一種動態(tài)示蹤監(jiān)測動物體內(nèi)煙堿及其代謝物的分析方法
【專利摘要】一種動態(tài)示蹤監(jiān)測動物體內(nèi)煙堿及其代謝物的分析方法，其特征在于：使用吡啶環(huán)2H標記的煙堿（[2H4]?(±)?Nicotine）與未標記的煙堿等比例混合后暴露動物，利用微透析系統(tǒng)分別收集血、腦透析液樣品于微量離心管中，加入分析內(nèi)標短時低速離心后，直接上樣超高效液相色譜?軌道阱高分辨質(zhì)譜分析檢測微透析樣品中的煙堿代謝物及其吡啶環(huán)2H標記物，根據(jù)試驗結(jié)果鑒定煙堿代謝物并繪制相應(yīng)的時間?濃度曲線進行動態(tài)監(jiān)測分析。本發(fā)明的優(yōu)點在于：能準確示蹤鑒定出動物體內(nèi)的多種煙堿代謝物，極大地簡化了樣品前處理步驟，實現(xiàn)了動物體內(nèi)不同系統(tǒng)中煙堿代謝物變化的準確分析與同步比較，開創(chuàng)了一種新的用于動物體內(nèi)煙堿代謝研究的方法。
【專利說明】
一種動態(tài)示蹤監(jiān)測動物體內(nèi)煙堿及其代謝物的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及動物體內(nèi)煙堿代謝分析的方法。本方法采用穩(wěn)定同位素示蹤煙堿代謝 過程，通過微透析技術(shù)同步收集大鼠腦組織和血液樣品，利用超高效液相色譜-軌道阱高分 辨率質(zhì)譜對樣品中煙堿代謝物進行示蹤檢測分析，從而全面地揭示煙堿在動物體內(nèi)的代謝 特征。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙堿(Nicotine，Nic)是煙草的重要特征成分，煙堿依賴的發(fā)生與個體對煙堿的 代謝能力密切相關(guān)。盡管攝入體內(nèi)的煙堿會迅速透過血腦屏障進入腦組織，但是機體對煙 堿的代謝大部分是在肝臟完成的。煙堿的轉(zhuǎn)化代謝過程主要包括氧化，N-去甲基化，羥基化 以及與葡苷核酸的加合過程，可分為幾個階段:第一階段，70-80%的煙堿通過C-氧化轉(zhuǎn)化為 可替寧（Cotinine，Cot);第二階段，一少部分的煙堿和可替寧通過/V-氧化、去甲基化和葡 苷核酸化分別轉(zhuǎn)化為煙堿氮氧化物(nicotine-〗V'_oxide，NN0)，降煙堿(nornicotine， NorNic),煙喊糖苷（nicotine-^V - glucuronide, Nic-Gluc)和可替寧氮氧化物 (cotinine-/V-oxide, CN0),降可替寧（norcotinine, NorCot),可替寧糖苷（cotinine-A^glucuronide, Cot-Glue)。此外，可替寧還可通過羥基化轉(zhuǎn)化為生成反-3'羥基可替寧 Umns-3 '-hydroxycotinine，0H-Cot)，并進一步通過糖苷化作用最終形成少量的反-3 ' 羥基可替寧糖苷（/mns- 3'-hydroxycotinine-〇- glucuronide, OH-Cot-Gluc)。另外，研 究者還證明小部分的煙堿在吸煙者體內(nèi)還可轉(zhuǎn)化形成為吡啶基羥基酸（4-〇1〇-4-(3-pyridyl)- butanoic acid，0xPyBut)和P比啶基丁酮酸（4_hydroxy-4- (3-pyridyl)-butanoic acid，HyPyBut)。實際上，據(jù)報道煙堿在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為20余種代謝產(chǎn)物，但是絕大 部分的研究將煙堿代謝產(chǎn)物的測定分析限于10種左右或以內(nèi)，因為同時測定這些較為常見 的代謝產(chǎn)物可以覆蓋推算攝入體內(nèi)90%以上的煙堿。煙堿及其代謝產(chǎn)物尤其是可替寧作為 衡量人體煙氣暴露程度和區(qū)分吸煙者和非吸煙者的生物標志物，已經(jīng)受到研究者的廣泛關(guān) 注。
