明本方法的準(zhǔn)確度良好。
[0106] (9)含量檢測(cè)
[0107] 按照上述(3)所述條件處理樣品，按上述(1)所述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得峰面積，代入 相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)線，分別計(jì)算舒血寧注射液樣品中11種化合物的含量。樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表8。
[0108] 表8舒血寧注射液樣品含量測(cè)定結(jié)果
[0110] 實(shí)施例5:
[0111] (1)色譜條件：固定相是以十八烷基鍵合硅膠為填料的色譜柱;紫外檢測(cè)器與ELSD 檢測(cè)器串聯(lián);紫外檢測(cè)波長(zhǎng)360nm;流速為lmL/min;流動(dòng)相A是0.05 %四氫呋喃-0.1 %甲酸-5 %甲醇-水的混合溶劑，體積比是2:5:15:1000;流動(dòng)相B是0.1 %四氫呋喃-甲醇乙腈溶液 的混合溶劑，體積比為3:1200,其中所述甲醇乙腈溶液為甲醇和乙腈體積比1:1的溶液;進(jìn) 行梯度洗脫，梯度條件為：
[0114] ;ELSD條件為:漂移管溫度105°C，載氣流速為2.5L/min，增益值為1。
[0115] (2)對(duì)照品儲(chǔ)備液:精密稱(chēng)取蘆丁、異槲皮苷、水仙苷、3-0- {2-0- [ 6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)_葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、 3-0- {2-0- [ 6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、山奈酚-7-O-0-D-葡 萄糖苷、山奈酚-3-0-蕓香糖苷、銀杏內(nèi)酯A(GA)、銀杏內(nèi)酯B(GB)、銀杏內(nèi)酯C(GC)對(duì)照品 5mg，分別加甲醇配成濃度為lmg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，置4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0116] (3)樣品制備：將舒血寧注射液用乙醇溶解，配制成濃度為5mg/ml的溶液，以 14000r.min- 1的速度離心10min，取上清液，將上清液再以14000r.min-1的速度離心10min， 取上清液，作為舒血寧注射液供試品溶液樣品儲(chǔ)備液置4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0117] (4)標(biāo)準(zhǔn)曲線:將上述蘆丁對(duì)照品配制成濃度為250ug/ml，水仙苷、山奈酚-3-0-蕓 香糖苷對(duì)照品配制成濃度為200iig/ml，3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]_ (1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)_葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素對(duì)照品濃度為l〇〇μg/ml，異槲皮苷、山奈酚-7-0-0-D-葡萄糖苷對(duì)照品濃度為50μg/ml的混合母液，并以0.6倍逐級(jí)稀釋成8個(gè)點(diǎn)。將GA、GB、GC 配制成濃度分別為250ug/ml的混合母液，并以0.7倍逐級(jí)稀釋成8個(gè)點(diǎn)。將上述兩混合母液 按照上述色譜條件進(jìn)樣15yl，記錄峰面積。ELSD條件下以進(jìn)樣濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以峰 面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)。求得11種化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，線性范圍及r值，線性關(guān)系 結(jié)果如表9所示。
[0118] 表9線性關(guān)系結(jié)果
[0121 ] (5)精密度實(shí)驗(yàn):精密取適量舒血寧注射液供試品溶液，按譜條件進(jìn)樣15yL，按照 上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次。峰面積的RSD在2.73%~4.85%，均小于5%。試驗(yàn)結(jié)果表明： 所建立的方法精密度良好。
[0122] (6)重復(fù)性實(shí)驗(yàn):精密取6份舒血寧注射液供試品溶液，按"上述色譜條件進(jìn)樣15y L，連續(xù)進(jìn)樣6次。計(jì)算各化合物峰面積，RSD在1.89~4.09%，均小于5%。試驗(yàn)結(jié)果表明：測(cè) 定方法重現(xiàn)性良好。
[0123] (7)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取同一批供試品溶液，分別在0,2,4,8，12,2處后按照上述色譜條 件，進(jìn)樣15yL，測(cè)定化合物峰面積。結(jié)果峰面積RSD在1.66~4.37%，均小于5%，可見(jiàn)樣品在 24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
