禽類蛋殼膜中透明質(zhì)酸的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種禽類蛋殼膜中透明質(zhì)酸的提取方法，其包括以下步驟：殼膜與鈣化殼的分離；將殼膜干燥、粉碎；從粉碎殼膜中分離、提取總糖胺聚糖；去除總糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素，將透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素分離。本發(fā)明的方法可以分離出高純度的透明質(zhì)酸，直接從禽類蛋殼中提取透明質(zhì)酸，不僅來源廣泛，而且得到的透明質(zhì)酸來自動物的自然組織，分子量穩(wěn)定，無內(nèi)毒素。
【專利說明】
禽類蛋殼膜中透明質(zhì)酸的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于透明質(zhì)酸的提取領(lǐng)域，具體涉及一種禽類蛋殼膜中透明質(zhì)酸的提取方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸是一種富含陰離子的直鏈線性大分子多糖，能夠和動物體內(nèi)多種細胞生 長因子、酶、細胞因子以及受體相結(jié)合，誘發(fā)信號轉(zhuǎn)導，從而調(diào)控細胞生長、分化及凋亡。因 此，透明質(zhì)酸被廣泛用于醫(yī)藥(例如，用于治療關(guān)節(jié)炎、肌腱和軟組織損傷、作為癌癥納米藥 物佐劑等）、食品保健和化妝品（例如，用于抗皺化妝品等)領(lǐng)域。
[0003] 目前，透明質(zhì)酸的來源主要有兩種方法，一種是動物組織，如公雞雞冠、胎兒肚臍， 多來源于屠宰車間或醫(yī)院；另一種是通過微生物發(fā)酵。前一種方法由于動物組織產(chǎn)量有限， 限制透明質(zhì)酸的產(chǎn)量;后一種方法，由于產(chǎn)生的透明質(zhì)酸分子量(長度)較難把握，且容易受 內(nèi)毒素污染，影響了透明質(zhì)酸的進一步應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，實有必要提供一種禽類蛋殼膜中透明質(zhì)酸的提取方法，該方法可以分 離出高純度的透明質(zhì)酸，直接從禽類蛋殼中提取透明質(zhì)酸，不僅來源廣泛，而且得到的透明 質(zhì)酸來自動物的自然組織，分子量穩(wěn)定，無內(nèi)毒素。
[0005] 本發(fā)明提供的禽類蛋殼膜中透明質(zhì)酸的提取方法，包括以下步驟：
[0006] 殼膜與鈣化殼的分離：用體積濃度為2~20%乙酸，或者質(zhì)量濃度為1~5wt %的 EDTA二鈉鹽/EDTA四鈉鹽浸泡蛋殼，將殼膜分離；
[0007] 將殼膜干燥、粉碎；
[0008] 從粉碎殼膜中分離、提取總糖胺聚糖，具體包括:采用蛋白酶去除殼膜中的蛋白 質(zhì)；以及用陰離子交換柱/陰離子交換樹脂，依次采用不同濃度NaCl水溶液進行洗脫分離提 取總糖胺聚糖，或者用氯化十六烷吡啶進行沉淀、離心提取總糖胺聚糖;所述陰離子交換柱 為Vivapure Q Max Η陰離子交換柱；所述陰離子交換樹脂為強堿性陰離子交換樹脂 Lewatit MonoPlus M800；
[0009] 去除總糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素，具體包括：
[0010] i)用肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角質(zhì)素酶將肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角 質(zhì)素在水溶液或50mM，pH為7~9的Tris-HCl緩沖液中水解成碎片，得到反應液1備用；
[0011] ? )將反應液1循環(huán)2遍加入Vivapure Q Max Η陰離子交換柱或往反應液1中加入 強堿性陰離子交換樹脂Lewatit MonoPlus Μ800結(jié)合過夜（反應液1與樹脂體積比為（5~ 30) :1)，依次用不同濃度的NaCl水溶液洗脫、脫鹽得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素的 混合物;或者往反應液1中加入NaCl，使得最終NaCl的濃度為0.5M，煮3分鐘使酶變性沉淀， 之后離心、取上清液，往上清液加入含飽和乙酸鈉的體積濃度為70~95 %的乙醇，于2~8°C 過夜，以將透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物沉淀析出；
[0012] 將透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素分離，具體包括:采用Q-Sepharose陰離子 交換層析柱，$epaC〇re退)Easy Purification Systems純化系統(tǒng)或HPLC系統(tǒng)，用濃度范圍 為0.05~5M，濃度梯度為0.2~0.5M的NaCl水溶液對透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混 合物進行梯度洗滌和洗脫，設置檢測光波的激發(fā)波長214nm、發(fā)射波長280nm，收集、標記檢 測峰對應的透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素/硫酸皮膚素。
[0013] 優(yōu)選地，殼膜與|丐化殼的分離過程中，蛋殼浸泡的時間為12~96h。
[0014] 優(yōu)選地，所述將殼膜干燥、粉碎，具體包括:將殼膜冷凍干燥1~5天，或者于20~90 °C烘1~5天;用粉碎儀或超細粉碎儀將殼膜粉碎。
[0015] 優(yōu)選地，所述采用蛋白酶去除殼膜中的蛋白質(zhì)，具體包括：
[0016] 將殼膜粉懸浮于含0~0.6wt%十二烷基磺酸鈉的PBS緩沖液中，所述磷酸鹽緩沖 液的pH值為7~11，所述殼膜與PBS緩沖液的質(zhì)量比為1: (10~80);
[0017] 加入鏈霉蛋白酶Actinase E，于37~39°C下進行水浴處理12~28小時，Actinase E與殼膜的質(zhì)量比為1:(2~50);于90~95°C滅活Actinase E 10~30分鐘；
[0018] 加入蛋白酶K于53~56°C水浴處理6~24小時，蛋白酶K與殼膜質(zhì)量比為1:(70~ 100)，于90~95°C滅活蛋白酶K 10~40分鐘;或者用堿性蛋白酶于53~63°C水浴處理6~24 小時，酶與殼膜質(zhì)量比1:(80~100);于90~95°C滅活堿性蛋白酶10~40分鐘；
[0019] 用懸浮桶轉(zhuǎn)子3200~6000xg離心力離心上述經(jīng)蛋白酶消化后的樣品，取上清液備 用。
[0020] 優(yōu)選地，所述用陰離子交換柱/陰離子交換樹脂，依次采用不同濃度NaCl水溶液進 行洗脫分離提取總糖胺聚糖，具體包括:將上清液循環(huán)兩遍加入Vivapure Q Max Η陰離子 交換柱(或往上清液中加入強堿性陰離子交換樹脂Lewatit MonoPlus Μ800結(jié)合過夜，上清 液與樹脂體積比為（5-30): 1)，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗滌去除陰離子交換柱(或 陰離子交換樹脂)上的雜蛋白或雜質(zhì)，最后3.3M的NaCl水溶液洗脫獲得總糖胺聚糖鹽溶液， 將總糖胺聚糖鹽溶液用超濾管或透析袋脫鹽，所述超濾管或透析袋的截留量為3~10kDa; 或者將總糖胺聚糖鹽溶液用4~5倍體積的甲醇于-20~8°C沉淀12~18小時，再用體積濃度 95%甲醇連續(xù)洗滌沉淀3遍;將沉淀物凍干或空干得總糖胺聚糖；
[0021] 優(yōu)選地，所述用氯化十六烷吡啶進行沉淀、離心提取總糖胺聚糖，具體包括:直接 往上清液中加入氯化十六烷吡啶至每100mL上清液中含0.01~0.5g氯化十六烷吡啶，混勻 后于2~8 °C放置過夜以沉淀總糖胺聚糖，于2~8°C用固定角轉(zhuǎn)子15000~30000xg離心力離 心去除上清液，用含5~20wt%乙酸鉀的70~95%乙醇洗滌沉淀3遍，再用70~95%乙醇洗 滌沉淀3遍，空干沉淀，即得到總糖胺聚糖。
[0022]優(yōu)選地，所述用肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角質(zhì)素酶將肝素/硫酸乙酰肝 素、硫酸角質(zhì)素在水溶液或50mM Tris-HCl緩沖液中水解成碎片，具體包括:將總糖胺聚糖 溶解于水或50mM，pH為7~9的Tris-HCl緩沖液中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及 角質(zhì)素酶，于37°C反應12~24小時，以將肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素水解成碎片。
[0023] 優(yōu)選地，每微克總糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角質(zhì)素酶用量分 別為 0.01 ~0.15mU、0.1 ~lmU、0.5~3mU和 0.01 ~0.3mU。
