一類阿片和神經(jīng)肽ff受體的多靶點(diǎn)肽類分子及其制備和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一類阿片和神經(jīng)肽FF受體的多靶點(diǎn)多肽，是在基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽BN?9的基礎(chǔ)上進(jìn)行氨基酸替換，獲得一系列能夠同時激活阿片和NPFF系統(tǒng)多種受體的多靶點(diǎn)多肽。通過體外cAMP功能鑒定、在體鎮(zhèn)痛活性以及中樞副作用等藥理學(xué)活性的鑒定，表明，該類多靶點(diǎn)多肽能同時激活阿片和神經(jīng)肽FF受體，具有高效的鎮(zhèn)痛活性且不會出現(xiàn)鎮(zhèn)痛耐受現(xiàn)象，并且在體溫、胃腸運(yùn)動、心血管活性等方面表現(xiàn)出低副作用的優(yōu)點(diǎn)。因此，該類多靶點(diǎn)多肽在制備臨床鎮(zhèn)痛藥物方面具有很高的應(yīng)用價值。
【專利說明】
一類阿片和神經(jīng)肽FF受體的多靶點(diǎn)肽類分子及其制備和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一類同時激活阿片和神經(jīng)肽FF受體的多靶點(diǎn)多肽及其制備方法，本發(fā) 明同時涉及該類多靶點(diǎn)多肽在制備高效、低副作用鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用，屬于生物化學(xué)的多 肽藥物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 疼痛是一種復(fù)雜的生理心理活動。生理狀態(tài)的疼痛可作為一種機(jī)體受到傷害的警 告，但病理性的慢性疼痛或持續(xù)性的劇烈疼痛對機(jī)體來說是一種難以承受的折磨。所以鎮(zhèn) 痛是醫(yī)務(wù)工作者面臨的重要任務(wù)。臨床上，阿片類鎮(zhèn)痛藥物例如嗎啡、芬太尼等被廣泛應(yīng)用 于治療和緩解各種劇烈疼痛，比如手術(shù)后痛、癌痛等。但由于阿片類的鎮(zhèn)痛藥物能引起嚴(yán)重 的耐受、成癮、便秘和呼吸抑制等不良反應(yīng)，而大大限制其臨床應(yīng)用范圍。
[0003] 近年來，多靶點(diǎn)阿片類分子的構(gòu)建為研發(fā)全新的高效低副作用的阿片類鎮(zhèn)痛藥提 供了新的思路。已有的研究表明，基于阿片與其它系統(tǒng)的配體而構(gòu)建全新的多靶標(biāo)藥物，使 其同時作用于多個作用位點(diǎn)，在發(fā)揮阿片鎮(zhèn)痛活性的同時通過其他系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用來降低 其副作用。比如，F(xiàn)oran等人基于阿片肽EM-2和速激肽P物質(zhì)（SP)而成功地設(shè)計(jì)構(gòu)建了一類 全新的雜合肽ESP7(Tyr-Pr〇-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2)(Proc· Nat. Acad. Sci. U.S.A. 2000， 97:7621)。
[0004] 多肽是氨基酸以肽鍵連接在一起形成的化合物。多肽中氨基酸的缺失、增加、構(gòu)型 的改變或被替換，多肽序列中氨基酸側(cè)鏈以及多肽C-或N-末端被化學(xué)基團(tuán)修飾都會對多肽 化合物原有的生物活性產(chǎn)生不可預(yù)知的改變。所以對多肽化合物進(jìn)行氨基酸的修飾和替換 以篩選出活性更高的化合物是多肽藥物研發(fā)中非常重要的一個環(huán)節(jié)。
[0005] ZL201210098832.2公開了一種以高效阿片配體Biphalin和神經(jīng)肽FF為化學(xué)模板， 在保留阿片高效激動劑和神經(jīng)肽FF "關(guān)鍵藥效團(tuán)"的基礎(chǔ)上構(gòu)建了全新的阿片/NPFF系統(tǒng)嵌 合肽嵌合肽1^-9(1}^-〇.八13-617-?116-6111-?1'〇-6111-八找-?116-圓2)。體內(nèi)痛覺調(diào)節(jié)、耐受和 胃腸運(yùn)動等一系列的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明：本發(fā)明基于阿片肽Biphal in和NPFF的嵌合肽BN-9表 現(xiàn)出比嗎啡更強(qiáng)的中樞鎮(zhèn)痛活性，并具有無鎮(zhèn)痛耐受、對胃腸運(yùn)動影響小等優(yōu)點(diǎn)，有效克服 了阿片類鎮(zhèn)痛藥物普遍存在的耐受和便秘等副作用問題。但是該嵌合肽BN-9的鎮(zhèn)痛作用強(qiáng) 度和藥效時間不夠理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的主要目的是為了進(jìn)一步提高阿片/NPFF系統(tǒng)嵌合肽BN-9的鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)度 和藥效時間，提供一類高效鎮(zhèn)痛、低副作用的基于阿片與NPFF受體的多靶點(diǎn)多肽； 本發(fā)明的另一目的是提供上述多靶點(diǎn)多肽的合成方法； 本發(fā)明還有一個目的，就是通過提供上述多靶點(diǎn)多肽在受體激動、小鼠光熱甩尾和模 擬臨床痛模型中的鎮(zhèn)痛作用以及在鎮(zhèn)痛耐受、心血管、胃腸運(yùn)動和體溫調(diào)節(jié)等方面的藥理 學(xué)活性，以期在鎮(zhèn)痛藥物制備中得到應(yīng)用。
[0007] (一)基于阿片和神經(jīng)肽FF受體的多靶點(diǎn)多肽 本發(fā)明的多靶點(diǎn)多肽，是在基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽BN-9的基礎(chǔ)上進(jìn)行氨 基酸替換或剪切的，獲得一系列能夠同時激活阿片和NPFF系統(tǒng)多種受體的多靶點(diǎn)多肽。其 結(jié)構(gòu)通式如下： Xaai-D-Ala-Gly- Xaa2- Xaa3-Pr〇-Gln_ Arg- Phe_NH2 其中 Xaai為 Tyr 或 NMe-Tyr ;Xaa2 為 Phe 或 Mfe-Phe ;Xaa3為 Gln、Gly、Leu、Met、D_Met、D-Leu或D_Ala〇
[0008] XaaiSNMe-Tyr，Xaa2為Phe，Xaa3為Gin時，多靶點(diǎn)多肽標(biāo)記為化合物1。
[0009] 乂331為了71乂332為匪6-?1^，乂333為6111時，多靶點(diǎn)多肽標(biāo)記為化合物2。
[001 0] XaadTyr，Xaa2為Phe，Xaa3為Gly時，多靶點(diǎn)多肽標(biāo)記為化合物3。
[0011] XaadTyr，Xaa2為Phe，Xaa3為Leu時，多靶點(diǎn)多肽標(biāo)記為化合物4。
[0012] Xaai為Tyr，Xaa2為Phe，Xaa3為Met時，多靶點(diǎn)多肽標(biāo)記為化合物5。
[0013] Xaai為Tyr，Xaa2為Phe，Xaa3為D-Met時，多靶點(diǎn)多肽標(biāo)記為化合物6。
[0014]父&&1為了71乂&&2為?1^，乂&&3為0-1^11時，多靶點(diǎn)多肽標(biāo)記為化合物7。
[0015] Xaai為Tyr，Xaa2為Phe，Xaa3為D-Ala時，多靶點(diǎn)多肽標(biāo)記為化合物8。
[0016] 乂&31為了71乂332為匪6-?1^，乂33 3為617時，多靶點(diǎn)多肽標(biāo)記為化合物9。
[0017] 上述各化合物的氨基酸序列如表1所示：
(二)阿片和神經(jīng)肽FF受體多靶點(diǎn)多肽的制備 本發(fā)明多靶點(diǎn)多肽的合成方法，包括以下工藝步驟： I.多肽的合成 I. i:樹脂預(yù)處理:Rink-Amide-MBHA樹脂在二氯甲烷中攪拌，使樹脂充分溶脹后減壓抽 干溶劑;最后加入DMF洗滌。
[0018] Μ?脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù):在溶脹、抽干溶劑的樹脂中，加入體積比為1 : 1 : 98的 六氫吡啶、1，8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯、DMF的混合溶液，攪拌反應(yīng)5 min后抽干，重復(fù)3次； 最后加入DMF洗滌，茚檢，得到脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂。
[0019] 氨基酸的縮合：依次將^€^111〇(3保護(hù)氨基酸?111〇(344-0!1川-羥基苯并三氮 唑、ο-苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基脲-六氟磷酸鹽完全溶解于DMF中，再加入二異丙基乙 胺后混勻得混合溶液;然后加到步驟l.i所得脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂中，在氬氣保護(hù)下攪 拌反應(yīng)60 min，抽干溶劑；用DMF重復(fù)洗滌、抽干，茚檢后按步驟I:.ii的工藝脫除Fmoc基團(tuán)保 護(hù)，得到脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的肽樹脂。
[0020] 所述Fmoc-ΑΑ-ΟΗ與脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂的摩爾量為1:2~1: 5。所述Fmoc-AA- 〇H、N-羥基苯并三氮唑、0-苯并三氮唑-N，N，N'，N'_四甲基脲-六氟磷酸鹽、二異丙基乙胺的 摩爾比為
[0021] 丨·沁肽鏈的延長 根據(jù)多肽化合物1-9的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，從C端開始依次選擇Ν-α-Fmoc保護(hù)的氨基酸，并將步 驟I、Μ所得脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的樹脂按步驟I;.Si的工藝完成肽鏈的縮合，得到側(cè)鏈全保護(hù) 的肽樹脂。所用到的氨基酸有 Fmoc-Tyr(tBu)-〇H、Fmoc-NMe-Tyr(tBu)-〇H、Fmoc-D-Ala-〇H、 Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Phe-〇H、Fmoc-MVIe-Phe-〇H、Fmoc-Gln(T;rt)-〇H、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-D-Leu-〇H、Fmoc-Met-〇H、Fmoc-D-Met-〇H、Fmoc-Pr〇-〇H、Fmoc-Arg(Pbf)-〇H、 Fmoc-Phe-〇H、Fmoc-Ala-〇H、Fmoc-D-Ala-〇H〇
[0022] Μ ·多肽從樹脂上的切割 將步驟Liv所得肽樹脂用DCM、Me0H交替洗，充分抽干溶劑后，加入切割劑(切割劑是由 三氟乙酸、三異丙基硅烷、水以95 : 2.5 : 2.5的體積比混合形成的溶液），于室溫下切割 反應(yīng)2~3小時;過濾，濾液在不高于37°C的條件下充分減壓旋干，然后用不高于_10°C的乙醚 析出沉淀;吸除上清液，加水充分溶解沉淀后將乙醚從水相中分離除去，水相通過冷凍干燥 得到白色的粗肽固體粉末。
[0023] 蔽.多肽的脫鹽和純化 以體積濃度15~20%乙酸溶液為流動相，過Sephadex G25交聯(lián)葡聚糖凝膠柱;利用紫外 檢測儀收集主峰后冷凍干燥，得脫鹽的肽化合物;再用反相高效液相色譜柱對脫鹽的肽化 合物進(jìn)行分離純化，經(jīng)分離后收集樣品主峰，得多靶點(diǎn)多肽產(chǎn)品。
[0024] 上述合成的一系列多靶點(diǎn)多肽的化學(xué)表征結(jié)果如表2所示：
注:體系1:梯度洗脫體系1為：10-100%乙腈/水(0.1% TFA) (30分鐘完成），流速為：1 mL/min，檢測波長為 220 nm，分析色譜柱為：XBridge ? BEH 130 Prep Ci8,4.6 mmX 250mm;體系2:梯度洗脫體系2為：10-80%乙腈/水(0.1% TFA) (30分鐘完成），流速為：1 mL/min，檢測波長為 220 nm，分析色譜柱為：XBridge ? BEH 130 Prep Ci8,4.6 mmX 250mm〇
[0025](三)阿片和神經(jīng)肽FF受體多靶點(diǎn)多肽的活性檢測 1、體外cAMP功能檢測實(shí)驗(yàn) 穩(wěn)定表達(dá)血-、〇61七&-、1(&??&-阿片受體以及即?? 1和即??2受體的冊1(293細(xì)胞中，通過 檢測該類阿片與NPFF受體的多靶點(diǎn)多肽對Forskolin引起的細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP)的 積累的調(diào)節(jié)來檢測它們對這五種受體的激動活性。