[0124] (8)加樣回收率試驗(yàn):將蘆丁、異槲皮苷、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、 山奈酚-7-CH3-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-0-蕓香糖苷、水仙苷、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基_反_ 香豆酰)_葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]_ (1-2)鼠李糖基}山奈酚、GA、GB、GC配制成濃度分別為650ug/ml、51μg/ml、173μg/ml、25yg/ ml、475μg/ml、413μg/ml、346μg/ml、273μg/ml、810iig/ml、760iig/ml、330iig/ml 的混合母液， 取100yl的混合溶液加入500yl的舒血寧注射液供試品溶液中，再加入400ul甲醇，渦旋，以 14000r/min的速度離心10min，取上清液，再以14000r/min的速度離心10min，取上清液，標(biāo) 為樣品1，平行6次，按色進(jìn)樣15此。另取樣品加甲醇稀釋一倍，渦旋，以14000r/min的速度離 心lOmin，取上清液，再以14000r/min的速度離心10min，取上清液標(biāo)為樣品2,平行3次，按色 譜條件進(jìn)樣15此。計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示回收率RSD值在1.24%~4.51 %范圍以?xún)?nèi)，均 小于5%，平均回收率在96.0%~107.0%范圍內(nèi)，表明本方法的準(zhǔn)確度良好。
[0125] (9)含量檢測(cè)
[0126] 按照上述(3)所述條件處理樣品，按上述(1)所述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得峰面積，代入 相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)線，分別計(jì)算舒血寧注射液樣品中11種化合物的含量。樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表10。圖 5為舒血寧注射液紫外檢測(cè)色譜圖；圖6為，舒血寧注射液ELSD檢測(cè)色譜圖。
[0127] 表10舒血寧注射液樣品含量測(cè)定結(jié)果

[0130] 實(shí)施例6:
[0131] (1)色譜條件：固定相是以十八烷基鍵合硅膠為填料的色譜柱;紫外檢測(cè)器與ELSD 檢測(cè)器串聯(lián);紫外檢測(cè)波長(zhǎng)360nm;流速為lmL/min;流動(dòng)相A是0.05 %四氫呋喃-0.1 %甲酸-5 %甲醇-水的混合溶劑，體積比是0.1:1:5:900;流動(dòng)相B是0.1 %四氫呋喃-甲醇乙腈溶液 的混合溶劑，體積比為0.5:1000,其中所述甲醇乙腈溶液為甲醇和乙腈體積比1:1的溶液； 進(jìn)行梯度洗脫，梯度條件為：
[0133] ;ELSD條件為:漂移管溫度105°C，載氣流速為2.5L/min，增益值為1。
[0134] (2)對(duì)照品儲(chǔ)備液:精密稱(chēng)取蘆丁、異槲皮苷、水仙苷、3-0- {2-0- [ 6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)_葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、 3-0- {2-0- [ 6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、山奈酚-7-O-0-D-葡 萄糖苷、山奈酚-3-0-蕓香糖苷、銀杏內(nèi)酯A(GA)、銀杏內(nèi)酯B(GB)、銀杏內(nèi)酯C(GC)對(duì)照品 5mg，分別加甲醇配成濃度為lmg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，置4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0135] (3 )樣品制備：將舒血寧注射液用乙醇溶解，配制成濃度為5mg/m 1的溶液，以 14000r .min-1的速度離心10min，取上清液，將上清液再以14000r .min-1的速度離心10min， 取上清液，作為舒血寧注射液供試品溶液樣品儲(chǔ)備液置4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0136] (4)標(biāo)準(zhǔn)曲線:將上述蘆丁對(duì)照品配制成濃度為250ug/ml，水仙苷、山奈酚-3-0-蕓 香糖苷對(duì)照品配制成濃度為200iig/ml，3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]_ (1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)_葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素對(duì)照品濃度為l〇〇μg/ml，異槲皮苷、山奈酚-7-0-0-D-葡萄糖苷對(duì)照品濃度為50μg/ml的混合母液，并以0.6倍逐級(jí)稀釋成8個(gè)點(diǎn)。將GA、GB、GC 配制成濃度分別為250ug/ml的混合母液，并以0.7倍逐級(jí)稀釋成8個(gè)點(diǎn)。將上述兩混合母液 按照上述色譜條件進(jìn)樣15yl，記錄峰面積。ELSD條件下以進(jìn)樣濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以峰 面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)。求得11種化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，線性范圍及r值，線性關(guān)系 結(jié)果如表11所示。