[0024] 優(yōu)選地，所述將反應液1加入陰離子交換柱或往反應液1中加入陰離子交換樹脂結(jié) 合過夜，依次用不同濃度的NaCl水溶液洗脫、脫鹽得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素的 混合物，具體包括:將反應液1循環(huán)兩遍加入Vivapure Q Max Η陰離子交換柱或往反應液1 中加入強堿性陰離子交換樹脂Lewatit MonoPlus Μ800結(jié)合過夜，上清液與樹脂體積比為 (10-30): 1，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗滌去除陰離子交換柱或陰離子交換樹脂上糖 胺聚糖水解后的碎片及其它雜質(zhì)，再用3.3M的NaCl水溶液洗脫獲得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/ 硫酸皮膚素的混合鹽溶液，最后用超濾管或透析袋脫鹽，所述超濾管或透析袋的截留量3~ lOkDa;或者先用0.5~5倍體積的甲醇于-20~8°C沉淀12~18小時，用固定角轉(zhuǎn)子15000~ 30000xg離心力離心去除上清液，得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素沉淀，再用體積濃度 70~95%甲醇洗滌沉淀3遍，最后將糖胺聚糖凍干或空干，得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮 膚素混合物。
[0025]優(yōu)選地，所述往反應液1中加入NaCl，使得最終NaCl的濃度為0.5M，高溫水浴后離 心、取上清液，往上清液加入含飽和乙酸鈉的體積濃度為70~95 %的乙醇，于2~8 °C過夜， 以將透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物沉淀析出，具體包括:往反應液1加入NaCl， 使NaCl的最終濃度為0.5M，煮3分鐘(這里加入NaCl以促進肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以 及角質(zhì)素酶水浴變性沉淀，并且提高透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素的產(chǎn)率)后，用固定 角轉(zhuǎn)子15000~30000xg離心力離心，取上清液，往上清液加入2~5倍體積的含飽和乙酸鈉 的體積濃度為70~95%的乙醇，于2~8°C過夜，以將透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素沉 淀析出，最后用固定角轉(zhuǎn)子15000~30000xg離心力離心，再用體積濃度70~95%乙醇洗滌 沉淀3遍，空干，得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物。
[0026]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的禽類蛋殼膜中透明質(zhì)酸的提取方法可以從禽類蛋殼膜 中分離出高純度的透明質(zhì)酸，不僅來源廣泛，而且得到的透明質(zhì)酸來自動物的自然組織，分 子量穩(wěn)定，無內(nèi)毒素。
【具體實施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步具體詳細描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此，對于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進行。
[0028]本發(fā)明實施例提供了一種禽類蛋殼膜中透明質(zhì)酸的提取方法，該方法包括以下步 驟：
[0029] 1)殼膜與鈣化殼的分離：用體積濃度為2~20%乙酸，或者質(zhì)量濃度為1~5wt%的 乙二胺四乙酸二鈉鹽/乙二胺四乙酸四鈉鹽(EDTA二鈉鹽/EDTA四鈉鹽)浸泡蛋殼12~96h 后，手工剝離或震蕩分離，即可迅速分離、獲得大量殼膜；
[0030] 本發(fā)明采用體積濃度為2~20%乙酸，或者質(zhì)量濃度為1~5wt%的EDTA二鈉鹽/ m)TA四鈉鹽對禽類蛋殼進行處理，可以快速、高效的將殼膜與鈣化殼進行分離。
[0031] 2)將殼膜冷凍干燥1~5天，或者于20~90°C烘1~5天；用粉碎儀或超細粉碎儀將 殼膜粉碎；
[0032] 3)從粉碎殼膜中分離、提取總糖胺聚糖，具體包括以下步驟：
[0033] A.消化蛋白質(zhì)
[0034]將殼膜粉懸浮于含0~0.6wt%十二烷基磺酸鈉（SDS)的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖 液）中，該磷酸鹽緩沖液的pH值為7~11，所述殼膜與PBS的質(zhì)量比為1: (10~80);本發(fā)明使 用十二烷基磺酸鈉(SDS)的磷酸鹽緩沖液，可以增強后續(xù)蛋白酶的活性，有利于更好的降解 殼膜中的蛋白質(zhì)。
[0035] 加入鏈霉蛋白酶(Actinase E)，鏈霉蛋白酶與殼膜的質(zhì)量比為1:(2~50);于37~ 39°C下進行水浴處理12~28小時，期間間歇性地震蕩懸浮反應液，接著于90~95°C滅活 Actinase E 10~30分鐘；
[0036] 再加入蛋白酶K于53~56°C水浴處理6~24小時，蛋白酶K與殼膜的質(zhì)量比為1:(70 ~100)，之后于90~95°C滅活蛋白酶K 10~40分鐘；或者用堿性蛋白酶(alcalase)于53~ 63°C水浴處理6~24小時，堿性蛋白酶與殼膜的質(zhì)量比1:(80~100);之后于90~95°C滅活 alcalase 10 ~40 分鐘；
[0037] 本發(fā)明采用蛋白酶K或者堿性蛋白酶可以進一步降解未能被鏈霉蛋白酶降解的蛋 白質(zhì)，能夠更充分的將殼膜中的蛋白質(zhì)降解，同時蛋白酶K或者堿性蛋白酶在降解余下殼膜 蛋白質(zhì)的同時，還可以有效降解鏈霉蛋白酶，從而省去了后續(xù)去除鏈霉蛋白酶的過程，簡化 了工藝步驟。
[0038] 用懸浮桶轉(zhuǎn)子3200~6000xg離心力離心上述經(jīng)蛋白酶消化后的樣品，取上清液備 用；
[0039] B.提取總糖胺聚糖：
[0040] 將上清液循環(huán)兩遍加入Vivapure Q Max Η陰離子交換柱(或往上清液中加入強堿 性陰離子交換樹脂Lewatit MonoPlus Μ800結(jié)合過夜，以充分結(jié)合總糖胺聚糖，上清液與陰 離子交換樹脂的體積比為（5~30): 1)，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗滌陰離子交換柱 (或陰離子交換樹脂）以充分洗掉雜蛋白或其它雜質(zhì)，最后用3.3M的NaCl水溶液洗脫獲得總 糖胺聚糖鹽溶液，將總糖胺聚糖鹽溶液用超濾管或透析袋脫鹽去除NaCl，該超濾管或透析 袋的截留量為3~10kDa;或者將總糖胺聚糖鹽溶液用4~5倍體積的甲醇于-20~8°C沉淀12 ~18小時，固定角轉(zhuǎn)子15000~30000xg離心，再用體積濃度95%甲醇連續(xù)洗滌沉淀3遍;將 沉淀物凍干或空干得總糖胺聚糖，所得的總糖胺聚糖含有透明質(zhì)酸、肝素/硫酸乙酰肝素、 硫酸角質(zhì)素、以及硫酸軟骨素/硫酸皮膚素；
[0041 ] 或者，直接往上清液中加入氯化十六烷吡啶至每100mL上清液中含0.01~0.5g氯 化十六烷吡啶，混勻后于2~8°C放置過夜以充分沉淀總糖胺聚糖，于2~8°C用固定角轉(zhuǎn)子 15000~30000xg離心力離心去除上清液，用含5~20wt%乙酸鉀的70~95%乙醇洗滌沉淀3 遍，再用70~95%乙醇洗滌沉淀3遍，空干沉淀，即得到總糖胺聚糖，所得的總糖胺聚糖含有 透明質(zhì)酸、肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素、以及硫酸軟骨素/硫酸皮膚素。
[0042] 4)去除總糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸角質(zhì)素：
[0043] i)將上述總糖胺聚糖溶解于水或50mM，pH = 7~9的Tris-HCl緩沖液（Tris:Tris (hydroxymethyl)aminomethane，三輕甲基氨基甲燒）中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶 III以及角質(zhì)素酶，于37°C反應12~24小時，以將肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素水解成碎 片，得到反應液1備用，其中，每微克總糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角質(zhì) 素酶用量分別為0.01~〇.15mU、0.1~lmU、0.5~3mU和0.01~0.3mU;
[0044]采用Tris-HCl緩沖液可以增強肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III、尤其角質(zhì)素酶的活 性，使得肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素的水解更徹底。肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III配 合使用，可以更充分地將肝素/硫酸乙酰肝素降解成糖鏈碎片，其與陰離子交換柱或陰離子 交換樹脂結(jié)合很弱甚至不結(jié)合，所以容易被洗滌掉。