[0026] (l)cAMP功能檢測實(shí)驗(yàn)方法 將穩(wěn)定表達(dá)Mu-、Delta-、Kappa-阿片受體以及NPFFjPNPFF2受體的HEK293細(xì)胞以12 萬/孔的密度接種于24孔板中，于C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。實(shí)驗(yàn)開始時，將細(xì)胞培養(yǎng)液置換 為預(yù)熱的含1 mM IBMX的無血清培養(yǎng)基，37 °C孵育10 min。然后，每孔再加入不同濃度待測 藥物與5 μΜ forskolin(終濃度），37°C共孵育30 min。孵育結(jié)束后，將每孔中的溶液全部吸 出，使用500 yL 0.2 Μ的鹽酸，室溫下孵育30 min以裂解細(xì)胞。裂解完成后，每孔加入10 yL 10 Μ的NaOH溶液以中和裂解液。將每孔中的溶液用移液槍吹打均勻后轉(zhuǎn)移到離心管中， 12000 rpm離心2 min。每管吸取50 yL的上清液至干凈的離心管中，再加入100 yL 60 ug/μ L的PKA，而空白對照組中加入100 yL TE cAMP緩沖液。以上離心管中每管再加入50 yL 0.5 yCi [H3]cAMP，迅速混勻后，4 °C孵育大于2小時。孵育結(jié)束后，每管再加入100 yL活性炭懸 浮液，渦旋震蕩均勻后冰浴放置1 min，5000 rpm離心4 min。每管吸取離心后的上清液200 yL加入到24孔板中，每孔再加入700 yL閃爍液，之后用膠膜封閉24孔板，放置3小時后將其 置于閃爍儀上測量。
[0027] (2)計(jì)算cAMP的抑制值 cAMP的抑制效應(yīng)用藥物對Forsko 1 iη誘導(dǎo)的胞內(nèi)cAMP積累的抑制百分比（％ contro 1) 表不，％ control = (Forskolin處理的cAMP含量-待測藥物與Forskolin共處理的cAMP含 量)/ (Forskolin處理的cAMP含量-溶劑處理的cAMP含量）。相關(guān)的％ control數(shù)據(jù)用平均值 土標(biāo)準(zhǔn)誤(Means土S.E.M.)表示。藥物劑量效應(yīng)關(guān)系用非線性回歸模型統(tǒng)計(jì)，利用統(tǒng)計(jì)軟件 GraphPad Prism 5.0版本，分別計(jì)算出該類阿片與NPFF受體的多革E1點(diǎn)多肽對Forskolin引 起的細(xì)胞內(nèi)cAMP的積累抑制的EC 5Q值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。
[0028]在穩(wěn)定表達(dá)Mu-阿片受體的HEK293細(xì)胞系中，化合物1-9都能夠劑量依賴地抑制 forskolin引起的cAMP積累。說明化合物1-9對Mu-阿片受體都具有激動活性。在穩(wěn)定表達(dá) Kappa-阿片受體的HEK293細(xì)胞系中，除化合物7和化合物8外，其他化合物都能夠劑量依賴 地抑制f or sko 1 in引起的cAMP積累。說明化合物1 -6、9對Kappa阿片受體都具有激動活性。在 穩(wěn)定表達(dá)Delta-阿片受體的HEK293細(xì)胞系中，化合物1-9都能夠劑量依賴地抑制forskolin 引起的cAMP積累，說明化合物1-9對Delta-阿片受體都具有激動活性。在穩(wěn)定表達(dá)即??1受 體的HEK293細(xì)胞系中，化合物1-5和化合物9都能夠劑量依賴地抑制forskolin引起的cAMP 積累。說明化合物1-5和化合物9對NPFF2受體受體都具有激動活性?；衔?-8對NPFF2受體 受體都具有弱的激動作用而無法測出其完整的量效曲線，無法計(jì)算出其 EC5Q值。在穩(wěn)定表達(dá) NPFF2受體的HEK293細(xì)胞系中，化合物1-9都能夠劑量依賴地抑制forskolin引起的cAMP積 累。說明化合物1-9對NPFF 2受體都具有激動活性?；衔?-9對這5種受體在cAMP功能檢測 實(shí)驗(yàn)中的EC5Q值如表3所示。綜上所述，化合物1-9對阿片和NPFF系統(tǒng)的多種受體都具有激動 作用，是一類阿片和NPFF受體的多靶點(diǎn)多肽。
[0029] 2、光熱甩尾鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn) 通過側(cè)腦室、鞘內(nèi)以及腹腔注射藥物后，利用小鼠光熱甩尾實(shí)驗(yàn)進(jìn)行在體痛覺調(diào)節(jié)活 性的檢測。
[0030] (1)給藥方式 小鼠的側(cè)腦室給藥需提前進(jìn)行小鼠的側(cè)腦室埋管手術(shù)，以保證藥物注射位點(diǎn)的準(zhǔn)確 性。利用腦立體定位儀進(jìn)行小鼠的側(cè)腦室埋管。昆明系雄性小鼠，體重21 ± 2 g;腦立體定 位儀為江灣I型。小鼠用戊巴比妥鈉麻醉（i.P，80 mg/kg小鼠體重）后，將小鼠頭部手術(shù)區(qū) 剪去毛發(fā)，置于腦立體定位儀上固定后，手術(shù)區(qū)用碘伏消毒，沿矢狀縫切開頭皮，露出顱骨， 找到前囟位置。從前囟向后3 mm，向左/右1 mm，即為側(cè)腦室的上方位置。自制不銹鋼管(24- gauge的一段，上面接一小段PE-10管）按上述位置向下插入3 mm，即為側(cè)腦室。一段不銹鋼 琴弦（28-gauge)插入到上述鋼管中，以防止腦脊液外溢和外界雜物感染及堵塞鋼管。用醫(yī) 科牙托粉和膠水固定鋼管，凝固后，縫合傷口。手術(shù)后，小鼠恢復(fù)4天，第5天開始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)中涉及到的手術(shù)器械、不銹鋼管等均需在手術(shù)前消毒。小鼠側(cè)腦室每次注射4 μL藥物， 然后用1 μL生理鹽水沖洗鋼管。
[0031] 脊髓水平給藥采用清醒小鼠鞘內(nèi)注射法，具體操作參考Hylden和Wilcox已報(bào)道的 方法(Eur. J. Pharmacol. 1980，67: 313)。將25 yL微量進(jìn)樣器直接插入到L5和L6之間 的蛛網(wǎng)膜下腔。蛛網(wǎng)膜被刺破時伴隨著小鼠猛烈而明顯的甩尾動作或者尾巴呈"S"形，生理 鹽水或藥物以5 μΙ/10秒的速率注射至蛛網(wǎng)膜下腔中。
[0032] 腹腔給藥使用1 mL注射器直接注射，注射體積為10 μL/g體重。注射時，左手持小 鼠使其腹部朝上，頭低尾高。取腹中線的一側(cè)，使注射器針孔向上，針尖以小于20度的方向 刺入皮下，貼腹壁向小鼠頭部方向稍推進(jìn)針頭，再以45度方向刺入腹腔，回抽確認(rèn)沒有刺入 血管或腸道后緩慢推出藥液。
[0033] (2)小鼠光熱甩尾實(shí)驗(yàn) 使用昆明系雄性小鼠，利用光熱甩尾儀來檢測藥物對痛覺作用的影響。環(huán)境溫度控制 在22 ± TC，實(shí)驗(yàn)動物可自由進(jìn)食、飲水。給藥前先測定基礎(chǔ)甩尾潛伏期(3-5秒），過于敏 感或遲鈍的小鼠棄去不用。記錄給藥之后不同時間點(diǎn)的甩尾潛伏期。為防止?fàn)C傷，將10秒設(shè) 為最長甩尾潛伏期，甩尾時間超過10秒均以10秒來計(jì)。
[0034] (3)計(jì)算藥物鎮(zhèn)痛作用的MPE和ED50值 痛覺調(diào)節(jié)作用利用最大可能效應(yīng)MPE(maximum possible effect)值來評價，MPE( % )= 100 X [(給藥后的痛閾一基礎(chǔ)痛閾）/( 10秒一基礎(chǔ)痛閾）]iDso值表示藥物產(chǎn)生50%最大鎮(zhèn)痛 效應(yīng)時的藥物劑量。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 5.0版本，分別以最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)時間 點(diǎn)的MPE( % )值計(jì)算出它們鎮(zhèn)痛的ED5Q值和95%的置信區(qū)間。
[0035]側(cè)腦室給藥后對光熱引起的急性痛的鎮(zhèn)痛作用的ED5Q如表4所示，在小鼠甩尾模型 中，所有這9種化合物側(cè)腦室給藥后都能對急性熱痛產(chǎn)生顯著地鎮(zhèn)痛效果。除化合物1外，其 它8種化合物的鎮(zhèn)痛都低于1 nmol，尤其是化合物9的鎮(zhèn)痛ED5Q值只有16.3 pmol，為BN-9 (0.39歷〇1，21^201210098832.2)的23.9倍。
[0036]另外，我們進(jìn)一步的研究了化合物9在脊髓和系統(tǒng)水平給藥時的鎮(zhèn)痛作用，結(jié)果如 圖1和圖2所示。鞘內(nèi)給化合物9對光熱引起的急性痛能夠產(chǎn)生劑量依賴地鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛 ED5Q值為 1.33 pmol，并且在5 pmol時最大鎮(zhèn)痛MPE值為94.7%，為BN-9(0.29 nmol, ZL201210098832.2)的218倍。腹腔給化合物9對光熱引起的急性痛也能夠產(chǎn)生劑量依賴地 鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛值為26.58 mg/kg。
[0037] 3、鎮(zhèn)痛耐受實(shí)驗(yàn) 小鼠側(cè)腦室連續(xù)八天注射藥物，利用光熱甩尾法檢測它們的鎮(zhèn)痛耐受現(xiàn)象，進(jìn)一步探 討本發(fā)明所涉及的化合物在鎮(zhèn)痛耐受方面的藥理學(xué)活性。
[0038] (1)小鼠的痛覺耐受實(shí)驗(yàn)方法 昆明系雄性小鼠，側(cè)腦室連續(xù)注射藥物六天，每天注射一次，利用光熱甩尾儀來檢測藥 物連續(xù)注射對痛覺作用的影響。環(huán)境溫度控制在22 ± 1°C，實(shí)驗(yàn)動物可自由進(jìn)食、飲水。小 鼠側(cè)腦室連續(xù)6天注射檢測藥物，每次注射4 μL。第一天藥物注射前測定基礎(chǔ)甩尾潛伏期 (3-5秒），過于敏感或遲鈍的小鼠棄去不用。實(shí)驗(yàn)中記錄第一天和第六天給藥之后5、10、15、 20、30 min的甩尾潛伏期。為防止小鼠尾巴燙傷，將10秒設(shè)為最長甩尾潛伏期。
[0039] (2)耐受實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用MPE(maximum possible effect)表示，MPE(%)=100 X [(給藥后的痛閾一基 礎(chǔ)痛閾）/(10秒一基礎(chǔ)痛閾）]。藥物的鎮(zhèn)痛耐受作用利用相關(guān)藥物最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)時間點(diǎn)的 MPE值來進(jìn)行比較。MPE數(shù)據(jù)用平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤(Means 土 S.E.M.)來表示，小鼠六天鎮(zhèn)痛作 用的差異使用成對T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，#乍〈0.001表示與第一天注射該藥物的鎮(zhèn)痛作用相 比有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。
[0040] 每組小鼠為7-10只，鹽水組為空白對照組，側(cè)腦室注射藥物劑量分別為該藥物的3 倍ED5Q，而4 nmo 1嗎啡能產(chǎn)生相當(dāng)?shù)逆?zhèn)痛作用。圖3的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，小鼠連續(xù)六天側(cè)腦室注 射鹽水后，小鼠都不產(chǎn)生鎮(zhèn)痛活性。與鹽水對照組相比，第一天側(cè)腦室注射化合物1-9和嗎 啡后都顯著地延長了小鼠的甩尾潛伏期。小鼠連續(xù)側(cè)腦室注射嗎啡六天，其誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛作 用從第一天的86.97%降為36.15%，說明連續(xù)側(cè)腦室注射嗎啡能夠顯著地引起鎮(zhèn)痛耐受。與 嗎啡相比，連續(xù)側(cè)腦室注射化合物1-9六天后，其鎮(zhèn)痛的MPE值與第一天相比沒有明顯的變 化，說明化合物1-9都不產(chǎn)生鎮(zhèn)痛耐受現(xiàn)象，可有效避免阿片類鎮(zhèn)痛藥物常見的耐受副作 用。
[0041] 4、化合物9在福爾馬林模型痛中的鎮(zhèn)痛作用 (1)小鼠福爾馬林痛的檢測方法 將小鼠放入透明的有機(jī)玻璃盒中（20 X 20 X 30 cm)，適應(yīng)環(huán)境10-15 min;下面放 置傾斜30度的鏡子，以便于觀察小鼠的足部反應(yīng)。適應(yīng)結(jié)束后，小鼠側(cè)腦室、鞘內(nèi)或腹腔給 藥。給藥5 min后，在小鼠右后腳掌的足趾皮下注射20 yL 5%的福爾馬林溶液，迅速放回觀 察盒中。開始計(jì)時，分別記錄小鼠注射福爾馬林溶液后0-5 min及15-30 min內(nèi)小鼠藤、咬、 抖被注射足時間。