[0137] 表11線性關(guān)系結(jié)果
[0139] (5)精密度實(shí)驗(yàn):精密取適量舒血寧注射液供試品溶液，按譜條件進(jìn)樣15yL，按照 上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次。峰面積的RSD在3.67%~4.91 %，均小于5%。試驗(yàn)結(jié)果表明： 所建立的方法精密度良好。
[0140] (6)重復(fù)性實(shí)驗(yàn):精密取6份舒血寧注射液供試品溶液，按"上述色譜條件進(jìn)樣15y L，連續(xù)進(jìn)樣6次。計(jì)算各化合物峰面積，RSD在1.76%~4.67%，均小于5 %。試驗(yàn)結(jié)果表明： 測(cè)定方法重現(xiàn)性良好。
[0141] (7)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取同一批供試品溶液，分別在0,2,4,8，12,2處后按照上述色譜條 件，進(jìn)樣15yL，測(cè)定化合物峰面積。結(jié)果峰面積RSD在1.79~4.57%，均小于5%，可見(jiàn)樣品在 24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
[0142] (8)加樣回收率試驗(yàn):將蘆丁、異槲皮苷、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、 山奈酚-7-CH3-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-0-蕓香糖苷、水仙苷、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反- 香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]_ (1-2)鼠李糖基}山奈酚、GA、GB、GC配制成濃度分別為650ug/ml、51μg/ml、173μg/ml、25yg/ ml、475μg/ml、413μg/ml、346μg/ml、273μg/ml、810iig/ml、760iig/ml、330iig/ml 的混合母液， 取lOOyl的混合溶液加入500yl的舒血寧注射液供試品溶液中，再加入400ul甲醇，渦旋，以 14000r/min的速度離心10min，取上清液，再以14000r/min的速度離心10min，取上清液，標(biāo) 為樣品1，平行6次，按色進(jìn)樣15此。另取樣品加甲醇稀釋一倍，渦旋，以14000r/min的速度離 心lOmin，取上清液，再以14000r/min的速度離心10min，取上清液標(biāo)為樣品2,平行3次，按色 譜條件進(jìn)樣15此。計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示回收率RSD值在1.34%~4.86%范圍以?xún)?nèi)，均 小于5%，平均回收率在96.0%~107.0%范圍內(nèi)，表明本方法的準(zhǔn)確度良好。
[0143] (9)含量檢測(cè)
[0144] 按照上述(3)所述條件處理樣品，按上述(1)所述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得峰面積，代入 相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)線，分別計(jì)算舒血寧注射液樣品中11種化合物的含量。樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表12。
[0145] 表12舒血寧注射液樣品含量測(cè)定結(jié)果
[0148] 實(shí)施例7:
[0149] (1)色譜條件：固定相是以十八烷基鍵合硅膠為填料的色譜柱;紫外檢測(cè)器與ELSD 檢測(cè)器串聯(lián);紫外檢測(cè)波長(zhǎng)365nm;流速為lmL/min;流動(dòng)相A是0.05 %四氫呋喃-0.1 %甲酸-5 %甲醇-水的混合溶劑，體積比是0.1:1:5:900;流動(dòng)相B是0.1 %四氫呋喃-甲醇乙腈溶液 的混合溶劑，體積比為0.5:1000,其中所述甲醇乙腈溶液為甲醇和乙腈體積比1:1的溶液； 進(jìn)行梯度洗脫，梯度條件為：
[0151] ;ELSD條件為:漂移管溫度115°C，載氣流速為2.5L/min，增益值為1。