[0045] ii )將反應液1循環(huán)兩遍加入Vivapure Q Max Η陰離子交換柱(或往反應液1中加 入強堿性陰離子交換樹脂Lewatit MonoPlus Μ800結(jié)合過夜，反應液1與陰離子交換樹脂的 體積比為（10~30): 1)，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗滌陰離子交換柱(或陰離子交換 樹脂）以充分洗掉降解的糖鏈碎片或雜蛋白，再用3.3M的NaCl水溶液洗脫獲得透明質(zhì)酸、硫 酸軟骨素/硫酸皮膚素的混合鹽溶液，最后用超濾管或透析袋(該超濾管或透析袋的截留量 3~10kDa)脫鹽;或者先用0.5~5倍體積的甲醇于-20~8°C沉淀12~18小時，得透明質(zhì)酸、 硫酸軟骨素/硫酸皮膚素沉淀，再用體積濃度70~95 %甲醇連續(xù)洗滌沉淀3遍;最后將糖胺 聚糖凍干或空干，得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物；
[0046] 或者，往反應液1加入NaCl，使得最終NaCl的濃度為0.5M，煮3分鐘（這里加入NaCl 以促進肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角質(zhì)素酶水浴變性沉淀，并且提高透明質(zhì)酸、硫 酸軟骨素/硫酸皮膚素的產(chǎn)率)后，用固定角轉(zhuǎn)子15000~30000xg離心力離心，取上清液，往 上清液加入2~5倍體積的含飽和乙酸鈉的體積濃度為70~95 %的乙醇，于2~8 °C過夜，以 將透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素沉淀析出，最后用固定角轉(zhuǎn)子15000~30000xg離心力 離心，再用體積濃度70~95%乙醇洗滌沉淀3遍，空干，得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚 素混合物。
[0047] 5)將透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素分離
[0048] 米用Q-Sepharose陰離子交換層析柱，Se.pa.C〇re ?:Easy Purification Systems 純化系統(tǒng)或HPLC系統(tǒng)，用濃度范圍為0.05~5M，濃度梯度為0.2~0.5M的NaCl水溶液對透明 質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物進行梯度洗滌和洗脫，設置檢測光波的激發(fā)波長 214nm、發(fā)射波長280nm，收集、標記檢測峰對應的透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素/硫酸皮膚素。隨后 用超濾管或透析袋(截留量3-10kDa)脫鹽;或者用4~5倍體積的無水甲醇于-20~8°C分別 將透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素/硫酸皮膚素沉淀析出12~18小時，固定角轉(zhuǎn)子15000~30000xg 離心去除上清液，用體積濃度70~95 %甲醇分別洗滌透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素/硫酸皮膚素 二遍;再凍干或空干。
[0049] 6)透明質(zhì)酸的最終鑒定:將上述收獲的透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素/硫酸皮膚素分別 取少許，用透明質(zhì)酸酶于37°C降解過夜，每微克透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素/硫酸皮膚素中酶用 量分別為0.01~〇. 15mU，之后用二氨基吖啶酮標記，進行LC-MS分析，參考透明質(zhì)酸二糖標 準品，最終可以從上述吸收峰對應的幾個樣品中確定透明質(zhì)酸。
[0050] 本發(fā)明所述的禽類蛋殼包括但不限于雞、鴨、鵝、火雞、鴕鳥、孔雀、鵪鶉、鳥類等的 蛋殼。本發(fā)明所述的透明質(zhì)酸提取方法(含消化蛋白質(zhì)、提取總糖胺聚糖、去除總糖胺聚糖 中的肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸角質(zhì)素、將透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素分離)也 適用于其它動物組織(脫脂、脫礦或無脂、無礦的動物組織材料)中透明質(zhì)酸的提取。
[0051] 采用本發(fā)明的方法從禽類蛋殼膜中分離出高純度的透明質(zhì)酸，不僅來源廣泛，而 且得到的透明質(zhì)酸來自動物的自然組織，分子量穩(wěn)定，無內(nèi)毒素。
[0052] 實施例1
[0053] 一種禽類蛋殼膜中透明質(zhì)酸的提取方法，該方法包括以下步驟：
[0054] 1)殼膜與鈣化殼的分離：用體積濃度為3%乙酸，浸泡蛋殼12h后，手工剝離，即可 迅速分離、獲得大量殼膜；
[0055] 2)將殼膜冷凍干燥1天，用粉碎儀將殼膜粉碎；
[0056] 3)從粉碎殼膜中分離、提取總糖胺聚糖，具體包括以下步驟：
[0057] A.消化蛋白質(zhì)
[0058]將殼膜粉懸浮于含0.0 Olwt%十二烷基磺酸鈉(SDS)的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液， pH=8.4)中，所述殼膜與PBS的質(zhì)量比為1:50;
[0059] 加入鏈霉蛋白酶(Actinase E)，于38°C下進行水浴處理20小時，鏈霉蛋白酶與殼 膜的質(zhì)量比為1:10;于90°C滅活Actinase E 15分鐘；
[0060] 再加入蛋白酶K于55°C水浴處理10小時，蛋白酶K與殼膜質(zhì)量比為1:85,于95°C滅 活蛋白酶K 18分鐘；
[0061] 用懸浮桶轉(zhuǎn)子4500xg離心力離心上述經(jīng)蛋白酶消化后的樣品，取上清液備用； [0062] B.提取總糖胺聚糖：
[0063] 直接往上清液中加入氯化十六烷吡啶至每100mL上清液中含0.2g氯化十六烷吡 啶，混勻后于5°C放置過夜后，于5°C固定角轉(zhuǎn)子25000xg離心去除上清液，用含10wt%乙酸 鉀的95%乙醇洗滌沉淀3遍，再用95%乙醇洗滌沉淀3遍，空干沉淀，即得到總糖胺聚糖，所 得的總糖胺聚糖含有透明質(zhì)酸、肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素、硫酸軟骨素/硫酸皮膚 素。
[0064] 4)去除總糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸角質(zhì)素：
[0065] i)將上述總糖胺聚糖溶解于雙蒸水中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角 質(zhì)素酶，于37°C反應12小時，以將肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素水解成碎片，得到反應液 1備用，其中，每微克總糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角質(zhì)素酶用量分別為 0·0ImU、0·ImU、ImU和0·02mU。
[0066] ii )將反應液1循環(huán)兩遍加入Vivapure Q Max Η陰離子交換柱，依次用0· 1Μ、0·5Μ 的NaCl水溶液洗滌陰離子交換柱，再用3.3Μ的NaCl水溶液洗脫獲得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/ 硫酸皮膚素的混合鹽溶液，之后用超濾管脫鹽，所述超濾管的截留量8kDa，最后將糖胺聚糖 凍干，得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物。
[0067] 5)將透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素分離
[0068] 將透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物溶于雙蒸水形成待檢液，采用 Sepacore ?Easy Purification Systems純化系統(tǒng)，將待檢液循環(huán)兩遍注入Q-Sepharose 陰離子交換層析柱，用〇 · 1Μ、0 · 5M、1M、1 · 5M、2M、2 · 5M、3M、3 · 5Μ、4Μ、4 · 5M 的NaCl水溶液對透 明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物進行梯度洗滌和洗脫，設置激發(fā)波長A214nm、發(fā)射 波長A280nm，收集、標記檢測峰對應的透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素/硫酸皮膚素。用5倍體積的甲 醇于4°C分別將透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素沉淀12小時，用體積濃度90%甲醇分別 洗滌透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素三遍，再空干。將上述收獲的透明質(zhì)酸或硫酸軟骨 素/硫酸皮膚素分別取少許，用透明質(zhì)酸酶37°C降解過夜，用二氨基吖啶酮標記后進行LC-MS分析，參考透明質(zhì)酸二糖標準品從這些樣品中確定透明質(zhì)酸。