[0042] (2)福爾馬林痛實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用MPE(maximum possible effect)表示，MPE(%) = 100 X [(鹽水組藤足時 間一藥物組舔足時間）/鹽水組舔足時間]。相關(guān)的MPE數(shù)據(jù)用平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤(Means 土 S.E.M.)表示，不同藥物濃度處理的組間差異用單因素方差分析（one-way AN0VA的 Bonferroni檢驗(yàn))來進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析廣T〈 0.001表示藥物處理組的MPE值與生理 鹽水組之間存在顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4-6。
[0043]鹽水組為空白對照組，每組動物數(shù)為8-9只。福爾馬林痛第一相痛為化學(xué)刺激引起 的急性痛，第二相為炎性疼痛。如圖4-6所示，小鼠側(cè)腦室、鞘內(nèi)以及腹腔注射化合物9都能 劑量依賴地抑制福爾馬林誘導(dǎo)的第一相急性痛和第二相炎癥痛，從而表明化合物9在治療 化學(xué)刺激痛和炎癥痛方面具有潛在的應(yīng)用價值。
[0044] ED5Q值表示藥物產(chǎn)生50%最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)時的藥物劑量。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 5.0版本，分別以MPE(%)值計(jì)算出它們在側(cè)腦室注射誘導(dǎo)鎮(zhèn)痛的ED5Q值和95%的置信 區(qū)間。相關(guān)數(shù)據(jù)如表5所示。
[0045] 表5的結(jié)果表明側(cè)腦室注射化合物9的在福爾馬林第一相痛和第二相痛中的鎮(zhèn)痛 已05〇值分別為18.8和103.4?111 〇1，而側(cè)腦室注射8^9在福爾馬林痛第一相痛和第二相痛中 的鎮(zhèn)痛ED5〇值分別為0.12和 1.14 nmol(5r/PAarffiaco2. 2016，doi: 10.1111/ bph. 13489)。根據(jù)福爾馬林痛的ED5Q值可算出，化合物9在福爾馬林痛第一相痛和第二相痛 中的鎮(zhèn)痛作用分別為BN-9的6.3倍和11.0倍。
[0046] 5、化合物9在醋酸扭體的內(nèi)臟痛模型中的鎮(zhèn)痛作用 (1)小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)的檢測方法 將小鼠放入透明的有機(jī)玻璃盒中（20 X 20 X 30 cm)，適應(yīng)環(huán)境10-15 min;適應(yīng)結(jié) 束后，鞘內(nèi)或腹腔注射化合物9給小鼠待檢測藥物。5 min后，小鼠腹腔注射10 ml/kg 0.6% 的醋酸溶液。腹腔給醋酸溶液5 min后開始記錄小鼠的扭體反應(yīng)，記錄10 min。小鼠出現(xiàn)軀 干伸長扭曲、腹部內(nèi)凹、臀部抬高，后肢伸張等特征性反應(yīng)，記為一次扭體反應(yīng)。
[0047] (2)醋酸扭體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用MPE(maximum possible effect)表示，MPE(%)=100X [(生理鹽水組扭體 數(shù)-藥物組扭體數(shù)）/生理鹽水組扭體數(shù)]。相關(guān)的Μ I3 E數(shù)據(jù)用平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤（M e a n s 土 S.E.M.)表示，不同藥物濃度處理的組間差異用單因素方差分析（one-way AN0VA的 Bonferroni檢驗(yàn))來進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析廣T〈 0.001表示藥物處理組的MPE值與生理 鹽水組之間存在顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7-8。
[0048]鹽水組為空白對照組，每組動物數(shù)為8-9只。如圖7-8所示，小鼠鞘內(nèi)和腹腔注射化 合物9都能劑量依賴地對腹腔注射醋酸溶液誘導(dǎo)的內(nèi)臟痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。說明化合物9在治 療內(nèi)臟痛中具有潛在的應(yīng)用價值。
[0049] ED5Q值表示藥物產(chǎn)生50%最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)時的藥物劑量。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 5.0版本，分別以MPE( % )值計(jì)算出它們在側(cè)腦室注射誘導(dǎo)鎮(zhèn)痛的ED5Q值和95%的置信 區(qū)間。相關(guān)數(shù)據(jù)如表6所示：
6、化合物9在手術(shù)后痛模型中的鎮(zhèn)痛作用 (1)小鼠手術(shù)后痛的檢測方法 小鼠手術(shù)后痛主要使用電子Von Frey觸痛儀檢測，首先測定正常小鼠的基礎(chǔ)痛閾值， 然后將小鼠用異氟烷吸入麻醉。背部朝上，并將小鼠右后腳固定，用碘液消毒，距腳踝2 mm 處用11號刀片切開5 mm的縱向切口，露出跖肌、血管和筋膜，用4-0的手術(shù)縫合線和小號縫 合針將傷口縫合，涂上紅霉素軟膏。術(shù)后6 h測小鼠手術(shù)足的機(jī)械痛敏值，然后鞘內(nèi)或腹腔 給化合物9,記錄給藥之后不同時間點(diǎn)機(jī)械痛閾值。
[0050] (2)手術(shù)后痛的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤(Means 土 S.E.M.)表示不同藥物濃度處理的組間差異用 單因素方差分析（one-way AN0VA的Bonferroni檢驗(yàn)）來進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析，*P〈 0.001表示藥物處理組的MPE值與生理鹽水組之間存在顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9-10。 [00511 ED5Q值表示藥物產(chǎn)生50%最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)時的藥物劑量。首先計(jì)算出最大鎮(zhèn)痛效應(yīng) MPE(maximum possible effect)，MPE(%)=100 X [(給藥物后痛閾值-手術(shù)后痛敏值)/(基礎(chǔ) 痛閾值-手術(shù)后痛閾值）]。然后利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 5.0版本，分別以MPE(%)值 計(jì)算出它鞘內(nèi)和腹腔給藥后誘導(dǎo)鎮(zhèn)痛的值和95%的置信區(qū)間。
[0052] 鹽水組為空白對照組，每組動物數(shù)為8-9只。如圖9-10所示，小鼠鞘內(nèi)和腹腔注射 化合物9都能劑量依賴地對小鼠手術(shù)后痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用?；衔?鞘內(nèi)和腹腔給藥后對小鼠 手術(shù)后痛鎮(zhèn)痛的ED 5Q值分別為 8.63 (6.70-11.11) pmol 和 26.15 (22.62-30.23) mg/ kg。說明化合物9在治療手術(shù)痛中具有潛在的應(yīng)用價值。
[0053] 7、化合物9在角叉藻多糖炎癥痛模型中的鎮(zhèn)痛作用 (1)小鼠角叉藻多糖誘導(dǎo)的炎癥痛的檢測方法 小鼠角叉藻多糖誘導(dǎo)的炎癥痛主要使用熱刺痛儀檢測，首先測定正常小鼠的基礎(chǔ)痛閾 值。然后在小鼠足跖皮下注射20 μL 2%的Carrageenan溶液。24小時后測小鼠被注射足的熱 痛敏值，然后側(cè)腦室或鞘內(nèi)給化合物9,記錄給藥之后不同時間點(diǎn)熱痛閾值。
[0054] (2)角叉藻多糖誘導(dǎo)的炎癥痛的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤(Means 土 S.E.M.)表示不同藥物濃度處理的組間差異用 單因素方差分析（one-way AN0VA的Bonferroni檢驗(yàn)）來進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析，*P〈 0.001表示藥物處理組的熱痛閾值與生理鹽水組之間存在顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖11-12。
[0055] ED5Q值表示藥物產(chǎn)生50%最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)時的藥物劑量。首先計(jì)算出最大鎮(zhèn)痛效應(yīng) MPE(maximum possible effect)，MPE(%)=100 X [(給藥物后痛閾值-注射足痛敏值)/(基礎(chǔ) 痛閾值-注射足痛敏值）]。然后利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 5.0版本，分別以MPE( % ) 值計(jì)算出它鞘內(nèi)和腹腔給藥后誘導(dǎo)鎮(zhèn)痛的值和95%的置信區(qū)間。
[0056] 鹽水組為空白對照組，每組動物數(shù)為8-9只。如圖11-12所示，小鼠側(cè)腦室和鞘內(nèi)注 射化合物9都能劑量依賴地對小鼠交叉藻多糖誘導(dǎo)的炎癥痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。其鎮(zhèn)痛的ED 50值 分別為5.20 (2.06-13.10) pmol和2.98 (2.50-3.54) pmol。說明化合物9在治療炎癥痛 中具有潛在的應(yīng)用價值。
[0057] 8、化合物9在神經(jīng)痛模型中的鎮(zhèn)痛作用 (1)小鼠 CCI神經(jīng)痛模型的檢測方法 小鼠神經(jīng)痛主要采用坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型(CCI)，檢測方法使用熱刺痛儀和電子Von Frey觸痛儀同時檢測熱痛和機(jī)械痛，首先分別測定正常小鼠熱痛和機(jī)械痛的基礎(chǔ)痛閾值。 然后用戊巴比妥鈉麻醉（i .p, 80mg/kg小鼠體重)麻醉小鼠，俯臥位固定小鼠。暴露右側(cè)坐 骨神經(jīng)，使用4-0鉻制腸線環(huán)繞坐骨神經(jīng)做3個輕度結(jié)扎環(huán)，間隔1 mm。結(jié)扎強(qiáng)度以右后小腿 輕微顫抖為宜。手術(shù)后第10天，測定小鼠右后足的熱痛敏值，然后鞘內(nèi)給化合物9,記錄給藥 之后不同時間點(diǎn)熱痛閾值。手術(shù)后第11天，測定小鼠右后足的機(jī)械痛敏值，然后鞘內(nèi)給化合 物9,記錄給藥之后不同時間點(diǎn)熱痛閾值。
[0058] (2)CCI小鼠神經(jīng)痛的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤(Means 土 S.E.M.)表示不同藥物濃度處理的組間差異用 單因素方差分析（one-way AN0VA的Bonferroni檢驗(yàn)）來進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析廣*P〈 0.001表示藥物處理組的熱痛閾值或機(jī)械痛閾值與生理鹽水組之間存在顯著性差異。實(shí)驗(yàn) 結(jié)果見圖13-14。
[0059] ED5Q值表示藥物產(chǎn)生50%最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)時的藥物劑量。首先計(jì)算出最大鎮(zhèn)痛效應(yīng) MPE(maximum possible effect)，MPE(%)=100 X [(給藥物后痛閾值-手術(shù)側(cè)后足痛敏值)/ (基礎(chǔ)痛閾值-手術(shù)側(cè)后足痛敏值）]。然后利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 5.0版本，分別 以MPE (%)值計(jì)算出鞘內(nèi)給藥后誘導(dǎo)鎮(zhèn)痛的ED5Q值和95%的置信區(qū)間。