[0003] 目前關(guān)于煙堿代謝研究采用的分析方法有酶聯(lián)免疫法、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS) 法、高效液相色譜(HPLC)法、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)法、高壓放射色譜法等，關(guān)于樣品的采 集方式有血液、尿液、唾液、腦組織等離體樣品和結(jié)合微透析技術(shù)的活體采樣等。然而，這些 研究都存在著一定的不足或局限性。首先是對于煙堿在體內(nèi)尤其是腦組織內(nèi)的代謝產(chǎn)物未 能給出明確而完整的信息，使得研究者至今不十分清楚腦內(nèi)的煙堿代謝產(chǎn)物是否一樣多而 復(fù)雜 。Paula等[參考文南犬 1 :Paula L. Vieira-Brock, Eleanor I. Miller, Shannon M. Nielsen, et al. Simultaneous quantification of nicotine and metabolites in rat brain by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2011, 879: 3465-3474.]利用固相萃取/液質(zhì)聯(lián)用法建立了同時測定 大鼠腦組織內(nèi)煙堿代謝物的方法，但僅給出了大鼠腦組織內(nèi)煙堿、Cot和NorNic的含量信 息;早先的研究利用放射性同位素標記的[ 14C-AHnethyl]煙堿結(jié)合高壓放射色譜法在小鼠 腦內(nèi)鑒定出了 [14c]可替寧和[14c]煙堿氮氧化物，但是煙堿的〗V-去甲基化代謝產(chǎn)物（如 NorNic和NorCot)則因為代謝過程中元素放射性的丟失而未檢測出；Omar等[參考文獻2: Omar A. Ghosheh， Linda. P. Dwoskin, Dennis. K. Miller, Peter. A. Crooks. Metabolites of nicotine in rat brain after peripheral nicotine administration [J]. Drug Metabolism and Disposition，1997，25(1): 47-54.]研究了皮下注射[2， -14C ]煙堿后小鼠腦內(nèi)的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)大鼠腦內(nèi)Cot、NorNi c和NorCot的含量在ng/mL級，而 且腦內(nèi)尚存在其它未能鑒定的代謝物;毛健等人[參考文獻3:毛健，盧劍清，徐妍等.微透 析-UPLC-MS/MS法同時測定活體大鼠腦內(nèi)煙堿及其代謝物[J].煙草科技，2014，（5): 37-41.]最近的研究表明大鼠腦內(nèi)存在Cot、NorNic、NorCot、NN0和OH-Cot五種代謝物。其次，大 多數(shù)的研究僅注重于靜態(tài)測定單一系統(tǒng)內(nèi)的煙堿代謝產(chǎn)物，鮮有進行血、腦多系統(tǒng)內(nèi)的動 態(tài)測定及同步比較分析。盡管Chang等人[參考文獻3:Yuh_Lih Chang, Pi-Lo Tsai, Yueh-Ching Chou, et al? Simultaneous determination of nicotine and its metabolite, cotinine， in rat blood and brain tissue using microdialysis coupled with liquid chromatography: pharmacokinetic app1ication[J]. Journal of Chromatography A，2005，1088: 152-157.]