[0152] (2)對(duì)照品儲(chǔ)備液:精密稱(chēng)取蘆丁、異槲皮苷、水仙苷、3-0- {2-0- [ 6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)_葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、 3-0- {2-0- [ 6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、山奈酚-7-O-0-D-葡 萄糖苷、山奈酚-3-0-蕓香糖苷、銀杏內(nèi)酯A(GA)、銀杏內(nèi)酯B(GB)、銀杏內(nèi)酯C(GC)對(duì)照品 5mg，分別加甲醇配成濃度為lmg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，置4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0153] (3)樣品制備:將舒血寧注射液以14000r. mirT1的速度離心10min，取上清液，將上 清液再以14000r .mirT1的速度離心10min，取上清液，作為舒血寧注射液樣品儲(chǔ)備液置4°C冰 箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0154] (4)標(biāo)準(zhǔn)曲線:將上述蘆丁對(duì)照品配制成濃度為250ug/ml，水仙苷、山奈酚-3-0-蕓 香糖苷對(duì)照品配制成濃度為200iig/ml，3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]_ (1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)_葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素對(duì)照品濃度為l〇〇μg/ml，異槲皮苷、山奈酚-7-0-0-D-葡萄糖苷對(duì)照品濃度為50μg/ml的混合母液，并以0.6倍逐級(jí)稀釋成8個(gè)點(diǎn)。將GA、GB、GC 配制成濃度分別為250ug/ml的混合母液，并以0.7倍逐級(jí)稀釋成8個(gè)點(diǎn)。將上述兩混合母液 按照上述色譜條件進(jìn)樣15yl，記錄峰面積。ELSD條件下以進(jìn)樣濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以峰 面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)。求得11種化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，線性范圍及r值，線性關(guān)系 結(jié)果如表13所示。
[0155] 表13線性關(guān)系結(jié)果
[0157] (5)精密度實(shí)驗(yàn):精密取適量舒血寧注射液供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣15iiL，按 照上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次。峰面積的RSD在0.82%~4.24%，均小于5 %。試驗(yàn)結(jié)果表 明：所建立的方法精密度良好。
[0158] (6)重復(fù)性實(shí)驗(yàn):精密取6份舒血寧注射液供試品溶液，按"上述色譜條件進(jìn)樣15y L，連續(xù)進(jìn)樣6次。計(jì)算各化合物峰面積，RSD在0.89%~4.05%，均小于5 %。試驗(yàn)結(jié)果表明： 測(cè)定方法重現(xiàn)性良好。
[0159] (7)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取同一批供試品溶液，分別在0,2,4,8，12,2處后按照上述色譜條 件，進(jìn)樣15yL，測(cè)定化合物峰面積。結(jié)果峰面積RSD在0.93~4.44%，均小于5%，可見(jiàn)樣品在 24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
[0160] (8)加樣回收率試驗(yàn):將蘆丁、異槲皮苷、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、 山奈酚-7-CH3-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-0-蕓香糖苷、水仙苷、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基_反_ 香豆酰)_葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]_ (1-2)鼠李糖基}山奈酚、GA、GB、GC配制成濃度分別為650ug/ml、51μg/ml、173μg/ml、25yg/ ml、475μg/ml、413μg/ml、346μg/ml、273μg/ml、810iig/ml、760iig/ml、330iig/ml 的混合母液， 取100yl的混合溶液加入500yl的舒血寧注射液供試品溶液中，再加入400ul甲醇，渦旋，以 14000r/min的速度離心10min，取上清液，再以14000r/min的速度離心10min，取上清液，標(biāo) 為樣品1，平行6次，按色進(jìn)樣15此。另取樣品加甲醇稀釋一倍，渦旋，以14000r/min的速度離 心lOmin，取上清液，再以14000r/min的速度離心10min，取上清液標(biāo)為樣品2,平行3次，按色 譜條件進(jìn)樣15yL。計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示回收率RSD值在0.37 %~3.64%范圍以?xún)?nèi)，均 小于5%，平均回收率在95.0%~105.0%范圍內(nèi)，表明本方法的準(zhǔn)確度良好。