[0060] 鹽水組為空白對照組，每組動物數(shù)為8-9只。如圖13所示，小鼠鞘內(nèi)注射化合物9能 劑量依賴地對坐骨神經(jīng)慢性壓迫誘導(dǎo)的神經(jīng)痛模型中熱痛敏產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。其鎮(zhèn)痛的ED 50 值為1.74 (1.38-2.20) pmol。如圖14所示，小鼠鞘內(nèi)注射化合物9能劑量依賴地對坐骨神 經(jīng)慢性壓迫誘導(dǎo)的神經(jīng)痛模型中機(jī)械痛敏產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。其鎮(zhèn)痛的ED 5Q值為1.11(0.63_ 1.96) pmol。說明化合物9在神經(jīng)痛治療中具有潛在的應(yīng)用價值。
[0061] 9、化合物9和嗎啡在交叉藻多糖誘導(dǎo)的炎癥痛中的鎮(zhèn)痛耐受和交叉耐受的檢測 (1)小鼠角叉藻多糖誘導(dǎo)的炎癥痛鎮(zhèn)痛耐受的檢測方法 小鼠角叉藻多糖誘導(dǎo)的炎癥痛主要使用熱刺痛儀檢測，首先測定正常小鼠的基礎(chǔ)痛閾 值。然后在小鼠足跖皮下注射20 μL 2%的Carrageenan溶液。24小時后測小鼠被注射足的熱 痛敏值，然后側(cè)腦室給化合物9或嗎啡，連續(xù)六天給藥，第七天化合物9組給嗎啡，嗎啡組給 化合物9。記錄給藥之后不同時間點(diǎn)熱痛閾值。
[0062] (2)角叉藻多糖誘導(dǎo)的炎癥痛的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤(Means 土 S.E.M.)表示不同藥物濃度處理的組間差異用 單因素方差分析(one-way AN0VA的Bonferroni檢驗(yàn)）來進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析，林*P〈 0.001表示藥物處理組的熱痛閾值與第一天之間存在顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖15。
[0063] 鹽水組為空白對照組，每組動物數(shù)為10只。如圖15所示，小鼠側(cè)腦室連續(xù)注射嗎啡 從第四天開始鎮(zhèn)痛作用顯著減小，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛耐受。與嗎啡相比，連續(xù)側(cè)腦室注射化合物9六 天后，其鎮(zhèn)痛作用與第一天相比沒有明顯的變化，說明化合物9在角叉藻多糖誘導(dǎo)的炎癥痛 中也不會產(chǎn)生鎮(zhèn)痛耐受現(xiàn)象。第七天，嗎啡耐受的小鼠側(cè)腦室給化合物9仍然產(chǎn)生與第一天 給化合物9相當(dāng)?shù)逆?zhèn)痛作用;連續(xù)6天給化合物9的小鼠第七天側(cè)腦室給嗎啡同樣產(chǎn)生與第 一天相當(dāng)?shù)逆?zhèn)痛作用。表明化合物9在角叉藻多糖誘導(dǎo)的慢性炎癥痛中不會產(chǎn)生鎮(zhèn)痛耐受， 另外化合物9和嗎啡之間不存在交叉耐受現(xiàn)象。說明化合物9在阿片鎮(zhèn)痛耐受的病人上可能 仍具有高效的鎮(zhèn)痛作用，在研發(fā)阿片鎮(zhèn)痛藥的替代鎮(zhèn)痛藥物中具有重要的應(yīng)用價值。
[0064] 10、化合物9對胃腸運(yùn)動調(diào)節(jié)作用的檢測 (1)小鼠的在體胃腸運(yùn)動檢測方法 昆明系雄性小鼠，體重26±2 g。在體胃腸運(yùn)動檢測選用常用的碳粉檢測法。具體的實(shí) 驗(yàn)過程為：胃腸運(yùn)動實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食16小時(禁食期間可隨意飲水），然后脊髓注射藥物，15 分鐘后將預(yù)先準(zhǔn)備好的活性炭懸浮液(一種含5%活性炭和10%阿拉伯樹膠的生理鹽水懸浮 液）以每10克體重0.1 ml的體積經(jīng)口灌注到胃?；钚蕴繎腋∫汗嘧?0分鐘后，頸部脫白處死 動物，然后仔細(xì)地取出從幽門到盲腸的動物小腸。測量幽門到盲腸的小腸總長度以及活性 炭懸浮液移動的最遠(yuǎn)距離。
[0065] (2)在體胃腸運(yùn)動實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 胃腸運(yùn)動實(shí)驗(yàn)結(jié)果用胃腸運(yùn)動百分比來評價，每只小鼠的胃腸運(yùn)動百分比通過活性炭 懸浮液移動距離除以小腸總長度之后的百分比來計(jì)算。相關(guān)的數(shù)據(jù)用胃腸運(yùn)動百分比的平 均值土標(biāo)準(zhǔn)誤(Means 土 S.E.M.)來表示，不同藥物濃度處理的組間差異用單因素方差分 析(one-way AN0VA的Bonferroni檢驗(yàn))進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖16所示。
[0066] 在圖16中，生理鹽水組為空白對照組，鞘內(nèi)給化合物9的藥物劑量為100、300和500 pmol，每組小鼠數(shù)為8-9只。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白溶劑對照組的胃腸運(yùn)動百分比為66.75%，鞘 內(nèi)注射100、300和500 ?111〇1的化合物9的胃腸運(yùn)動百分比分別為45.71%、31.40%和21.67%。 只有300 pmol以上才會對胃腸運(yùn)動產(chǎn)生顯著的抑制作用。因此，在有效鎮(zhèn)痛劑量范圍內(nèi)，化 合物9無便秘的副作用。
[0067] 11、化合物9心血管調(diào)節(jié)作用的檢測 (1)大鼠血壓的檢測方法 Wistar雄性大鼠，體重200-250 g。烏拉坦（1.3 g/kg)麻醉后，切開氣管以防止室息。 分離股動脈，插入PE-10動脈插管，插入深度大約為2cm。動脈插管連接壓力換能器PT-100， PT-100連接到生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)BL-420F系統(tǒng)記錄平均動脈壓和脈動動脈壓。將另外一段PE-10 管從腰椎L4- L5處插入，沿蛛網(wǎng)膜下腔向上插入3 cm到達(dá)脊椎T12-。處，用于鞘內(nèi)給藥。 手術(shù)結(jié)束后，讓大鼠恢復(fù)穩(wěn)定30 min。然后鞘內(nèi)給生理鹽水或不同劑量的藥物，藥物劑量由 小到大，每次給藥間隔40 min以上。記錄給藥后大鼠血壓的變化。
[0068] (2)大鼠血壓調(diào)節(jié)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 大鼠心血管調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果用血壓的改變值來表示，相關(guān)的數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤 (Means 土 S.E.M.)來表示，不同藥物濃度處理的組間差異用單因素方差分析（one-way AN0VA的Bonf err on i檢驗(yàn))進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖17所示。
[0069]在圖17中，生理鹽水組為空白對照組，鞘內(nèi)給化合物9的藥物劑量為1、3、10和30 nmol每組大鼠數(shù)為5只（通過體重?fù)Q算表換算為小鼠劑量分別為140、420、1400和4200 pmol)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與生理鹽水組相比，鞘內(nèi)注射1 nmol以上劑量的化合物9會產(chǎn)生顯著 的降血壓的作用。但是此劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于鎮(zhèn)痛劑量。因此，在有效鎮(zhèn)痛劑量范圍內(nèi)，化合物9不 會對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生副作用。
[0070] 12、化合物9體溫調(diào)節(jié)作用的檢測 (1)小鼠體溫的檢測方法 將小鼠用Rosow et al. (1980)描述的方式進(jìn)行固定。環(huán)境溫度控制在21±0.5°C，實(shí) 驗(yàn)在上午10點(diǎn)至下午2點(diǎn)間進(jìn)行。將連接在生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)BL-420F系統(tǒng)中的溫度傳感器插入 小鼠直腸2.5(^1處用來記錄直腸溫度。分別記錄鞘內(nèi)給藥前及給藥后10、20、30、40、50、60 分鐘的體溫。
[0071] (2)小鼠體溫?cái)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 小鼠體溫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果用基礎(chǔ)體溫和給藥后體溫的差值表示，相關(guān)的數(shù)據(jù)用平均值土 標(biāo)準(zhǔn)誤(Means 土 S.E.M.)來表示，不同藥物濃度處理的組間差異用單因素方差分析(oneway AN0VA 的 Bonf err on i 檢驗(yàn)) 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 和分析 。實(shí) 驗(yàn)結(jié) 果如圖 18所示。
[0072] 在圖18中，生理鹽水組為空白對照組，鞘內(nèi)給化合物9的藥物劑量為100、300和500 pmol每組小鼠數(shù)為9-14只。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與生理鹽水組相比，只有鞘內(nèi)注射500 pmol劑量 的化合物9才會產(chǎn)生顯著的降體溫的作用。因此，在有效鎮(zhèn)痛劑量范圍內(nèi)，化合物9在體溫調(diào) 節(jié)方面無明顯作用。
[0073] 綜上所述，本發(fā)明多靶點(diǎn)多肽化合物1-9具有極強(qiáng)的中樞鎮(zhèn)痛活性，并且全部都不 會產(chǎn)生鎮(zhèn)痛耐受的副作用。化合物9在急性熱痛、化學(xué)刺激痛、內(nèi)臟痛、手術(shù)后痛、炎癥痛和 神經(jīng)痛等不同模型痛中均具有極強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用。并且化合物9在有效鎮(zhèn)痛劑量范圍內(nèi)，不產(chǎn) 生便秘副作用，并對心血管和體溫?zé)o明顯的調(diào)節(jié)作用。因此，化合物9在高效、低副作用鎮(zhèn)痛 藥物制備中具有潛在的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0074] 圖1為小鼠鞘內(nèi)注射化合物9所產(chǎn)生的劑量依賴性鎮(zhèn)痛作用的時間-量效曲線； 圖2為小鼠腹腔注射化合物9所產(chǎn)生的劑量依賴性鎮(zhèn)痛作用的時間-量效曲線； 圖3為小鼠連續(xù)六天側(cè)腦室注射化合物1-9所產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛作用的變化； 圖4為小鼠側(cè)腦室注射化合物9在福爾馬林致痛小鼠中所產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用； 圖5為小鼠鞘內(nèi)注射化合物9在福爾馬林致痛小鼠中所產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用； 圖6為小鼠腹腔注射化合物9在福爾馬林致痛小鼠中所產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用； 圖7為小鼠鞘內(nèi)注射化合物9對腹腔注射醋酸溶液誘導(dǎo)的內(nèi)臟痛的鎮(zhèn)痛作用； 圖8為小鼠腹腔注射化合物9對腹腔注射醋酸溶液誘導(dǎo)的內(nèi)臟痛的鎮(zhèn)痛作用； 圖9為小鼠鞘內(nèi)注射化合物9對術(shù)后疼痛的鎮(zhèn)痛作用； 圖10為小鼠腹腔化合物9對術(shù)后疼痛的鎮(zhèn)痛作用； 圖11為小鼠側(cè)腦室注射化合物9對交叉藻多糖誘導(dǎo)的炎癥痛的鎮(zhèn)痛作用； 圖12為小鼠鞘內(nèi)注射化合物9對交叉藻多糖誘導(dǎo)的炎癥痛的鎮(zhèn)痛作用； 圖13為小鼠鞘內(nèi)注射化合物9對神經(jīng)痛CCI模型熱痛的鎮(zhèn)痛作用； 圖14為小鼠鞘內(nèi)注射化合物9對神經(jīng)痛CCI模型機(jī)械痛的鎮(zhèn)痛作用； 圖15為小鼠側(cè)腦室注射化合物9和嗎啡在交叉藻多糖誘導(dǎo)的炎癥痛中的鎮(zhèn)痛耐受和交 叉耐受； 圖16為小鼠鞘內(nèi)注射化合物9對胃腸運(yùn)動的作用； 圖17為小鼠鞘內(nèi)注射化合物9對心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用； 圖18為小鼠鞘內(nèi)注射化合物9對體溫調(diào)節(jié)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。