和公開發(fā)明專利（動物血、腦樣品中痕量煙 堿及其主要代謝物的同步分析方法.專利申請?zhí)?01410257438. 8.)報道了利用微透析技 術(shù)結(jié)合液相色譜或質(zhì)譜的方法對大鼠血、腦內(nèi)煙堿進行動態(tài)測定和同步分析，但是僅限于 給出煙堿及可替寧的變化特征信息。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對目前煙堿代謝研究方法的不足，而專門開發(fā)的一種動態(tài)示蹤 監(jiān)測動物體內(nèi)煙堿及其代謝物的分析方法。本方法采用吡啶環(huán) 2H標記的煙堿（[2H4]-( ± )-Nicotine)示蹤煙堿代謝轉(zhuǎn)化過程，結(jié)合高分辨率質(zhì)譜手段不僅靈敏度高、能獲得準確的代 謝物分子質(zhì)量信息，還可利用吡啶環(huán) 2H標記的同位素峰與未標記的煙堿代謝物峰成對出現(xiàn) 的特征進一步確證煙堿在體內(nèi)尤其是腦組織內(nèi)的代謝產(chǎn)物信息，克服了放射性同位素標記 法檢測時靈敏度不高、放射性信號易丟失等缺點；另外，本方法還利用微透析采樣技術(shù)，實 現(xiàn)了樣品的直接進樣分析和對煙堿在活體大鼠血、腦兩系統(tǒng)內(nèi)代謝的同步、動態(tài)分析。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種動態(tài)示蹤監(jiān)測動物體內(nèi)煙堿及 其代謝物的分析方法，采用煙堿與其吡啶環(huán)同位素標記物溶液同時暴露動物，利用微透析 系統(tǒng)同步收集動物血透析液及腦組織透析液樣品于不同的微型離心管中，加入分析內(nèi)標溶 液混勻離心后，采用超高效液相色譜-軌道阱高分辨質(zhì)譜分析檢測微透析樣品中的煙堿代 謝物及其吡啶環(huán) 2H標記物，根據(jù)試驗結(jié)果鑒定煙堿代謝物并繪制相應(yīng)的時間-濃度曲線進 行動態(tài)監(jiān)測分析。
[0006] 該方法具體步驟如下： a.煙堿暴露:采用等比例混合的煙堿與吡啶環(huán)2H標記的煙堿溶液以外周注射方式暴 露動物。
[0007] b.微透析樣品收集：同步且分別收集動物攝入煙堿后的血液微透析樣品和腦微 透析樣品于不同的微型離心管中（該微型管既能與微透析樣品收集系統(tǒng)配套使用又能與色 譜進樣瓶配套使用），使得每管中樣品為30yL。
[0008] C.分析內(nèi)標溶液配制：以穩(wěn)定同位素Nic-d3作為分析內(nèi)標物，準確稱取lOmg置于 100mL容量瓶中，用甲醇/水(體積比50/50，下同）溶液稀釋至刻度，搖勻，得濃度為100yg/mL 的內(nèi)標儲存溶液;再采用逐級稀釋法配制濃度為20ng/mL的內(nèi)標工作溶液。
[0009] d.混合標準溶液配制：分別稱取附(3、(：(^川(^附(3、順0、011-(：(^川(^(：〇扒0勵、附(3-Gluc、Cot-Gluc、OH-Cot_Gluc、OxPyBut和HyPyBut各標準品，配制具有濃度梯度的系列混合 標準溶液，并加入內(nèi)標工作溶液，使內(nèi)標物的濃度為5ng/mL。具體方式為:準確稱取標準品 各l〇mg，分別置于100mL容量瓶中，用甲醇/水溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度各為100 yg/mL的標準儲備溶液;分別移取10.0 mL的標準儲備溶液，置于同一支100mL容量瓶中，用甲 醇/水稀釋至刻度，搖勻，得一級混合標準溶液;移取l.OmL的一級混合標準溶液，置于另一 100mL容量瓶中，用甲醇/水稀釋至刻度，搖勻，得濃度為100ng/mL二級混合標準溶液;準確 移取0 ? 05、0 ? 10、0 ? 50、1 ? 00、5 ? 00、10 ? 0和50 ? OmL二級混合標準溶液，分別置于不同的100mL 容量瓶中，各加入25. OmL內(nèi)標工作溶液，用濾過的林格氏液稀釋至刻度，搖勻，得到濃度均 為0 ? 05、0 ? 10、0 ? 50、1 ? 00、5 ? 00、10 ? 0和50 ? 0ng/mL的系列混合標準溶液。