[0161] (9)含量檢測(cè)
[0162] 按照上述(3)所述條件處理樣品，按上述(1)所述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得峰面積，代入 相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)線，分別計(jì)算舒血寧注射液樣品中11種化合物的含量。樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表14
[0163] 表14舒血寧注射液樣品含量測(cè)定結(jié)果
[0165] 實(shí)施例8:
[0166] (1)色譜條件：固定相是以十八烷基鍵合硅膠為填料的色譜柱;紫外檢測(cè)器與ELSD 檢測(cè)器串聯(lián);紫外檢測(cè)波長(zhǎng)365nm;流速為lmL/min;流動(dòng)相A是0.05 %四氫呋喃-0.1 %甲酸-5 %甲醇-水的混合溶劑，體積比是2:5:15:1000;流動(dòng)相B是0.1 %四氫呋喃-甲醇乙腈溶液 的混合溶劑，體積比為3:1200,其中所述甲醇乙腈溶液為甲醇和乙腈體積比1:1的溶液;進(jìn) 行梯度洗脫，梯度條件為：

[0168] ;ELSD條件為:漂移管溫度115°C，載氣流速為2.5L/min，增益值為1。
[0169] (2)對(duì)照品儲(chǔ)備液:精密稱(chēng)取蘆丁、異槲皮苷、水仙苷、3-0- {2-0- [ 6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)_葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、 3-0- {2-0- [ 6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、山奈酚-7-O-0-D-葡 萄糖苷、山奈酚-3-0-蕓香糖苷、銀杏內(nèi)酯A(GA)、銀杏內(nèi)酯B(GB)、銀杏內(nèi)酯C(GC)對(duì)照品 5mg，分別加甲醇配成濃度為lmg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，置4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0170] (3)樣品制備:將舒血寧注射液以1400(^.1^11_1的速度離心1〇111111，取上清液，將上 清液再以14000r .mirT1的速度離心10min，取上清液，作為舒血寧注射液樣品儲(chǔ)備液置4°C冰 箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0171] (4)標(biāo)準(zhǔn)曲線:將上述蘆丁對(duì)照品配制成濃度為250ug/ml，水仙苷、山奈酚-3-0-蕓 香糖苷對(duì)照品配制成濃度為200iig/ml，3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]_ (1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)_葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素對(duì)照品濃度為l〇〇μg/ml，異槲皮苷、山奈酚-7-0-0-D-葡萄糖苷對(duì)照品濃度為50μg/ml的混合母液，并以0.6倍逐級(jí)稀釋成8個(gè)點(diǎn)。將GA、GB、GC 配制成濃度分別為250ug/ml的混合母液，并以0.7倍逐級(jí)稀釋成8個(gè)點(diǎn)。將上述兩混合母液 按照上述色譜條件進(jìn)樣15yl，記錄峰面積。ELSD條件下以進(jìn)樣濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以峰 面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)。求得11種化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，線性范圍及r值，線性關(guān)系 結(jié)果如表15不。
[0172] 表15線性關(guān)系結(jié)果
[0174] (5)精密度實(shí)驗(yàn):精密取適量舒血寧注射液供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣15yL，按 照上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次。峰面積的RSD在1.17%~3.97%，均小于5%。試驗(yàn)結(jié)果表 明：所建立的方法精密度良好。
[0175] (6)重復(fù)性實(shí)驗(yàn):精密取6份舒血寧注射液供試品溶液，按"上述色譜條件進(jìn)樣15y L，連續(xù)進(jìn)樣6次。計(jì)算各化合物峰面積，RSD在1.96 %~4.74%，均小于5 %。試驗(yàn)結(jié)果表明： 測(cè)定方法重現(xiàn)性良好。
[0176] (7)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取同一批供試品溶液，分別在0,2,4,8，12,2處后按照上述色譜條 件，進(jìn)樣15yL，測(cè)定化合物峰面積。結(jié)果峰面積RSD在0.92~4.71 %，均小于5%，可見(jiàn)樣品在 24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