[0069] 實施例2
[0070] -種禽類蛋殼膜中透明質(zhì)酸的提取方法，該方法包括以下步驟：
[0071] 1)殼膜與鈣化殼的分離：用體積濃度為5%乙二胺四乙酸二鈉鹽，浸泡蛋殼36h后， 手工剝離或震蕩分離，即可迅速分離、獲得大量殼膜；
[0072] 2)將殼膜冷凍干燥2天，用超細粉碎儀將殼膜粉碎；
[0073 ] 3)從粉碎殼膜中分離、提取總糖胺聚糖，具體包括以下步驟：
[0074] A.消化蛋白質(zhì)
[0075]將殼膜粉懸浮于含0.002wt%十二烷基磺酸鈉(SDS)的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液， pH=8.5)中，所述殼膜與PBS的質(zhì)量比為1:40;
[0076] 加入鏈霉蛋白酶(Actinase E)，于37°C下進行水浴處理28小時，鏈霉蛋白酶與殼 膜的質(zhì)量比為1:40;于90°C滅活Actinase E 10分鐘；
[0077] 再加入蛋白酶K于53°C水浴處理10小時，蛋白酶K與殼膜質(zhì)量比為1:70,于95°C滅 活蛋白酶K 18分鐘；
[0078]用懸浮桶轉(zhuǎn)子4200xg離心力離心上述經(jīng)蛋白酶消化后的樣品，取上清液備用； [0079] B.提取總糖胺聚糖：
[0080] 直接往上清液中加入氯化十六烷吡啶至每100mL上清液中含O.lg氯化十六烷吡 啶，混勻后于6°C放置過夜后，于6°C固定角轉(zhuǎn)子30000xg離心力離心去除上清液，用含 10wt%乙酸鉀的90%乙醇洗滌沉淀3遍，再用90%乙醇洗滌沉淀3遍，空干沉淀，即得到總糖 胺聚糖，所得的總糖胺聚糖含有透明質(zhì)酸、硫酸角質(zhì)素、肝素/硫酸乙酰肝素、以及硫酸軟骨 素/硫酸皮膚素。
[0081] 4)去除總糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸角質(zhì)素：
[0082] i)將上述總糖胺聚糖溶解于水中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角質(zhì)素 酶，于37°C反應15小時，以將肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素水解成碎片，得到反應液1備 用，其中，每微克總糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角質(zhì)素酶的用量分別為 0·02mU、0·ImU、ImU和0·02mU;
[0083] ii )將反應液1循環(huán)兩遍加入Vivapure Q Max Η陰離子交換柱，依次用0· 1Μ、0·5Μ 的NaCl水溶液洗滌陰離子交換柱，再用3.3Μ的NaCl水溶液洗脫獲得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/ 硫酸皮膚素的混合鹽溶液;隨后用超濾管(該超濾管的截留量10kDa)脫鹽;最后將糖胺聚糖 凍干，得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物。
[0084] 5)將透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素分離
[0085] 將透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物溶于雙蒸水形成待檢液，采用 SepaCOTe ?Easy Purification Systems純化系統(tǒng)，將待檢液循環(huán)兩遍注入Q-Sepharose 陰離子交換層析柱，用0·1Μ、0·4Μ、0·7Μ、1Μ、1·3Μ、1·6Μ、1·8Μ、2·1Μ、2·4Μ、2·7Μ、3Μ、3·3Μ、 3.6Μ、3.9Μ、4.5Μ的NaCl水溶液對透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物進行梯度洗滌 和洗脫，設置檢測波為激發(fā)波長A214nm、發(fā)射波長A280nm，收集、標記檢測峰對應的透明質(zhì) 酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素。用4倍體積的甲醇于4°C分別將透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸 皮膚素沉淀18小時，用體積濃度95%甲醇分別洗滌透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素三 遍，再空干。將上述收獲的透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素/硫酸皮膚素分別取少許，用透明質(zhì)酸酶 37度降解過夜，用二氨基吖啶酮標記后進行LC-MS分析，參考透明質(zhì)酸二糖標準品從這些樣 品中確定透明質(zhì)酸。
[0086] 實施例3
[0087] -種禽類蛋殼膜中透明質(zhì)酸的提取方法，該方法包括以下步驟：
[0088] 1)殼膜與鈣化殼的分離：用體積濃度為10%乙酸浸泡蛋殼12h后，手工剝離，即可 迅速分離、獲得大量殼膜；
[0089] 2)將殼膜冷凍干燥3天，用超細粉碎儀將殼膜粉碎；
[0090] 3)從粉碎殼膜中分離、提取總糖胺聚糖，具體包括以下步驟：
[0091] A.消化蛋白質(zhì)
[0092]將殼膜粉懸浮于無十二烷基磺酸鈉(SDS)的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液，pH = 8.2) 中，所述殼膜與PBS的質(zhì)量比為1:30;
[0093] 加入鏈霉蛋白酶(Actinase E)，于39°C下進行水浴處理12小時，鏈霉蛋白酶與殼 膜的質(zhì)量比為1:10;于90°C滅活Actinase E 15分鐘；
[0094] 再加入蛋白酶K于55°C水浴處理10小時，蛋白酶K與殼膜的質(zhì)量比為1:90,于93°C 滅活蛋白酶K 30分鐘；
[0095]用懸浮桶轉(zhuǎn)子6〇o〇xg離心力離心上述經(jīng)蛋白酶處理的樣品，取上清液備用；
[0096] B.提取總糖胺聚糖：
[0097] 往上清液中加入強堿性陰離子交換樹脂Lewatit MonoPlus M800結(jié)合過夜，上清 與樹脂體積比為1:10，依次用0.1M、0.5M的NaCl洗滌陰離子交換樹脂，最后3.3M的NaCl洗脫 獲得總糖胺聚糖鹽溶液，隨后用透析袋(截留量6kDa)脫鹽，最后將總糖胺聚糖冷凍干燥，所 得的總糖胺聚糖含有透明質(zhì)酸、肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素、以及硫酸角 質(zhì)素。
[0098] 4)去除總糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸角質(zhì)素：
[0099] i)將上述總糖胺聚糖溶解于水中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角質(zhì)素 酶，于37°C反應12小時，以將肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素水解成碎片，得到反應液1備 用，其中，每微克總糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角質(zhì)素酶用量分別為 0·02mU、0·5mU、ImU和0·05mU;
[0100] ? )往上述反應液加入NaCl，終濃度0.5M，煮3分鐘后，固定角轉(zhuǎn)子20000 X g離心， 取上清，之后加入4.5倍體積的含飽和乙酸鈉的95%乙醇沉淀透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素/硫酸 皮膚素，4°C過夜，固定角轉(zhuǎn)子25000 X g離心，用無乙酸鉀的95%乙醇洗滌沉淀3遍，空干。
[0101] 5)將透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素分離
[0102] 將透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物溶于雙蒸水形成待檢液，采用 Sepacore ?Easy Purification Systems純化系統(tǒng)，將待檢液循環(huán)兩遍注入Q-Sepharose 陰離子交換層析柱，之后用〇· 1Μ、0·35Μ、0·7Μ、1 ·05Μ、1 ·4Μ、1 ·75Μ、2· 1Μ、2·45Μ、2·8Μ、 3.15Μ、3.5Μ、3.85Μ、4.2Μ的NaCl水溶液對透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物進行梯 度洗滌和洗脫，設置檢測波為激發(fā)波長A214nm、發(fā)射波長A280nm，收集、標記檢測峰對應的 透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素。用超濾管(截留量6kDa)脫鹽分別洗滌透明質(zhì)酸與硫 酸軟骨素/硫酸皮膚素，再凍干。將上述收獲的透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素/硫酸皮膚素分別取 少許，用透明質(zhì)酸酶37度降解過夜，用二氨基吖啶酮標記后進行LC-MS分析，參考透明質(zhì)酸 二糖標準品從這些樣品中確定透明質(zhì)酸。