【具體實(shí)施方式】
[0075] 下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明中多靶點(diǎn)多肽1-9的合成方法。
[0076] 儀器:高效液相色譜儀(HPLC)為Waters公司的Delta 600;分析柱:XBridge ? BEH 130 Prep Ci8,4.6 mmX250mm;制備柱：XBridge ? BEH 130 Prep Ci8，19 mmX250mm。質(zhì)譜儀為 Mariner ESI-TOF MS, Applied Biosystems，CA。手動固相多肽合成儀，由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì) 后由玻璃工制作(合成儀的設(shè)計(jì)原理具體參考Chen WC和White PD所編的《Fmoc solid phase peptide synthesis》中第14頁圖4,并在其基礎(chǔ)上作了部分改進(jìn)，即用以機(jī)械攪拌方式替代 鼓氮?dú)夥?，從而達(dá)到反應(yīng)溶液充分混合的目的）。試劑:樹脂為Rink-Amide-MBHA-Resin( 1% DVB，200 ~400 mesh，取代值S = 0.43 mol/g resin)，購自天津南開和成公司。TV-a-Fmoc 保護(hù)的氨基酸(Fmoc-Aa/Boc-Aa)、#-羥基苯并三氮唑（H0Bt)、0-苯并三氮唑-#，，，， 四甲基脲-六氟磷酸鹽(HBTU)、二異丙基乙胺(DIEA)和三異丙基硅烷(TIS)購自吉爾生 化（上海）有限公司。茚三酮為上海試劑三廠產(chǎn)品。二氯甲烷(DCM)、#，#-二甲基甲酰胺 (DMF)、六氫吡啶（哌啶）、甲醇(MeOH)和吡啶都購自天津第二試劑廠，三氟乙酸(TFA)、苯酚 和吡啶均為天津試劑一廠產(chǎn)品；以上有機(jī)試劑使用前均經(jīng)過重蒸處理。
[0077]實(shí)施例一、化合物1的合成 (1)樹脂預(yù)處理:稱取600 mg取代值為0.43 mmol/g的Rink-Amide-MBHA樹脂加入合成 儀中，再加入DCM后攪拌30 min，使樹脂充分溶脹后減壓抽干溶劑。
[0078] (2)脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù):在溶脹、抽干溶劑的樹脂中，加入六氫吡啶、DBU、DMF的混 合溶液(三者的體積比為1:1:98)，攪拌5 min后抽干，重復(fù)3次后抽干。最后加入的DMF，攪拌 3 min后抽干，重復(fù)4次，得到脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂樣品。
[0079] (3)茚檢:按以下順序加入試管中：樹脂樣品、0.1 ml試劑①、0.2ml試劑②、0.1 ml 試劑③，沸水浴3-10 min后觀察。溶液、樹脂均為藍(lán)色表示Fmoc保護(hù)基團(tuán)脫除完全。用于茚 檢的三種試劑的配方為：試劑①80 g苯酚/20ml乙醇；試劑②2.0 ml的0.001 Μ氰化鉀 (水)/ 98ml吡啶;試劑③5 g茚三酮/100 ml乙醇。
[0080] (4)氨基酸的縮合:依次將Ν-α-Fmoc保護(hù)Fmoc-Phe-〇H、N-羥基苯并三氮唑、0-苯并 三氮唑-N，N，N'，N'_四甲基脲-六氟磷酸鹽以1:1:1的摩爾比完全溶解于DMF中，再加入 Fmoc-Phe-OH兩倍摩爾量的二異丙基乙胺(DIEA)后充分混勻，得混合溶液;將混合溶液和步 驟(2)得到的脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂(Fmoc-Phe-ΟΗ與脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂的摩爾比 為1: 2.5)加入到合成儀中，在氬氣保護(hù)下攪拌反應(yīng)60 min，抽干溶劑。加入的DMF，攪拌3 min后抽干，重復(fù)3次，得肽樹脂樣品；按照步驟(3)進(jìn)行茚檢，茚檢溶液為淡黃、樹脂為無色 表示縮合完全。按照步驟(2)脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)，再按照步驟(3)茚檢，溶液、樹脂均為藍(lán)色 表示Fmoc保護(hù)基團(tuán)脫除完全，得脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的肽樹脂。
[0081] (5)肽鏈的延伸:將步驟(4)所得脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的肽樹脂按步驟(4)的工藝依 次完成 Fmoc_Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Gln(Trt )-〇H、Fmoc-Pr〇-〇H、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc-?116-0!1、卩1]1〇(3-617-0!1、卩1]1〇(3-0-厶1&-0!1和卩1]1〇(3-匪6-15^(^1311)-0!1的縮合，得到肽樹脂匪6-Tyr(tBu)- D_Ala_ Gly- Phe- Gln(Trt)- Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin〇
[0082] (6)肽鏈的切割:肽鏈的氨基酸殘基全部縮合完成后，tBu、Trt和Pbf保護(hù)基團(tuán)在切 割劑TFA的酸性條件下可脫除，因此，最后無需脫除直接進(jìn)行切割。按照DCM 3 minX2次， MeOH 3 minXl次;DCM 3 minXl次，MeOH 3 minX2次的操作交替洗樹脂。移開攪棒，將合 成儀密封（膠塞），徹底抽干（至少2小時）。將干燥的肽 Phe- Gln(Trt)- Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin置于反應(yīng)器中，加入切割劑（由 TFA: ΤΙ S:水以95:2.5:2.5的體積比混合而成，每克肽樹脂加入18ml的切割劑），于室溫下切 割反應(yīng)2.5小時(每15分鐘攪拌一次，每次攪拌1分鐘）。過濾，濾液在不高于37°C的條件下充 分減壓旋干，然后用不高于_l〇°C的乙醚析出沉淀，振蕩使粗肽以白色沉淀的形式充分析 出。靜置后將上清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗將乙醚從水相中分離除 去，合并水相通過冷凍干燥得到白色的粗肽固體粉末201.6mg，產(chǎn)率為69.4%。
[0083] ( 7 )粗肽的脫鹽和純化；將全部粗產(chǎn)物分批溶于20%乙酸溶液中，將溶液過 Sephadex G25交聯(lián)葡聚糖凝膠柱（2.0\25(^)，流動相為體積濃度20%乙酸溶液。利用紫外 檢測儀收集主峰后冷凍干燥，再用反相向高效液相色譜(HPLOC18柱(XBridge TM BEH 130 Prep C18,19 mm X 250mm)對上述脫鹽的肽化合物進(jìn)行分離純化，經(jīng)分離后收集樣品主峰， 得純化的化合物1樣品，其純度為99.5%，其合成的總產(chǎn)率為22.81 %。質(zhì)譜和色譜分析檢測 結(jié)果如表2所示。
[0084]實(shí)施例二、化合物2的合成 (1)樹脂預(yù)處理:稱取600 mg取代值為0.43 mmol/g的Rink-Amide-MBHA樹脂加入合成 儀中，再加入DCM后攪拌30 min，使樹脂充分溶脹后減壓抽干溶劑。
[0085] (2)脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)：同實(shí)施例一。
[0086] (3)茚檢：同實(shí)施例一。
[0087] (4)氨基酸的縮合:依次將Ν-α-Fmoc保護(hù)Fmoc-Phe-〇H、N_羥基苯并三氮唑、0-苯并 三氮唑-N，N，N'，N'_四甲基脲-六氟磷酸鹽以1:1:1的摩爾比完全溶解于DMF中，再加入 Fmoc-Phe-OH兩倍量的二異丙基乙胺(DIEA)后充分混勻，得混合溶液；將混合溶液和步驟 (2)得到的脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂(Fmoc-Phe-ΟΗ與脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂的摩爾比為 1:2.5)加入到合成儀中，在氬氣保護(hù)下攪拌反應(yīng)60 min，抽干溶劑。加入的DMF，攪拌3 min 后抽干，重復(fù)3次，得肽樹脂樣品；按照步驟(3)進(jìn)行茚檢，茚檢溶液為淡黃、樹脂為無色表示 縮合完全。按照步驟(2)脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)，再按照步驟(3)茚檢，溶液、樹脂均為藍(lán)色表示 Fmoc保護(hù)基團(tuán)脫除完全，得脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的肽樹脂。
[0088] (5)肽鏈的延伸：將步驟(4)所得脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的肽樹脂按步驟(4)的工藝依 次完成 Fmoc_Arg( Pbf)-〇H、Fmoc-Gln(Tr t)-〇H、Fmoc-Pr〇-〇H、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc-MVIe-Phe-〇H、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-D-Ala-〇H 和 Fmoc-Tyr (tBu)-〇H的縮合，得到肽樹脂 Tyr (tBu)- D_Ala_ Gly- NMe- Phe- Gln(Trt)- Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin〇
[0089] (6)肽鏈的切割:肽鏈的氨基酸殘基全部縮合完成后，tBu、Trt和Pbf保護(hù)基團(tuán)在切 割劑TFA的酸性條件下可脫除，因此，最后無需脫除直接進(jìn)行切割。按照DCM 3 minX2次， MeOH 3 minXl次;DCM 3 minXl次，MeOH 3 minX2次的操作交替洗樹脂。移開攪棒，將合 成儀密封(膠塞），徹底抽干(至少2小時）。將干燥的肽樹脂Tyr(tBu)- D-Ala- Gly-Phe- Gln(Trt)- Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin置于反應(yīng)器中，加入切割劑（由 TFA: ΤΙ S:水以95:2.5:2.5的體積比混合而成，每克肽樹脂加入18ml的切割劑），于室溫下切 割反應(yīng)2.5小時(每15分鐘攪拌一次，每次攪拌1分鐘）。過濾，濾液在不高于37°C的條件下充 分減壓旋干，然后用不高于_l〇°C的乙醚析出沉淀，振蕩使粗肽以白色沉淀的形式充分析 出。靜置后將上清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗將乙醚從水相中分離除 去，合并水相通過冷凍干燥得到白色的粗肽固體粉末273. lmg，產(chǎn)率為81.0%。
[0090] (7)脫鹽和純化:將全部粗產(chǎn)物分批溶于20%乙酸溶液中，將溶液過Sephadex G25 交聯(lián)葡聚糖凝膠柱(2. OX 25cm)，流動相為體積濃度20%乙酸溶液。利用紫外檢測儀收集主 峰后冷凍干燥。再用反相向高效液相色譜(HPLOC18柱(XBridge TM BEH 130 Prep C18，19 mmX250mm)對上述脫鹽的肽化合物進(jìn)行分離純化，經(jīng)分離后收集樣品主峰，得純化的化合 物的2樣品，純度為95.65%，合成的總產(chǎn)率分別為10.8 %。質(zhì)譜和色譜分析檢測結(jié)果見表2。
[0091] 實(shí)施例三、化合物3的合成 (1)樹脂預(yù)處理:稱取600 mg取代值為0.5 mmol/g的Rink-Amide-MBHA樹脂加入合成儀 中，再加入DCM后攪拌30 min，使樹脂充分溶脹后減壓抽干溶劑。
[0092] (2)脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)：同實(shí)施例一。
[0093] (3)茚檢：同實(shí)施例一。