[0010] e.標準曲線繪制:將系列混合標準溶液按由低到高的濃度順序進行超高效液相 色譜-軌道阱高分辨率質(zhì)譜分析，以各目標分析物的色譜峰面積與內(nèi)標峰面積之比CF)對其 相應(yīng)的濃度(X)進行線性回歸，得到標準曲線回歸方程。
[0011] f.樣品檢測及數(shù)據(jù)處理:將10此濃度為20ng/mL的內(nèi)標工作溶液分別加入到血、腦 透析液樣品中，混勻后l〇〇〇r/min低速離心10s后上樣分析。利用準確分子量[M]峰與同位素 [M+4]峰匹配出現(xiàn)的特征鑒定樣品中目標物，根據(jù)標準曲線法計算透析液樣品中各目標物 的含量，依據(jù)結(jié)果分別繪制煙堿注射后各時間點血、腦內(nèi)代謝物的濃度_時間變化曲線，并 進行藥代動力學(xué)分析，揭示煙堿在大鼠體內(nèi)的代謝規(guī)律。
[0012] 本發(fā)明一方面利用吡啶環(huán)氘代標記的煙堿暴露動物，能夠示蹤監(jiān)測煙堿在動物體內(nèi)的 代謝變化過程，另一方面還利用軌道阱高分辨率質(zhì)譜，不僅能準確地測定目標物的分子量 從而實現(xiàn)煙堿代謝物類別的鑒定，同時還具有靈敏度高、定量分析結(jié)果準確的特點。利用本 發(fā)明的技術(shù)方案不僅鑒定出動物腦內(nèi)存在8種煙堿代謝物，取得了明顯進步，還實現(xiàn)了外周 及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)煙堿代謝過程的同步、動態(tài)監(jiān)測，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有靈敏準確，結(jié)果可 靠等特點，開創(chuàng)了一種新的用于動物體內(nèi)煙堿代謝監(jiān)測的方法。
[0013]
【附圖說明】
[0014] 圖1為實施例中的大鼠血、腦內(nèi)Ni c的濃度隨時間變化趨勢圖。
[0015] 圖2為實施例中的大鼠血、腦內(nèi)Cot的濃度隨時間變化趨勢圖。
[0016] 圖3為實施例中的大鼠血、腦內(nèi)NorNic的濃度隨時間變化趨勢圖。
[0017 ]圖4為實施例中的大鼠血、腦內(nèi)NN0的濃度隨時間變化趨勢圖。
[0018]圖5為實施例中的大鼠血、腦內(nèi)NorCot的濃度隨時間變化趨勢圖。
[0 0 19 ]圖6為實施例中的大鼠血、腦內(nèi)0 H- C 〇 t的濃度隨時間變化趨勢圖。
[0020]圖7為實施例中的大鼠血、腦內(nèi)CN0的濃度隨時間變化趨勢圖。
[0021 ]圖8為實施例中的大鼠血液內(nèi)Nic-Gluc的濃度隨時間變化趨勢圖。
[0022]圖9為實施例中的大鼠血液內(nèi)Cot-Glue的濃度隨時間變化趨勢圖。
[0023]圖10為實施例中的大鼠血液內(nèi)OH-Cot-Gluc的濃度隨時間變化趨勢圖。
[0024]圖11為實施例中的大鼠血液內(nèi)OxPyBut的濃度隨時間變化趨勢圖。
[0025]圖12為實施例中的大鼠血液內(nèi)HyPy But的濃度隨時間變化趨勢圖。
[0026]
【具體實施方式】
[0027]本發(fā)明結(jié)合以下實施例做進一步描述，但并不限制本發(fā)明。