[0177] (8)加樣回收率試驗(yàn):將蘆丁、異槲皮苷、槲皮素-3-0-葡萄糖基（1-2)鼠李糖苷、 山奈酚-7-CH3-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-0-蕓香糖苷、水仙苷、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基_反_ 香豆酰)_葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、3-0-{2-0-[6-0-(對(duì)羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]_ (1-2)鼠李糖基}山奈酚、GA、GB、GC配制成濃度分別為650ug/ml、51μg/ml、173μg/ml、25yg/ ml、475μg/ml、413μg/ml、346μg/ml、273μg/ml、810iig/ml、760iig/ml、330iig/ml 的混合母液， 取100yl的混合溶液加入500yl的舒血寧注射液供試品溶液中，再加入400ul甲醇，渦旋，以 14000r/min的速度離心10min，取上清液，再以14000r/min的速度離心10min，取上清液，標(biāo) 為樣品1，平行6次，按色進(jìn)樣15此。另取樣品加甲醇稀釋一倍，渦旋，以14000r/min的速度離 心lOmin，取上清液，再以14000r/min的速度離心10min，取上清液標(biāo)為樣品2,平行3次，按色 譜條件進(jìn)樣15此。計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示回收率RSD值在0.56%~4.27%范圍以?xún)?nèi)，均 小于5%，平均回收率在95.0%~105.0%范圍內(nèi)，表明本方法的準(zhǔn)確度良好。
[0178] (9)含量檢測(cè)
[0179] 按照上述(3)所述條件處理樣品，按上述(1)所述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得峰面積，代入 相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)線，分別計(jì)算舒血寧注射液樣品中11種化合物的含量。樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表16。
[0180] 表16舒血寧注射液樣品含量測(cè)定結(jié)果
[0182]應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作 各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種采用雙檢測(cè)器的高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定舒血寧注射液中銀杏內(nèi)酯和黃酮苷 的含量的方法，其特征在于采用的色譜條件為：固定相是以十八烷基鍵合硅膠為填料的色 譜柱;洗脫流速為0.5~2. OmL/min;流動(dòng)相A是0.05 %四氫呋喃-0.1 %甲酸-5 %甲醇-水的 混合溶劑，體積比是〇 . 1~2:1~5:5~15:900~1000;流動(dòng)相B是0.1 %四氫呋喃-甲醇乙腈 溶液的混合溶劑，體積比為0.5~3:1000~1200,其中所述甲醇乙腈溶液為甲醇和乙腈體積 比1:1的溶液:進(jìn)行梯度洗脫，梯度條件為：5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述流動(dòng)相A，0.05%四氫呋 喃-0.1 %甲酸-5%甲醇-水的體積比是1:2:10:950。6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述的流動(dòng)相B，0.1%四氫呋 喃-甲醇乙腈溶液體積比為1:1 〇〇〇，其中所述甲醇乙腈溶液為甲醇和乙腈體積比1:1的溶 液。7. 根據(jù)權(quán)利要求1~6任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm。8. 根據(jù)權(quán)利要求1~7任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述洗脫流速為lmL/min。9. 根據(jù)權(quán)利要求1~8任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述漂移管溫度為IKTC。10. 根據(jù)權(quán)利要求1~9任意一項(xiàng)所述的方法，所述載氣流速為2.5L/min。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK105891356SQ201610199982
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年3月31日
【發(fā)明人】常艷旭, 高秀梅, 田吉, 李晉, 巴曉雨, 張綱, 李志剛, 關(guān)秀偉
【申請(qǐng)人】河北神威藥業(yè)有限公司, 神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司