[0103] 實施例4
[0104] -種禽類蛋殼膜中透明質(zhì)酸的提取方法，該方法包括以下步驟：
[0105] 1)殼膜與鈣化殼的分離：用質(zhì)量濃度為2wt%的EDTA二鈉鹽浸泡蛋殼72h后，手工 剝離或震蕩分離，即可迅速分離、獲得大量殼膜；
[0106] 2)將殼膜于90°C烘1天;用粉碎儀將殼膜粉碎；
[0107] 3)從粉碎殼膜中分離、提取總糖胺聚糖，具體包括以下步驟：
[0108] A.消化蛋白質(zhì)
[0109]將殼膜粉懸浮于含0.02wt%十二烷基磺酸鈉(SDS)的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液， pH=7 · 8)中，所述殼膜與PBS的質(zhì)量比為1:30;
[0110] 加入鏈霉蛋白酶(Actinase E)，于37.5°C下進行水浴處理15小時，鏈霉蛋白酶與 殼膜的質(zhì)量比為1:45;于92°C滅活Actinase E 12分鐘；
[0111] 再加入蛋白酶K于55°C水浴處理10小時，蛋白酶K與殼膜的質(zhì)量比為1:75,于95°C 滅活蛋白酶K 15分鐘；
[0112]用懸浮桶轉(zhuǎn)子5500xg離心力離心上述經(jīng)蛋白酶消化后的樣品，取上清液備用； [0113] B.提取總糖胺聚糖：
[0114] 將上清液循環(huán)兩遍加入Vivapure Q Max Η陰離子交換柱，依次用0.05M、0.1M的 NaCl洗滌陰離子交換柱，最后3.3M的NaCl洗脫獲得總糖胺聚糖鹽溶液，隨后用透析袋(截留 量3kDa)脫鹽，最后將總糖胺聚糖冷凍干燥，所得的總糖胺聚糖含有透明質(zhì)酸、肝素/硫酸乙 酰肝素、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素、以及硫酸角質(zhì)素。
[0115] 4)去除總糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸角質(zhì)素：
[0116] i)上述總糖胺聚糖溶解于50mM Tris-HCl緩沖液(該緩沖液的pH = 7 · 2;Tris :Tris (hydroxymethyl)aminomethane，三輕甲基氨基甲燒）中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶 III以及角質(zhì)素酶，于37°C反應18小時，以將肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素水解成碎片， 得到反應液1備用，其中，每微克總糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角質(zhì)素酶 用量分別為〇. ImU、0.1 mU、0.5mU和0.5mU;
[0117] ii )往反應液1中加入強堿性陰離子交換樹脂Lewatit MonoPlus M800結(jié)合過夜， 反應液1與陰離子交換樹脂的體積比為15:1，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗滌陰離子交 換樹脂，再用3.3M的NaCl水溶液洗脫獲得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素的混合鹽溶 液，用5倍體積的甲醇于6°C沉淀15小時，得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素沉淀，再用體 積濃度90 %甲醇連續(xù)洗滌沉淀3遍，最后將糖胺聚糖空干，得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮 膚素混合物。
[0118] 5)將透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素分離
[0119] 將透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物溶于雙蒸水形成待檢液，采用HPLC系 統(tǒng)，將待檢液循環(huán)兩遍注入Q_Sepharose陰離子交換層析柱，用0.1M、0.4M、0.7M、1M、1.3M、 1 · 6M、1 · 9M、2 · 2M、2 · 5M、2 · 8M、3 · 1M、3 · 4M、3 · 7M、4M 的 NaCl水溶液對透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素 / 硫酸皮膚素混合物進行梯度洗滌和洗脫，設置檢測波為激發(fā)波長A214nm、發(fā)射波長A280nm， 收集、標記檢測峰對應的透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素。用4倍體積的甲醇于-20°C分 別將透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素沉淀15小時，用體積濃度90%甲醇分別洗滌透明 質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素三遍，再空干。將上述收獲的透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素/硫酸 皮膚素分別取少許，用透明質(zhì)酸酶37度降解過夜，用二氨基吖啶酮標記后進行LC-MS分析， 參考透明質(zhì)酸二糖標準品從這些樣品中確定透明質(zhì)酸。實施例5
[0120] -種禽類蛋殼膜中透明質(zhì)酸的提取方法，該方法包括以下步驟：
[0121] 1)殼膜與鈣化殼的分離：用質(zhì)量濃度為5wt%的EDTA二鈉鹽浸泡蛋殼45h后，手工 剝離，即可迅速分離、獲得大量殼膜；
[0122] 2)將殼膜60°C烘3天，用超細粉碎儀將殼膜粉碎；
[0123] 3)從粉碎殼膜中分離、提取總糖胺聚糖，具體包括以下步驟：
[0124] A.消化蛋白質(zhì)
[0125] 將殼膜粉懸浮于含O.Olwt%十二烷基磺酸鈉(SDS)的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液， pH=8 · 0)中，所述殼膜與PBS的質(zhì)量比為1:25;
[0126] 加入鏈霉蛋白酶(Actinase E)，于38.2°C下進行水浴處理18小時，鏈霉蛋白酶與 殼膜的質(zhì)量比為1:50;于93°C滅活Actinase E 10分鐘；
[0127] 用堿性蛋白酶(alcalase)于53°C水浴處理20小時，酶與殼膜的質(zhì)量比1:80;于95 °C滅活alcalase 20分鐘；
[0128] 用懸浮桶轉(zhuǎn)子5000xg離心力離心上述經(jīng)蛋白酶消化的樣品，取上清液備用；
[0129] B.提取總糖胺聚糖：
[0130] 往上清液中加入陰離子交換樹脂Lewatit MonoPlus M800結(jié)合過夜，上清液與陰 離子交換樹脂的體積比為15:1，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗滌陰離子交換樹脂，最后 用3.3M的NaCl水溶液洗脫獲得總糖胺聚糖鹽溶液，將總糖胺聚糖鹽溶液用5倍體積的甲醇 于-20°C沉淀12小時，再用體積濃度95%甲醇連續(xù)洗滌沉淀3遍;將沉淀物空干得總糖胺聚 糖，所得的總糖胺聚糖含有透明質(zhì)酸、肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素、以及硫酸軟骨素/ 硫酸皮膚素；
[0131] 4)去除總糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸角質(zhì)素：
[0132] i)將上述總糖胺聚糖溶解于50mM Tris-HC1緩沖液（該緩沖液的pH = 7.6 ; Tris : Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三輕甲基氨基甲燒）中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素 酶III以及角質(zhì)素酶，于37°C反應20小時，以將肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素水解成碎 片，得到反應液1備用，其中，每微克總糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角質(zhì) 素酶用量分別為〇. 〇2mU、0.1 mU、1.5mU和0.05mU;