[0094] (4)氨基酸的縮合:依次將Ν-α-Fmoc保護(hù)Fmoc-Phe-〇H、N_羥基苯并三氮唑、0-苯并 三氮唑-N，N，N'，N'_四甲基脲-六氟磷酸鹽以1:1:1的摩爾比完全溶解于DMF中，再加入 Fmoc-Phe-OH兩倍摩爾量的二異丙基乙胺(DIEA)后充分混勻，得混合溶液;將混合溶液和步 驟(2)得到的脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂(Fmoc-Phe-ΟΗ與脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂的摩爾比 為1: 2.5)加入到合成儀中，在氬氣保護(hù)下攪拌反應(yīng)60 min，抽干溶劑。加入的DMF，攪拌3 min后抽干，重復(fù)3次，得肽樹脂樣品；按照步驟(3)進(jìn)行茚檢，茚檢溶液為淡黃、樹脂為無色 表示縮合完全。按照步驟(2)脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)，再按照步驟(3)茚檢，溶液、樹脂均為藍(lán)色 表示Fmoc保護(hù)基團(tuán)脫除完全，得脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的肽樹脂。
[0095] (5)肽鏈的延伸：將步驟(4)所得脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的肽樹脂按步驟(4)的工藝依 次完成 Fmoc-Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc-P;r〇-〇H、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Phe-〇H、 卩111〇(3-617-0!1、卩1]1〇。-0-厶1&-0!1和卩1]1〇。-15^(^1311)-0!1的縮合，得到肽樹脂15^(^1311)-0-厶1&-Gly- Phe- Gly- Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin。
[0096] (6)化合物3的肽鏈從樹脂上的切割:肽鏈的氨基酸殘基全部縮合完成后，tBu、Trt 和Pbf保護(hù)基團(tuán)在切割劑TFA的酸性條件下可脫除，因此，最后無需脫除直接進(jìn)行切割。按照 DCM 3 min X 2次，MeOH 3 min XI次;DCM 3 min XI次，MeOH 3 min X 2次的操作交替洗樹 月旨。移開攪棒，將合成儀密封(膠塞），徹底抽干(至少2小時）。將干燥的肽樹脂17^〖811)-0-Ala- Gly- Phe- Gly- Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin置于反應(yīng)器中，加入切割劑 (由TFA: TIS:水以95: 2.5: 2.5的體積比混合而成，每克肽樹脂加入18ml的切割劑），于室溫 下切割反應(yīng)2.5小時(每15分鐘攪拌一次，每次攪拌1分鐘）。過濾，濾液在不高于37°C的條件 下充分減壓旋干，然后用不高于_l〇°C的乙醚析出沉淀，振蕩使粗肽以白色沉淀的形式充分 析出。靜置后將上清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗將乙醚從水相中分離除 去，合并水相通過冷凍干燥得到白色的粗肽固體粉末297.9 mg，產(chǎn)率為95.5%。
[0097] (7)化合物3的脫鹽和純化：將全部粗產(chǎn)物分批溶于20%乙酸溶液中，將溶液過 Sephadex G25交聯(lián)葡聚糖凝膠柱（2.0\25(^)，流動相為體積濃度20%乙酸溶液。利用紫外 檢測儀收集主峰后冷凍干燥。再用反相向高效液相色譜(HPLOC18柱(XBridge TM BEH 130 Prep C18,19 mm X 250mm)對上述脫鹽的肽化合物進(jìn)行分離純化，經(jīng)分離后收集樣品主峰， 得純化的化合物3樣品，純度為96.06%，合成的總產(chǎn)率分別為16.06 %。質(zhì)譜和色譜分析檢測 結(jié)果見表2。
[0098]實(shí)施例四、化合物4的合成 (1)樹脂預(yù)處理:稱取600 mg取代值為0.43 mmol/g的Rink-Amide-MBHA樹脂加入合成 儀中，再加入DCM后攪拌30 min，使樹脂充分溶脹后減壓抽干溶劑。
[0099] (2)脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)：同實(shí)施例一。
[0100] (3)茚檢：同實(shí)施例一。
[0101] (4)氨基酸的縮合:依次將Ν-α-Fmoc保護(hù)Fmoc-Phe-〇H、N_羥基苯并三氮唑、0-苯并 三氮唑-N，N，N'，N'_四甲基脲-六氟磷酸鹽以1:1:1的摩爾比完全溶解于DMF中，再加入 Fmoc-Phe-OH兩倍量的二異丙基乙胺(DIEA)后充分混勻，得混合溶液；將混合溶液和步驟 (2)得到的脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂(Fmoc-Phe-ΟΗ與脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂的摩爾比為 1:2.5)加入到合成儀中，在氬氣保護(hù)下攪拌反應(yīng)60 min，抽干溶劑。加入的DMF，攪拌3 min 后抽干，重復(fù)3次，得肽樹脂樣品；按照步驟(3)進(jìn)行茚檢，茚檢溶液為淡黃、樹脂為無色表示 縮合完全。按照步驟(2)脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)，再按照步驟(3)茚檢，溶液、樹脂均為藍(lán)色表示 Fmoc保護(hù)基團(tuán)脫除完全，得脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的肽樹脂。
[0102] (5)肽鏈的延伸:將步驟(4)所得脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的肽樹脂按步驟(4)的工藝依 次完成 Fmoc-Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc-P;r〇-〇H、Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-Phe-〇H、 卩111〇(3-617-0!1、卩1]1〇。-0-厶1&-0!1和卩1]1〇。-15^(^1311)-0!1的縮合，得到肽樹脂15^(^1311)-0-厶1&-Gly- Phe- Leu- Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin。
[0103] (6)肽鏈從樹脂上的切割:肽鏈的氨基酸殘基全部縮合完成后，tBu、Trt和Pbf保護(hù) 基團(tuán)在切割劑TFA的酸性條件下可脫除，因此，最后無需脫除直接進(jìn)行切割。按照DCM 3 min X2次，MeOH 3 minXl次;DCM 3 minXl次，MeOH 3 minX2次的操作交替洗樹脂。移開攪 棒，將合成儀密封(膠塞），徹底抽干(至少2小時）。將干燥的肽樹脂17^〖811)-041 &-617-Phe- Leu- Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin置于反應(yīng)器中，加入切割劑（由TFA: TIS:水以95:2.5:2.5的體積比混合而成，每克肽樹脂加入18ml的切割劑），于室溫下切割反 應(yīng)2.5小時(每15分鐘攪拌一次，每次攪拌1分鐘）。過濾，濾液在不高于37 °C的條件下充分減 壓旋干，然后用不高于_l〇°C的乙醚析出沉淀，振蕩使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。靜 置后將上清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗將乙醚從水相中分離除去，合并 水相通過冷凍干燥得到白色的粗肽固體粉末181.5 mg，產(chǎn)率為64.2%。
[0104] ( 7 )粗肽的脫鹽和純化：將全部粗產(chǎn)物分批溶于2 0 %乙酸溶液中，將溶液過 Sephadex G25交聯(lián)葡聚糖凝膠柱（2.0\25(^)，流動相為體積濃度20%乙酸溶液。利用紫外 檢測儀收集主峰后冷凍干燥。再用反相向高效液相色譜(HPLC)C18柱(XBridge TM BEH 130 Prep C18,19 mm X 250mm)對上述脫鹽的肽化合物進(jìn)行分離純化，經(jīng)分離后收集樣品主峰， 得到純化的化合物4樣品，純度為99.15%，合成的總產(chǎn)率分別為38.6%。質(zhì)譜和色譜分析檢測 結(jié)果見表2。
[0105] 實(shí)施例五、化合物5的合成 (1)樹脂預(yù)處理:稱取600 mg取代值為0.5 mmol/g的Rink-Amide-MBHA樹脂加入合成儀 中，再加入DCM后攪拌30 min，使樹脂充分溶脹后減壓抽干溶劑。
[0106] (2)脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)：同實(shí)施例一。
[0107] (3)茚檢：同實(shí)施例一。
[0108] (4)氨基酸的縮合:依次將Ν-α-Fmoc保護(hù)Fmoc-Phe-〇H、N_羥基苯并三氮唑、0-苯并 三氮唑-N，N，N'，N'_四甲基脲-六氟磷酸鹽以1:1:1的摩爾比完全溶解于DMF中，再加入 Fmoc-Phe-OH兩倍量的二異丙基乙胺(DIEA)后充分混勻，得混合溶液；將混合溶液和步驟 (2)得到的脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂(Fmoc-Phe-ΟΗ與脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂的摩爾比為 1:2.5)加入到合成儀中，在氬氣保護(hù)下攪拌反應(yīng)60 min，抽干溶劑。加入的DMF，攪拌3 min 后抽干，重復(fù)3次，得肽樹脂樣品；按照步驟(3)進(jìn)行茚檢，茚檢溶液為淡黃、樹脂為無色表示 縮合完全。按照步驟(2)脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)，再按照步驟(3)茚檢，溶液、樹脂均為藍(lán)色表示 Fmoc保護(hù)基團(tuán)脫除完全，得脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的肽樹脂。
[0109] (5)肽鏈的延伸:將步驟(4)所得脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的肽樹脂按步驟(4)的工藝依 次完成 Fmoc-Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc-P;r〇-〇H、Fmoc-Met-〇H、Fmoc-Phe-〇H、 卩111〇(3-617-0!1、卩1]1〇。-0-厶1&-0!1和卩1]1〇。-15^(^1311)-0!1的縮合，得到肽樹脂15^(^1311)-0-厶1&-Gly- Phe- Met- Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin。
[0110] (6)肽鏈的切割:肽鏈的氨基酸殘基全部縮合完成后，tBu、Trt和Pbf保護(hù)基團(tuán)在切 割劑TFA的酸性條件下可脫除，因此，最后無需脫除直接進(jìn)行切割。按照DCM 3 minX2次， MeOH 3 minXl次;DCM 3 minXl次，MeOH 3 minX2次的操作交替洗樹脂。移開攪棒，將合 成儀密封(膠塞），徹底抽干(至少2小時）。將干燥的肽樹脂17以〖811)-041 &-617-?116-Met- Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin 置于反應(yīng)器中，加入切割劑（由 TFA:TIS:水以 95:2.5:2.5的體積比混合而成，每克肽樹脂加入18ml的切割劑），于室溫下切割反應(yīng)2.5小 時(每15分鐘攪拌一次，每次攪拌1分鐘）。過濾，濾液在不高于37°C的條件下充分減壓旋干， 然后用不高于_l〇°C的乙醚析出沉淀，振蕩使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。靜置后將上 清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗將乙醚從水相中分離除去，合并水相通過 冷凍干燥得到白色的粗肽固體粉末?；衔?的粗肽粉末為311.8 mg，產(chǎn)率為93.3%。
[0111] ( 7 )粗肽的脫鹽和純化：將全部粗產(chǎn)物分批溶于2 0 %乙酸溶液中，將溶液過 Sephadex G25交聯(lián)葡聚糖凝膠柱(2.0 X 25cm)，流動相為體積濃度20%乙酸溶液。利用紫外 檢測儀收集主峰后冷凍干燥。再用反相向高效液相色譜(HPLOC18柱(XBridge TM BEH 130 Prep C18,19 mm X 250mm)對上述脫鹽的肽化合物進(jìn)行分離純化，經(jīng)分離后收集樣品主峰， 得純化的化合物5樣品，純度為99.33%，合成的總產(chǎn)率分別為54.39%。質(zhì)譜和色譜分析檢測 結(jié)果見表2。
[0112] 實(shí)施例六、化合物6的合成 (1)樹脂預(yù)處理:稱取600 mg取代值為0.43 mmol/g的Rink-Amide-MBHA樹脂加入合成 儀中，再加入DCM后攪拌30 min，使樹脂充分溶脹后減壓抽干溶劑。
[0113] (2)脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)：同實(shí)施例一。