[0028] 實施例1 雄性成年SD正常大鼠，10周齡，體重(200 ± 20)g，采用獨立隔離飼養(yǎng)籠具飼養(yǎng)，自由 進水，標準顆粒進食。大鼠以1%戊巴比妥，按50 mg/kg劑量腹腔注射麻醉。借助立體定位儀 定位，于大鼠腦紋狀體內(nèi)埋入探針套管。24 h后，在大鼠清醒自由活動狀態(tài)下插入微透析探 針（CMA/12)。對于血液微透析樣品收集，需將微透析探針（CMA/20)植入大鼠右心房頸靜 脈。采用濾過的林格氏液(復(fù)方氯化鈉注射液）以1.5 iiL/min的速度灌流，平衡120 min后開 始收集樣品于微型離心管(既能與微透析樣品收集系統(tǒng)配套使用又能與色譜進樣瓶配套使 用）中，4°C下每20 min各同步收集1管腦、血透析液。于第4管收集結(jié)束時，腹腔注射煙堿及 [%]-煙堿混合溶液(采用林格氏液配制，煙堿及[ 2H4]_煙堿濃度均為0.5mg/mL，注射劑量 均為1 mg/kg)，繼續(xù)在4°C下按每20 min收集透析液。收集好的每管透析液樣品加入lOyL濃 度為20ng/mL的內(nèi)標工作溶液，1000r/min低速離心10s后直接上樣UPLC-Q Exactive檢測。 [0029] 色譜條件 色譜柱：Waters Atlantis HILIC Silica (3 X100 mm, i. d. , 3 ym)〇 [0030] 柱溫:30 °C;流動相:A:10 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸，），B:乙腈(含0.1% 甲酸）;流速:0.6 mL/min;梯度洗脫條件見表1;進樣量:10 yL;柱平衡時間為2 min。
[0031]表1梯度洗脫條件
質(zhì)譜條件 離子源：加熱型電噴霧（HESI);離子源溫度：300 °C ;正離子模式下電噴霧電壓：3.5 kV;鞘氣：206.85 kPa;輔助氣流速：3.33 L/min;傳輸毛細管溫度：320 °C;掃描模式:FS/ ddMS2(全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描），一級全掃描（分辨率/?=70000,掃描質(zhì)量范圍50~400 m/z)，二級掃描分辨率/?=17500。
[0032] 標準曲線的建立 將系列混合標準溶液按由低到高的濃度順序進行UPLC-MS/MS分析，以各目標物的色譜 峰面積與分析內(nèi)標峰面積之比CF)對其相應(yīng)的濃度(X)進行線性回歸，得到標準曲線回歸方 程。
[0033]測定結(jié)果 采用高分辨率質(zhì)譜對大鼠透析液樣品中煙堿代謝物及其對應(yīng)的吡啶環(huán)2H標記代謝物 進行定性檢測，由表2可見依據(jù)軌道阱高分辨率質(zhì)譜提供的精確分子量可對樣品中的目標 物進行準確的測定。根據(jù)目標物及其吡啶環(huán) 2H標記物的配對出峰結(jié)果可以看出，大鼠外周 血系統(tǒng)中可檢測出全部的11種目標代謝物，而腦組織中除糖苷類代謝物外可鑒定出8種代 謝產(chǎn)物，結(jié)果如表3所示。
[0034]表2目標物及其吡啶環(huán)2H標記代謝物的質(zhì)子化離子質(zhì)量
表3大鼠透析液中煙堿代謝物及吡啶環(huán)2H標記代謝物的鑒定結(jié)果
注："+"表示兩者均可檢測到，表示兩者均未出現(xiàn)信號響應(yīng)。
[0035] 將血、腦透析樣品測定的目標物峰面積與分析內(nèi)標峰面積比，與相應(yīng)的工作曲線回歸 方程進行擬合計算測定含量，再通過透析回收率計算出各目標物在大鼠體內(nèi)的含量，并繪 制濃度隨時間的變化趨勢曲線，進行藥代動力學(xué)分析。
【主權(quán)項】
1. 一種動態(tài)示蹤監(jiān)測動物體內(nèi)煙堿及其代謝物的分析方法，其特征在于:采用煙堿與 其吡啶環(huán) 2H同位素標記物溶液同時暴露動物，利用微透析系統(tǒng)同步收集動物血透析液及腦 組織透析液樣品于不同的微型離心管中，加入分析內(nèi)標后，采用超高效液相色譜-軌道阱高 分辨質(zhì)譜分析檢測樣品中的煙堿代謝物及其吡啶環(huán) 2H標記物，根據(jù)試驗結(jié)果鑒定煙堿代謝 物并繪制相應(yīng)的時間-濃度曲線進行動態(tài)監(jiān)測分析;具體包括以下步驟： a. 采用等比例混合的煙堿與吡啶環(huán)2H標記的煙堿溶液以外周注射方式暴露動物； b. 