[0133] ii )往反應液1中加入強堿性陰離子交換樹脂Lewatit MonoPlus M800結(jié)合過夜， 反應液1與陰離子交換樹脂的體積比為15:1，先后用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗滌陰離子交 換樹脂，再用3.3M的NaCl水溶液洗脫獲得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素的混合鹽溶 液，用3倍體積的甲醇于_8°C沉淀18小時，得硫酸軟骨素/硫酸皮膚素、透明質(zhì)酸沉淀，再用 體積濃度95 %甲醇連續(xù)洗滌沉淀3遍，最后將糖胺聚糖空干，得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸 皮膚素混合物。
[0134] 5)將透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素分離
[0135] 將透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物溶于雙蒸水形成待檢液，采用 Sepa_COfe_.?Easy Purification Systems純化系統(tǒng)，將待檢液循環(huán)兩遍注入Q-Sepharose 陰離子交換層析柱，用0·1Μ、0·4Μ、0·7Μ、1Μ、1·3Μ、1·6Μ、1·9Μ、2·2Μ、2·5Μ、2·8Μ、3·1Μ、3·4Μ、 3.7Μ、4Μ的NaCl水溶液對透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物進行梯度洗滌和洗脫， 設置檢測波為激發(fā)波長A214nm、發(fā)射波長A280nm，收集、標記檢測峰對應的透明質(zhì)酸與硫酸 軟骨素/硫酸皮膚素。用超濾管（截留量8kDa)脫鹽洗滌透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚 素，再凍干。將上述收獲的透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素/硫酸皮膚素分別取少許，用透明質(zhì)酸酶 37度降解過夜，用二氨基吖啶酮標記后進行LC-MS分析，參考透明質(zhì)酸二糖標準品從這些樣 品中確定透明質(zhì)酸。
[0136] 實施例6
[0137] -種禽類蛋殼膜中透明質(zhì)酸的提取方法，該方法包括以下步驟：
[0138] 1)殼膜與鈣化殼的分離：用質(zhì)量濃度為3wt%的EDTA二鈉鹽浸泡蛋殼72h后，手工 剝離或震蕩分離，即可迅速分離、獲得大量殼膜；
[0139] 2)將殼膜于60°C烘2天，用超細粉碎儀將殼膜粉碎；
[0140] 3)從粉碎殼膜中分離、提取總糖胺聚糖，具體包括以下步驟：
[0141] A.消化蛋白質(zhì)
[0142] 將殼膜粉懸浮于含O.Olwt%十二烷基磺酸鈉(SDS)的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液， ρΗ=8·0)中，所述殼膜與PBS的質(zhì)量比為1:50;
[0143] 加入鏈霉蛋白酶(Actinase Ε)，于38°C下進行水浴處理18小時，鏈霉蛋白酶與殼 膜的質(zhì)量比為1:35;于91°C滅活Actinase E 18分鐘；
[0144] 用堿性蛋白酶(alcalase)于56°C水浴處理6小時，酶與殼膜的質(zhì)量比1:100;于95 °C 滅活 alcalase 15 分鐘；
[0145] 用懸浮桶轉(zhuǎn)子5500xg離心力離心上述經(jīng)蛋白酶消化后的樣品，取上清液備用；
[0146] B.提取總糖胺聚糖：
[0147] 將上清液循環(huán)兩遍加入Vivapure Q Max Η陰離子交換柱，依次用0.1M、0.5M的 NaCl水溶液洗滌陰離子交換柱，最后用3.3M的NaCl水溶液洗脫獲得總糖胺聚糖鹽溶液;將 總糖胺聚糖鹽溶液用4倍體積的甲醇于_12°C沉淀18小時，用固定角轉(zhuǎn)子23000xg離心力離 心棄上清，再用體積濃度95%甲醇連續(xù)洗滌沉淀3遍;將沉淀物空干得總糖胺聚糖，所得的 總糖胺聚糖含有透明質(zhì)酸、肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素、以及硫酸軟骨素/硫酸皮膚 素；
[0148] 4)去除總糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸角質(zhì)素：
[0149] i)將上述總糖胺聚糖溶解于50mM Tris-HCl緩沖液（該緩沖液的pH = 7.5;Tris: Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三輕甲基氨基甲燒）中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素 酶III以及角質(zhì)素酶，于37°C反應14小時，以將肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素水解成碎 片，得到反應液1備用，其中，每微克總糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角質(zhì) 素酶用量分別為〇. ImU、0 ImU、0.5mU和0.1 mU;
[0150] ii )將反應液1循環(huán)兩遍加入Vivapure Q Max Η陰離子交換柱，依次用0· 1Μ、0·5Μ 的NaCl水溶液洗滌陰離子交換柱，再用3.3Μ的NaCl水溶液洗脫獲得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/ 硫酸皮膚素的混合鹽溶液，用5倍體積的甲醇于_20°C沉淀12小時，得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨 素/硫酸皮膚素沉淀，再用體積濃度85%甲醇連續(xù)洗滌沉淀3遍，最后將糖胺聚糖空干，得透 明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物。
[0151] 5)將透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素分離
[0152] 將透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物溶于雙蒸水形成待檢液，采用HPLC純 化系統(tǒng)，將待檢液循環(huán)兩遍注入Q-Sepharose陰離子交換層析柱，用0.1M、0.4M、0.7M、1M、 1 · 3M、1 · 6M、1 · 9M、2 · 2M、2 · 5M、2 · 8M、3 · 1M、3 · 4M、3 · 7M的NaCl水溶液對透明質(zhì)酸、硫酸軟骨 素/硫酸皮膚素混合物進行梯度洗滌和洗脫，設置檢測波為激發(fā)波長A214nm、發(fā)射波長 A280nm，收集、標記檢測峰對應的透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素。用4.2倍體積的甲醇 于_8°C分別將透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素沉淀15小時，用體積濃度90%甲醇分別 洗滌透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素三遍，再空干。將上述收獲的透明質(zhì)酸或硫酸軟骨 素/硫酸皮膚素分別取少許，用透明質(zhì)酸酶37度降解過夜，用二氨基吖啶酮標記后進行LC-MS分析，參考透明質(zhì)酸二糖標準品從這些樣品中確定透明質(zhì)酸。
[0153] 實施例7
[0154] -種禽類蛋殼膜中透明質(zhì)酸的提取方法，該方法包括以下步驟：
[0155] 1)殼膜與鈣化殼的分離：用質(zhì)量濃度為2%的EDTA四鈉鹽浸泡蛋殼80h后，手工剝 離或震蕩分離，即可迅速分離、獲得大量殼膜；
[0156] 2)將殼膜于50°C烘干4天，用超細粉碎儀將殼膜粉碎；
[0157] 3)從粉碎殼膜中分離、提取糖胺聚糖，具體包括以下步驟：
[0158] A.消化蛋白質(zhì)
[0159]將殼膜粉懸浮于含0.005wt%十二烷基磺酸鈉(SDS)的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液， pH=8.2)中，所述殼膜與PBS的質(zhì)量比為1:60;
[0160] 加入鏈霉蛋白酶(Actinase E)，于39°C下進行水浴處理15小時，鏈霉蛋白酶與殼 膜的質(zhì)量比為1:20;于95°C滅活Actinase E 12分鐘；
[0161 ] 用堿性蛋白酶(alcalase)于55°C水浴處理15小時，酶與殼膜的質(zhì)量比1:85;于94 °C滅活alcalase 25分鐘；
[0162] 用懸浮桶轉(zhuǎn)子4800xg離心力離心上述經(jīng)蛋白酶消化后的樣品，取上清液備用；
[0163] B.提取總糖胺聚糖：
[0164] 往上清液中加入強堿性陰離子交換樹脂Lewatit MonoPlus M800結(jié)合過夜，上清 液與陰離子交換樹脂的體積比為20:1，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗滌陰離子交換樹 月旨，最后用3.3M的NaCl水溶液洗脫獲得總糖胺聚糖鹽溶液;將總糖胺聚糖鹽溶液用透析袋 脫鹽，該透析袋的截留量為10kDa，將脫鹽后的溶液凍干得總糖胺聚糖，所得的總糖胺聚糖 含有透明質(zhì)酸、肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素、以及硫酸軟骨素/硫酸皮膚素；