[0114] (3)茚檢：同實(shí)施例一。
[0115] (4)氨基酸的縮合:依次將Ν-α-Fmoc保護(hù)Fmoc-Phe-〇H、N_羥基苯并三氮唑、0-苯并 三氮唑-N，N，N'，N'_四甲基脲-六氟磷酸鹽以1:1:1的摩爾比完全溶解于DMF中，再加入 Fmoc-Phe-OH兩倍量的二異丙基乙胺(DIEA)后充分混勻，得混合溶液；將混合溶液和步驟 (2)得到的脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂(Fmoc-Phe-ΟΗ與脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂的摩爾比為 1:2.5)加入到合成儀中，在氬氣保護(hù)下攪拌反應(yīng)60 min，抽干溶劑。加入的DMF，攪拌3 min 后抽干，重復(fù)3次，得肽樹脂樣品；按照步驟(3)進(jìn)行茚檢，茚檢溶液為淡黃、樹脂為無色表示 縮合完全。按照步驟(2)脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)，再按照步驟(3)茚檢，溶液、樹脂均為藍(lán)色表示 Fmoc保護(hù)基團(tuán)脫除完全，得脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的肽樹脂。
[0116] (5)肽鏈的延伸:將步驟(4)所得脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的肽樹脂按步驟(4)的工藝依 次完成 Fmoc-Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc-P;r〇-〇H、Fmoc-D-Met-〇H、Fmoc-Phe-0!1、卩1]1〇。-617-0!1、卩1]1〇。-0-厶1&-0!1和卩1]1〇。-15^(^1311)-0!1的縮合，得到肽樹脂15^(^1311)-0-Ala- Gly- Phe- D_Met - Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin。
[0117] (6)肽鏈的切割:肽鏈的氨基酸殘基全部縮合完成后，tBu、Trt和Pbf保護(hù)基團(tuán)在切 割劑TFA的酸性條件下可脫除，因此，最后無需脫除直接進(jìn)行切割。按照DCM 3 minX2次， MeOH 3 minXl次;DCM 3 minXl次，MeOH 3 minX2次的操作交替洗樹脂。移開攪棒，將合 成儀密封(膠塞），徹底抽干(至少2小時）。將干燥的肽樹脂17以〖811)-041 &-617-?116-D-Met - Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin置于反應(yīng)器中，加入切割劑（由TFA:TIS: 水以95 :2.5 :2.5的體積比混合而成，每克肽樹脂加入18ml的切割劑），于室溫下切割反應(yīng) 2.5小時(每15分鐘攪拌一次，每次攪拌1分鐘）。過濾，濾液在不高于37 °C的條件下充分減壓 旋干，然后用不高于_l〇°C的乙醚析出沉淀，振蕩使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。靜置 后將上清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗將乙醚從水相中分離除去，合并水 相通過冷凍干燥得到白色的粗肽固體粉末165.9 mg，產(chǎn)率為57.7%。
[0118] (7)粗肽的脫鹽和純化：將全部粗產(chǎn)物分批溶于20%乙酸溶液中，將溶液過 Sephadex G25交聯(lián)葡聚糖凝膠柱（2.0\25(^)，流動相為體積濃度20%乙酸溶液。利用紫外 檢測儀收集主峰后冷凍干燥。再用反相向高效液相色譜(HPLOC18柱(XBridge TM BEH 130 Prep C18,19 mm X 250mm)對上述脫鹽的肽化合物進(jìn)行分離純化，經(jīng)分離后收集樣品主峰， 得純化的化合物6樣品，純度為99.18%，合成的總產(chǎn)率分別為28.62%。質(zhì)譜和色譜分析檢測 結(jié)果見表2。
[0119] 實(shí)施例七、化合物7的合成 (1)樹脂預(yù)處理:稱取600 mg取代值為0.43 mmol/g的Rink-Amide-MBHA樹脂加入合成 儀中，再加入DCM后攪拌30 min，使樹脂充分溶脹后減壓抽干溶劑。
[0120] (2)脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)：同實(shí)施例一。
[0121] (3)茚檢：同實(shí)施例一。
[0122] (4)氨基酸的縮合:依次將Ν-α-Fmoc保護(hù)Fmoc-Phe-〇H、N_羥基苯并三氮唑、0-苯并 三氮唑-N，N，N'，N'_四甲基脲-六氟磷酸鹽以1:1:1的摩爾比完全溶解于DMF中，再加入 Fmoc-Phe-OH兩倍量的二異丙基乙胺(DIEA)后充分混勻，得混合溶液；將混合溶液和步驟 (2)得到的脫除?111〇(3基團(tuán)保護(hù)的樹脂(?1]1〇(3-?116-0!1與脫除?1]1〇(3基團(tuán)保護(hù)的樹脂的摩爾比為 1:2.5)加入到合成儀中，在氬氣保護(hù)下攪拌反應(yīng)60 min，抽干溶劑。加入的DMF，攪拌3 min 后抽干，重復(fù)3次，得肽樹脂樣品；按照步驟(3)進(jìn)行茚檢，茚檢溶液為淡黃、樹脂為無色表示 縮合完全。按照步驟(2)脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)，再按照步驟(3)茚檢，溶液、樹脂均為藍(lán)色表示 Fmoc保護(hù)基團(tuán)脫除完全，得脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的肽樹脂。
[0123] (5)肽鏈的延伸:將步驟(4)所得脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的肽樹脂按步驟(4)的工藝依 次完成 Fmoc-Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc-P;r〇-〇H、Fmoc-D-Leu-〇H、Fmoc-Phe-0!1、卩1]1〇。-617-0!1、卩1]1〇。-0-厶1&-0!1和卩1]1〇。-15^(^1311)-0!1的縮合，得到肽樹脂15^(^1311)-0-Ala- Gly- Phe- D_Leu - Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin。
[0124] (6)肽鏈的切割:肽鏈的氨基酸殘基全部縮合完成后，tBu、Trt和Pbf保護(hù)基團(tuán)在切 割劑TFA的酸性條件下可脫除，因此，最后無需脫除直接進(jìn)行切割。按照DCM 3 minX2次， MeOH 3 minXl次;DCM 3 minXl次，MeOH 3 minX2次的操作交替洗樹脂。移開攪棒，將合 成儀密封(膠塞），徹底抽干(至少2小時）。將干燥的肽樹脂Tyr(tBu)-D-Ala-Gly-Phe-D-Leu-Pro-Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin置于反應(yīng)器中，加入切割劑（由TFA:TIS:水以 95:2.5:2.5的體積比混合而成，每克肽樹脂加入18ml的切割劑），于室溫下切割反應(yīng)2.5小 時(每15分鐘攪拌一次，每次攪拌1分鐘）。過濾，濾液在不高于37°C的條件下充分減壓旋干， 然后用不高于_l〇°C的乙醚析出沉淀，振蕩使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。靜置后將上 清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗將乙醚從水相中分離除去，合并水相通過 冷凍干燥得到白色的粗肽固體粉末172.6 mg，產(chǎn)率為61.1%。
[0125] ( 7 )粗肽的脫鹽和純化：將全部粗產(chǎn)物分批溶于2 0 %乙酸溶液中，將溶液過 Sephadex G25交聯(lián)葡聚糖凝膠柱(2.0 X 25cm)，流動相為體積濃度20%乙酸溶液。利用紫外 檢測儀收集主峰后冷凍干燥。再用反相向高效液相色譜(HPLC)C 18柱(XBridge TM BEH 130 Prep Cis，19 mmX 250mm)對上述脫鹽的肽化合物進(jìn)行分離純化，經(jīng)分離后收集樣品主峰，得 到純化的化合物7樣品，純度為99.79%，合成的總產(chǎn)率分別為33.48%。質(zhì)譜和色譜分析檢測 結(jié)果見表2。
[0126] 實(shí)施例八、化合物8的合成 (1)樹脂預(yù)處理:稱取600 mg取代值為0.43 mmol/g的Rink-Amide-MBHA樹脂加入合成 儀中，再加入DCM后攪拌30 min，使樹脂充分溶脹后減壓抽干溶劑。
[0127] (2)脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)：同實(shí)施例一。
[0128] (3)茚檢：同實(shí)施例一。
[0129] (4)氨基酸的縮合:依次將Ν-α-Fmoc保護(hù)Fmoc-Phe-〇H、N_羥基苯并三氮唑、0-苯并 三氮唑-N，N，N'，N'_四甲基脲-六氟磷酸鹽以1:1:1的摩爾比完全溶解于DMF中，再加入 Fmoc-Phe-OH兩倍量的二異丙基乙胺(DIEA)后充分混勻，得混合溶液；將混合溶液和步驟 (2)得到的脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂(Fmoc-Phe-ΟΗ與脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂的摩爾比為 1:2.5)加入到合成儀中，在氬氣保護(hù)下攪拌反應(yīng)60 min，抽干溶劑。加入的DMF，攪拌3 min 后抽干，重復(fù)3次，得肽樹脂樣品；按照步驟(3)進(jìn)行茚檢，茚檢溶液為淡黃、樹脂為無色表示 縮合完全。按照步驟(2)脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)，再按照步驟(3)茚檢，溶液、樹脂均為藍(lán)色表示 Fmoc保護(hù)基團(tuán)脫除完全，得脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的肽樹脂。
[0130] (5)肽鏈的延伸:將步驟(4)所得脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的肽樹脂按步驟(4)的工藝依 次完成 Fmoc-Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc-P;r〇-〇H、Fmoc-D-Ala-〇H、Fmoc-Phe-0!1、卩1]1〇。-617-0!1、卩1]1〇。-0-厶1&-0!1和卩1]1〇。-15^(^1311)-0!1的縮合，得到肽樹脂15^(^1311)-0-Ala- Gly- Phe- D_Ala - Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin〇
[0131] (6)肽鏈的切割:肽鏈的氨基酸殘基全部縮合完成后，tBu、Trt和Pbf保護(hù)基團(tuán)在切 割劑TFA的酸性條件下可脫除，因此，最后無需脫除直接進(jìn)行切割。按照DCM 3 minX2次， MeOH 3 minXl次;DCM 3 minXl次，MeOH 3 minX2次的操作交替洗樹脂。移開攪棒，將合 成儀密封(膠塞），徹底抽干(至少2小時）。將干燥的肽樹脂17以〖811)-041 &-617-?116-D-Ala - Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin置于反應(yīng)器中，加入切割劑（由TFA:TIS: 水以95 :2.5 :2.5的體積比混合而成，每克肽樹脂加入18ml的切割劑），于室溫下切割反應(yīng) 2.5小時(每15分鐘攪拌一次，每次攪拌1分鐘）。過濾，濾液在不高于37 °C的條件下充分減壓 旋干，然后用不高于_l〇°C的乙醚析出沉淀，振蕩使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。靜置 后將上清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗將乙醚從水相中分離除去，合并水 相通過冷凍干燥得到白色的粗肽固體粉末177.4 mg，產(chǎn)率為65.2%。
[0132] ( 7 )粗肽的脫鹽和純化：將全部粗產(chǎn)物分批溶于20%乙酸溶液中，將溶液過 Sephadex G25交聯(lián)葡聚糖凝膠柱(2.0 X 25cm)，流動相為體積濃度20%乙酸溶液。利用紫外 檢測儀收集主峰后冷凍干燥。再用反相向高效液相色譜(HPLOC18柱(XBridge TM BEH 130 Prep C18,19 mm X 250mm)對上述脫鹽的肽化合物進(jìn)行分離純化，經(jīng)分離后收集樣品主峰， 得到純化的化合物8樣品，純度為98.78%，合成的總產(chǎn)率分別為35.36%。質(zhì)譜和色譜分析檢 測結(jié)果見表2。