同步且分別收集動物攝入煙堿后的血液微透析樣品和腦微透析樣品于不同的微型 離心管中，該離心管既能與微透析樣品收集系統(tǒng)配套使用又能與色譜進樣瓶配套使用； c. 分析內(nèi)標溶液配制：以穩(wěn)定同位素 Nic-Cl3作為分析內(nèi)標物，配制濃度為20ng/mL的內(nèi) 標工作溶液； d ·混合標準溶液配制：分別準確稱取附。、(：(^川(^附(3、順0、0!1-(：〇丨、1*^(：〇丨、0勵、附(3-Gluc、Cot-Gluc、OH-Cot_Gluc、OxPyBut和HyPyBut標準品，配制濃度梯度的系列混合標準溶 液，并各加入內(nèi)標工作溶液，使內(nèi)標物的濃度為5ng/mL，混合標準溶液的濃度為0.05、0.10、 0.50、1.00、5.00、10.(^P50.0ng/mL; e. 標準曲線繪制:將系列混合標準溶液按由低到高的濃度順序進行分析，以各目標分 析物的色譜峰面積與內(nèi)標峰面積之比CF)對其相應(yīng)的濃度(X)進行線性回歸，得到標準曲線 回歸方程； f. 樣品檢測及數(shù)據(jù)處理:將步驟b收集的微型離心管置于色譜進樣瓶內(nèi)，加入IOyL濃度 為20ng/mL的混合內(nèi)標工作溶液，短時低速離心后上樣分析;利用準確分子量[M]峰與同位 素[M+4]峰匹配出現(xiàn)的特征鑒定樣品中目標物，根據(jù)標準曲線法計算透析液樣品中各目標 物的含量，依據(jù)結(jié)果分別繪制血、腦內(nèi)各代謝物的濃度-時間變化曲線，并進行藥代動力學(xué) 分析，揭示煙堿在大鼠體內(nèi)的代謝規(guī)律。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種動態(tài)示蹤監(jiān)測動物體內(nèi)煙堿及其代謝物的分析方法，其 特征在于:色譜條件、質(zhì)譜條件具體如下： 色譜柱:Waters Atlantis HILIC Silica，規(guī)格3 X100 mm, i. d.，3 μπι; 柱溫:30 °C;流動相:Α:10 mmol/L乙酸銨水溶液，該水溶液中含0.1%甲酸，Β:含0.1% 甲酸的乙腈;流速:0.6 mL/min;梯度洗脫;進樣量:10 yL;柱平衡時間為2 min; 質(zhì)譜條件 離子源：加熱型電噴霧（HESI);離子源溫度：300 °C ;正離子模式下電噴霧電壓：3.5 1^;鞘氣：206.85 1^&;輔助氣流速:3.33 171^11;傳輸毛細管溫度:320 °(：;掃描模式:全掃 描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描FS/ddMS2，一級全掃描分辨率治70000，二級掃描分辨率治17500。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種動態(tài)示蹤監(jiān)測動物體內(nèi)煙堿及其代謝物的分析方法，其 特征在于:梯度洗脫條件見表1; 表1梯度洗脫條件 __ 時間(min) I流動相A(%) I流動相B(%) _0__5__95_ _2__15__85_ _5__25__75_ 5.5__5__95_ 8 I 5 I 95 ο4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種動態(tài)示蹤監(jiān)測動物體內(nèi)煙堿及其代謝物的分析方法，其 特征在于:f步驟中的短時低速離心具體為l〇〇〇r/min離心10s。
【文檔編號】G01N27/62GK105891357SQ201610203370
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月5日
【發(fā)明人】毛健, 李鵬, 盧斌斌, 孫世豪, 劉俊輝, 王丁眾, 張文娟, 柴國璧, 張啟東, 曾世通, 張建勛
【申請人】中國煙草總公司鄭州煙草研究院