[0165] 4)去除總糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸角質(zhì)素：
[0166] i)將上述總糖胺聚糖溶解于50mM Tris-HCl緩沖液(該緩沖液的pH = 7.2;Tris: Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三輕甲基氨基甲燒）中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素 酶III以及角質(zhì)素酶，于37°C反應13小時，以將肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素水解成碎 片，得到反應液1備用，其中，每微克總糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角質(zhì) 素酶用量分別為〇. 15mU、0.5mU、0.5mU和0.2mU;
[0167] ii )往反應液1加入NaCl，使得最終NaCl的濃度為0.5M，煮5分鐘后，用固定角轉(zhuǎn)子 25000xg離心力離心，取上清液，往上清液加入4倍體積的含飽和乙酸鈉的體積濃度為95% 的乙醇，于4°C過夜，以將透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素沉淀析出，最后用固定角轉(zhuǎn)子 25000xg離心力離心，再用體積濃度95 %乙醇洗滌沉淀3遍，空干，得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/ 硫酸皮膚素混合物。
[0168] 5)將透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素分離
[0169] 將透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物溶于雙蒸水形成待檢液，采用HPLC純 化系統(tǒng)，將待檢液循環(huán)兩遍注入Q-Sepharose陰離子交換層析柱，用0.1M、0.4M、0.7M、1M、 1 · 3M、1 · 6M、1 · 9M、2 · 2M、2 · 5M、2 · 8M、3 · 1M、3 · 4M、3 · 7M、4M的NaCl水溶液對透明質(zhì)酸、硫酸軟 骨素/硫酸皮膚素混合物進行梯度洗滌和洗脫，設置檢測波為激發(fā)波長A214nm、發(fā)射波長 A280nm，收集、標記檢測峰對應的透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素。隨后用超濾管(截留 量lOkDa)脫鹽洗滌透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素，再凍干。將上述收獲的透明質(zhì)酸或 硫酸軟骨素/硫酸皮膚素分別取少許，用透明質(zhì)酸酶37度降解過夜，用二氨基吖啶酮標記后 進行LC-MS分析，參考透明質(zhì)酸二糖標準品從這些樣品中確定透明質(zhì)酸。
[0170] 實施例8
[0171] -種禽類蛋殼膜中透明質(zhì)酸的提取方法，該方法包括以下步驟：
[0172] 1)殼膜與鈣化殼的分離：用質(zhì)量濃度為5wt%的EDTA四鈉鹽浸泡蛋殼36h后，手工 剝離或震蕩分離，即可迅速分離、獲得大量殼膜；
[0173] 2)將殼膜冷凍干燥2天，用超細粉碎儀將殼膜粉碎；
[0174] 3)從粉碎殼膜中分離、提取總糖胺聚糖，具體包括以下步驟：
[0175] A.消化蛋白質(zhì)
[0176] 將殼膜粉懸浮于含0.005wt%十二烷基磺酸鈉(SDS)的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液， pH=7.5)中，所述殼膜與PBS的質(zhì)量比為1:70;
[0177] 加入鏈霉蛋白酶(Actinase E)，于37°C下進行水浴處理20小時，鏈霉蛋白酶與殼 膜的質(zhì)量比為1:8;于94°C滅活Actinase E 12分鐘；
[0178] 用堿性蛋白酶(alcalase)于55°C水浴處理12小時，酶與殼膜的質(zhì)量比1:80;于94 °C滅活alcalase 25分鐘；
[0179] 用懸浮桶轉(zhuǎn)子5200xg離心力離心上述經(jīng)蛋白酶消化后的樣品，取上清液備用；
[0180] B.提取總糖胺聚糖：
[0181] 往上清液中加入強堿性陰離子交換樹脂Lewatit MonoPlus M800結(jié)合過夜，上清 液與陰離子交換樹脂的體積比為12:1，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗滌陰離子交換樹 月旨，最后用3.3M的NaCl水溶液洗脫獲得總糖胺聚糖鹽溶液，將糖胺聚糖鹽溶液用超濾管脫 鹽，該超濾管的截留量為6kDa，將脫鹽后的溶液凍干得總糖胺聚糖，所得的總糖胺聚糖含有 透明質(zhì)酸、肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素、以及硫酸軟骨素/硫酸皮膚素；
[0182] 4)去除總糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸角質(zhì)素：
[0183] i)將上述總糖胺聚糖溶解于50mM Tris-HCl緩沖液（該緩沖液的pH = 7.6;Tris: Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三輕甲基氨基甲燒）中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素 酶III以及角質(zhì)素酶，于37°C反應12小時，以將肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素水解成碎 片，得到反應液1備用，其中，每微克總糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角質(zhì) 素酶用量分別為〇. 〇5mU、0.3mU、0.8mU 和0.03mU;
[0184] ii )往反應液1加入NaCl，使NaCl的終濃度為0.5M，煮5分鐘后，用固定角轉(zhuǎn)子 24000xg離心力離心，取上清液，往上清液加入5倍體積的含飽和乙酸鈉的體積濃度為95% 的乙醇，于2°C過夜，以將透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素沉淀析出，最后用固定角轉(zhuǎn)子 24000xg離心力離心，再用體積濃度95 %乙醇洗滌沉淀3遍，空干，得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/ 硫酸皮膚素混合物。
[0185] 5)將透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素分離
[0186] 將透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物溶于雙蒸水形成待檢液，采用HPLC純 化系統(tǒng)，將待檢液循環(huán)兩遍注入Q-Sepharose陰離子交換層析柱，用0.1M、0.4M、0.7M、1M、 1 · 3M、1 · 6M、1 · 9M、2 · 2M、2 · 5M、2 · 8M、3 · 1M、3 · 4M、3 · 7M、4M的NaCl水溶液對透明質(zhì)酸、硫酸軟 骨素/硫酸皮膚素混合物進行梯度洗滌和洗脫，設置檢測波為激發(fā)波長A214nm、發(fā)射波長 A280nm，收集、標記檢測峰對應的透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素。用4倍體積的甲醇 于-10°C分別將透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素沉淀20小時，固定角轉(zhuǎn)子23000Xg離心 棄上清，用體積濃度85%甲醇分別洗滌透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素三遍，再空干。 將上述收獲的透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素/硫酸皮膚素分別取少許，用透明質(zhì)酸酶37°C降解過 夜，用二氨基吖啶酮標記后進行LC-MS分析，參考透明質(zhì)酸二糖標準品從這些樣品中確定透 明質(zhì)酸。
[0187]本發(fā)明并不局限于上述實施方式，如果對本發(fā)明的各種改動或變形不脫離本發(fā)明 的精神和范圍，倘若這些改動和變形屬于本發(fā)明的權(quán)利要求或等同技術(shù)范圍之內(nèi)，則本發(fā) 明也意圖包含這些改動和變形。
【主權(quán)項】