[0133] 實(shí)施例九、化合物9的合成 (1)樹脂預(yù)處理:稱取600 mg取代值為0.5 mmol/g的Rink-Amide-MBHA樹脂加入合成 儀中，再加入DCM后攪拌30 min，使樹脂充分溶脹后減壓抽干溶劑。
[0134] (2)脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)：同實(shí)施例一。
[0135] (3)茚檢：同實(shí)施例一。
[0136] (4)氨基酸的縮合:依次將Ν-α-Fmoc保護(hù)Fmoc-Phe-〇H、N_羥基苯并三氮唑、0-苯并 三氮唑-N，N，N'，N'_四甲基脲-六氟磷酸鹽以1:1:1的摩爾比完全溶解于DMF中，再加入 Fmoc-Ala-OH兩倍量的二異丙基乙胺(DIEA)后充分混勻，得混合溶液；將混合溶液和步驟 (2)得到的脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂(Fmoc-Phe-ΟΗ與脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂的摩爾比為 1:2.5)加入到合成儀中，在氬氣保護(hù)下攪拌反應(yīng)60 min，抽干溶劑。加入的DMF，攪拌3 min 后抽干，重復(fù)3次，得肽樹脂樣品；按照步驟(3)進(jìn)行茚檢，茚檢溶液為淡黃、樹脂為無色表示 縮合完全。按照步驟(2)脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)，再按照步驟(3)茚檢，溶液、樹脂均為藍(lán)色表示 Fmoc保護(hù)基團(tuán)脫除完全，得脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的肽樹脂。
[0137] (5)肽鏈的延伸:將步驟(4)所得脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的肽樹脂按步驟(4)的工藝依 次完成 Fmoc-Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc-P;r〇-〇H、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-MV[e-?116-0!1、卩1]1〇(3-617-0!1、卩1]1〇(3-0-厶1&-0!1和卩1]1〇(3-15^(七1311)-0!1的縮合，得到肽樹脂15^(七1311)-D_Ala_ Gly- NMe-Phe- Gly - Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Ala-Resin。
[0138] (6)肽鏈從的切割:肽鏈的氨基酸殘基全部縮合完成后，tBu、Trt和Pbf保護(hù)基團(tuán)在 切割劑TFA的酸性條件下可脫除，因此，最后無需脫除直接進(jìn)行切割。按照DCM 3 minX2次， MeOH 3 minXl次;DCM 3 minXl次，MeOH 3 minX2次的操作交替洗樹脂。移開攪棒，將合 成儀密封(膠塞），徹底抽干(至少2小時）。將干燥的肽樹脂Tyr(tBu)- D-Ala- Gly- ^e-Phe- Gly - Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Ala-Resin置于反應(yīng)器中，加入切割劑（由TFA: TIS:水以95:2.5:2.5的體積比混合而成，每克肽樹脂加入18ml的切割劑），于室溫下切割反 應(yīng)2.5小時(每15分鐘攪拌一次，每次攪拌1分鐘）。過濾，濾液在不高于37 °C的條件下充分減 壓旋干，然后用不高于_l〇°C的乙醚析出沉淀，振蕩使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。靜 置后將上清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗將乙醚從水相中分離除去，合并 水相通過冷凍干燥得到白色的粗肽固體粉末308.5mg，產(chǎn)率為97.51%。
[0139] ( 7 )粗肽的脫鹽和純化：將全部粗產(chǎn)物分批溶于20%乙酸溶液中，將溶液過 Sephadex G25交聯(lián)葡聚糖凝膠柱（2.0\25(^)，流動相為體積濃度20%乙酸溶液。利用紫外 檢測儀收集主峰后冷凍干燥。再用反相向高效液相色譜(HPLOC18柱(XBridge TM BEH 130 Prep C18,19 mm X 250mm)對上述脫鹽的肽化合物進(jìn)行分離純化，經(jīng)分離后收集樣品主峰， 得到純化的化合物9樣品，純度為97.49%，合成的總產(chǎn)率分別為32.28%。質(zhì)譜和色譜分析檢 測結(jié)果見表2。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一類阿片和神經(jīng)膚FF受體的多祀點(diǎn)多膚，其結(jié)構(gòu)通式如下： Xaa 廣 D-Ala-Gly-Xaa2-Xaa3-Pro-Gln-Arg-Phe-N 出 其中Xaai為 Tyr或 Mfe-Tyr; Xaa2 為曲 e或MVIe-曲 e; Xaa3為Gin、Gly、Leu、Met、D-Met、D- Leu或D-Al曰。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述阿片和神經(jīng)膚FF受體的多祀點(diǎn)多膚，Xaa功NMe-Tyr，Xaa2為化e， Xaa3 為 Gin 時，多祀點(diǎn)多膚的序列為 NMe-Tyr-D-Ala-Gl 廠陸 e-Gln-Pro-Gln-Arg-陸 e-NH2。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述阿片和神經(jīng)膚FF受體的多祀點(diǎn)多膚，化合物2: Xaai為Tyr，Xaa2為 NMe-Phe，Xaa3 為 Gin 時，序列為 Tyr-D-Ala-Gly-NMe-陸 e-Gln-Pro-Gln-Arg-陸 e-N 出。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述阿片和神經(jīng)膚FF受體的多祀點(diǎn)多膚，化合物3: Xaai為Tyr，Xaa2為 Wie，Xa￡i3為Gly時，序列為Tyr-D-Ala-Gl廠陸e-Gly- Pro-Gln-Arg-陸e-N出。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述阿片和神經(jīng)膚FF受體的多祀點(diǎn)多膚，化合物4: Xaai為Tyr，Xaa2為 F*he，Xaa3 為 Leu 時，序列為 Tyr-D-Ala-Gly-陸 e-Leu-Pro-Gln-Arg-陸 e-N 出。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述阿片和神經(jīng)膚FF受體的多祀點(diǎn)多膚，化合物5: Xaai為Tyr，Xaa2為 F*he，Xaa3 為 Met 時，序列為 Tyr-D-Ala-Gly-陸 e-Met-Pro-Gln-Arg-陸 e-N 出。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述阿片和神經(jīng)膚FF受體的多祀點(diǎn)多膚，化合物6: Xaai為Tyr，Xaa2為 F*he，Xaa3 為 D-Met 時，序列為 Tyr-D-Ala-Gly-陸 e-D-Met-Pro-Gln-Arg-陸 e-N 出。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述阿片和神經(jīng)膚FF受體的多祀點(diǎn)多膚，化合物7: Xaai為Tyr，Xaa2為 F*he，Xaa3為D-Leu時，序列為Tyr-D-Ala-Gly-陸e-D-Leu -Pro-Gln- Arg-陸e-N出。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述阿片和神經(jīng)膚FF受體的多祀點(diǎn)多膚，化合物8: Xaai為Tyr，Xaa2為 F*he，Xaa3 為 D-Ala 時，序列為 Tyr-D-Ala-Gly-陸 e-D-Ala-Pro-Gln-Arg-陸 e-N 出。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述阿片和神經(jīng)膚FF受體的多祀點(diǎn)多膚，化合物9:Xaai為Tyr，Xaa2 為 NMe-Phe，Xa￡i3 為 Gly 時，序列為 Tyr-D-Ala-Gly-NMe-陸 e-Gly-Pro-Gln-Arg-陸 e-N 出。11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述阿片和神經(jīng)膚FF受體的多祀點(diǎn)多膚的合成方法，包括W下工藝 步驟： i:.多膚的合成 t . 1樹脂預(yù)處理:Rink-Amide-MBHA樹脂在二氯甲燒中攬拌，使樹脂充分溶脹后減壓抽干 溶劑;最后加入DMF洗涂； ? .h脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù):在溶脹、抽干溶劑的樹脂中，加入體積比為1:1:98的六氨化晚、 1,8-二氮雜二環(huán)^--碳-7-締、DMF的混合溶液，攬拌反應(yīng)5 min后抽干，重復(fù)3次;最后加入 DMF洗涂，印檢，得到脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂； iUi氨基酸的縮合:依次將N-a-Fmoc保護(hù)氨基酸Fmoc-AA-〇H、N-徑基苯并Ξ氮挫、0-苯 并Ξ氮挫-N，N，N'，N'-四甲基脈-六氣憐酸鹽完全溶解于DMF中，再加入二異丙基乙胺后混 勻得混合溶液;然后加到步驟?; .??;所得脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂中，在氣氣保護(hù)下攬拌反應(yīng) 60 min，抽干溶劑；用DMF重復(fù)洗涂、抽干，巧檢后按步驟i: J:的工藝脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)，得到 脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的膚樹脂； Fmoc-AA-OH與脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂的摩爾量為1:2~1:5; N-a-Fmoc保護(hù)氨基酸Fmoc-AA-〇H、N-^基苯并Ξ氮挫、0-苯并Ξ氮挫-N，N，N'，N' -四甲 基脈-六氣憐酸鹽及二異丙基乙胺的摩爾比為1:1:1:2; i.娩膚鏈的延長 根據(jù)多膚的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，從c端開始依次選擇Ν-α-Fmoc保護(hù)的氨基酸，并將步驟?:. 所得 脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的樹脂按步驟;.m的工藝完成膚鏈的縮合，得到側(cè)鏈全保護(hù)的膚樹脂； S .膚鏈從樹脂上的切割：將步驟i . iv所得膚樹脂用DCM、MeOH交替洗涂，充分抽干溶劑 后，加入切割劑，于室溫下切割反應(yīng)2~3小時;過濾，濾液在不高于37°C的條件下充分減壓旋 干，然后用不高于-l〇°C的乙酸析出沉淀；吸除上清液，加水充分溶解沉淀后將乙酸從水相 中分離除去，水相通過冷凍干燥得到白色的粗膚固體粉末； 切割劑是由Ξ氣乙酸、Ξ異丙基硅烷、水W95 : 2.5 : 2.5的體積比混合形成的溶液； 切割劑的加入量為每克膚樹脂加入18ml的切割劑； W .多膚的脫鹽和純化：W體積濃度15~20%乙酸溶液為流動相，過S邱hadex G25交聯(lián)葡 聚糖凝膠柱;利用紫外檢測儀收集主峰后冷凍干燥，得脫鹽的膚化合物;再用反相高效液相 色譜柱對脫鹽的膚化合物進(jìn)行分離純化，經(jīng)分離后收集樣品主峰，得到多祀點(diǎn)多膚產(chǎn)品。12.權(quán)利要求1所述阿片和神經(jīng)膚FF受體的多祀點(diǎn)多膚在制備高效、低副作用鎮(zhèn)痛藥物 中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K1/04GK106084001SQ201610252648
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年4月21日 公開號201610252648.7, CN 106084001 A, CN 106084001A, CN 201610252648, CN-A-106084001, CN106084001 A, CN106084001A, CN201610252648, CN201610252648.7
【發(fā)明人】王銳, 方泉, 王子龍
【申請人】蘭州大學(xué)