1. 一種禽類蛋殼膜中透明質(zhì)酸的提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： 殼膜與鈣化殼的分離：用體積濃度為2~20%乙酸，或者質(zhì)量濃度為1~5wt%的EDTA二 鈉鹽/EDTA四鈉鹽浸泡蛋殼，將殼膜分離； 將殼膜干燥、粉碎； 從粉碎殼膜中分離、提取總糖胺聚糖，具體包括:采用蛋白酶去除殼膜中的蛋白質(zhì)；以 及用陰離子交換柱/陰離子交換樹脂，依次采用不同濃度NaCl水溶液進行洗脫分離提取總 糖胺聚糖，或者用氯化十六烷吡啶進行沉淀、離心提取總糖胺聚糖； 去除總糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素，具體包括： i) 用肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角質(zhì)素酶將肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素 在水溶液或50mM，pH為7~9的Tris-HCl緩沖液中水解成碎片，得到反應液1備用； ii) 將反應液1加入陰離子交換柱或往反應液1中加入陰離子交換樹脂結(jié)合過夜，依次 用不同濃度的NaCl水溶液洗脫、脫鹽得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素的混合物;或者 往反應液1中加入NaCl，使NaCl的最終濃度為0.5M，煮沸后離心、取上清液，往上清液加入含 飽和乙酸鈉的體積濃度為70~95%的乙醇，于2~8°C過夜，以將透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫 酸皮膚素混合物沉淀析出； 將透明質(zhì)酸與硫酸軟骨素/硫酸皮膚素分離，具體包括:采用Q-Sepharose陰離子交換 層析柱，Sepacore ? Basy Purif ication Systems純化系統(tǒng)或HPLC系統(tǒng)，用0 · 〇5~?5Μ的 NaCl水溶液對透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物進行梯度洗滌和洗脫，設置檢測光 波的激發(fā)波長214nm、發(fā)射波長280nm，收集、標記檢測峰對應的透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素/硫 酸皮膚素。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，殼膜與鈣化殼的分離過程中，蛋殼浸泡的 時間為12~96h。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述將殼膜干燥、粉碎，具體包括:將殼膜 冷凍干燥1~5天，或者于20~90°C烘1~5天；用粉碎儀或超細粉碎儀將殼膜粉碎。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用蛋白酶去除殼膜中的蛋白質(zhì)，具 體包括： 將殼膜粉懸浮于含〇~〇.6wt%十二烷基磺酸鈉的PBS緩沖液中，所述磷酸鹽緩沖液的 pH值為7~11，所述殼膜與PBS緩沖液的質(zhì)量比為1: (10~80); 加入鏈霉蛋白酶Actinase E，于37~39°C水浴處理12~28小時，Actinase E與殼膜的 質(zhì)量比為1: (2~50);于90~95°C滅活Actinase E 10~30分鐘； 加入蛋白酶K于53~56°C水浴處理6~24小時，蛋白酶K與殼膜質(zhì)量比為1:(70~100)， 于90~95°C滅活蛋白酶K 10~40分鐘;或者用堿性蛋白酶于53~63°C水浴處理6~24小時， 酶與殼膜質(zhì)量比1: (80~100)，于90~95°C滅活堿性蛋白酶10~40分鐘； 用懸浮桶轉(zhuǎn)子3200~6000xg離心力離心上述經(jīng)蛋白酶消化后的樣品，取上清液備用。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述用陰離子交換柱/陰離子交換樹脂，依 次采用不同濃度NaCl水溶液進行洗脫分離提取總糖胺聚糖，具體包括:將上清液加入陰離 子交換柱，或往上清液中加入陰離子交換樹脂結(jié)合過夜，上清液與樹脂體積比為(5~30): 1; 依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗滌去除陰離子交換柱或陰離子交換樹脂上的雜蛋白 或雜質(zhì)，最后3.3M的NaCl水溶液洗脫獲得總糖胺聚糖鹽溶液，將總糖胺聚糖鹽溶液用超濾 管或透析袋脫鹽，所述超濾管或透析袋的截留量為3~IOkDa;或者將總糖胺聚糖鹽溶液用4 ~5倍體積的甲醇于-20~8°C沉淀12~18小時，用固定角轉(zhuǎn)子15000~30000xg離心力離心 去除上清液，再用體積濃度95%甲醇連續(xù)洗滌沉淀3遍;將沉淀物凍干或空干得總糖胺聚 糖。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述用氯化十六烷吡啶進行沉淀、離心提 取總糖胺聚糖，具體包括:直接往上清液中加入氯化十六烷吡啶至每IOOmL上清液中含0.01 ~0.5g氯化十六燒P比啶，混勾后于2~8°C放置過夜，于2~8°C用固定角轉(zhuǎn)子15000~ 30000xg離心力離心去除上清液，用含5~20wt%乙酸鉀的70~95%乙醇洗滌沉淀3遍，再用 70~95 %乙醇洗滌沉淀3遍，空干沉淀，即得到總糖胺聚糖。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述用肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及 角質(zhì)素酶將肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素在水溶液或50mMTris-HCl緩沖液中水解成碎 片，具體包括:將總糖胺聚糖溶解于水或50mM，pH為7~9的Tris-HCl緩沖液中，加入肝素酶 I、肝素酶II、肝素酶III以及角質(zhì)素酶，于37°C反應12~24小時，以將肝素/硫酸乙酰肝素、 硫酸角質(zhì)素水解成碎片。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，每微克總糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、 肝素酶ΠΙ以及角質(zhì)素酶用量分別為0.01~0.15mU、0.1~lmU、0.5~3mU和0.01~0.3mU。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述將反應液1加入陰離子交換柱或往反 應液1中加入陰離子交換樹脂結(jié)合過夜，依次用不同濃度的NaCl水溶液洗滌結(jié)合不緊密的 肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素碎片以及其它雜質(zhì)，最后洗脫、脫鹽得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨 素/硫酸皮膚素的混合物，具體包括:將反應液1加入陰離子交換柱或往反應液1中加入陰離 子交換樹脂結(jié)合過夜，上清液與陰離子交換樹脂體積比為（5~30):1，依次用0.1M、0.5M的 NaCl水溶液洗滌去除陰離子交換柱或陰離子交換樹脂中的糖胺聚糖碎片及其它雜質(zhì)，再用 3.3M的NaCl水溶液洗脫獲得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素的混合鹽溶液;最后或者用 超濾管或透析袋脫鹽，所述超濾管或透析袋的截留量3~IOkDa;或者先用0.5~5倍體積的 甲醇于-20~8°C沉淀12~18小時，用固定角轉(zhuǎn)子15000~30000xg離心力離心去除上清液， 得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素沉淀，再用體積濃度70~95 %甲醇洗滌沉淀3遍，最后 將糖胺聚糖凍干或空干，得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物。10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的方法，其特征在于，所述往反應液1中加入NaCMi NaCl的最終濃度為0.5M，高溫水浴，離心、取上清液，往上清液加入含飽和乙酸鈉的體積濃 度為70~95%的乙醇，于2~8°C過夜，以將透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物沉淀 析出，具體包括:往反應液1加入NaCl，使得最終NaCl的濃度為0.5M，煮3分鐘后，用固定角轉(zhuǎn) 子15000~30000xg離心力離心，取上清液，往上清液加入2~5倍體積的含飽和乙酸鈉的體 積濃度為70~95%的乙醇，于2~8°C過夜，以將透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素沉淀析 出，最后用固定角轉(zhuǎn)子15000~30000xg離心力離心，再用體積濃度70~95%乙醇洗滌沉淀3 遍，空干，得透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素混合物。
【文檔編號】C08B37/08GK105884933SQ201610266214
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月26日
【發(fā)明人】劉長國, 趙紅娟
【申請人】劉長國