一種去除透明質(zhì)酸中熱源的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種去除透明質(zhì)酸中熱源的方法，該方法先后結(jié)合層析、超濾和普通過濾，符合多糖純化的工藝流程，在有效去除熱源的同時(shí)實(shí)現(xiàn)多糖的純化，且不影響多糖自身性質(zhì)。此外，本發(fā)明通過對(duì)過濾模式、過濾壓力、膜孔徑等條件的優(yōu)化設(shè)計(jì)，簡(jiǎn)化了操作步驟和操作時(shí)間，從而降低了生產(chǎn)成本、提升處理量，利用本發(fā)明方法可將熱源含量降低至醫(yī)療要求范圍內(nèi)，并且在去除熱源的同時(shí)不影響制品本身的性質(zhì)，適合規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用。
【專利說明】
一種去除透明質(zhì)酸中熱源的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種去除透明質(zhì)酸中熱源的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸是具有較高臨床價(jià)值的生化藥物，廣泛應(yīng)用于各類眼科手術(shù)，還可用于 治療關(guān)節(jié)炎和加速傷口愈合。
[0003] 透明質(zhì)酸(HA)是構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨和滑液的主要成分，當(dāng)發(fā)生骨性關(guān)節(jié)炎(0A)、類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎(RA)以及其他感染性和非感染性關(guān)節(jié)疾病時(shí)，HA在關(guān)節(jié)內(nèi)的產(chǎn)生代謝發(fā)生異 常，滑液中HA的濃度和相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)明顯降低，軟骨發(fā)生降解和破壞導(dǎo)致關(guān)節(jié)生理功 能障礙。透明質(zhì)酸具有黏彈性，對(duì)于骨關(guān)節(jié)維持良好生理功能是至關(guān)重要的。
[0004] 熱源是革蘭氏陰性菌菌體中存在的毒性物質(zhì)的總稱，此類物質(zhì)由菌體裂解后釋 放，又稱為"內(nèi)毒素"。熱源耐熱性較強(qiáng)，在100°C的高溫下加熱1小時(shí)也不會(huì)被破壞，只有在 160°C的溫度下加熱2到4個(gè)小時(shí)，或用強(qiáng)堿、強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑加溫煮沸30分鐘才能破壞它的 生物活性。與外毒素不同之處在于:熱源不能被稀甲醛溶液脫去毒性成為類毒素。少量熱源 即可引起機(jī)體發(fā)熱，嚴(yán)重的可引起微循環(huán)障礙、熱源休克及播散性血管內(nèi)凝血等。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)熱源主要的去除方法包括，活性炭吸附法、化學(xué)降解法、層析法、 相分離法以及超濾法。其中活性炭吸附法是一種應(yīng)用較早的去熱源方法。但活性炭對(duì)各類 不同成分的吸附作用研究尚不清楚，在吸附熱源的同時(shí)會(huì)吸附部分有效成分?；瘜W(xué)降解法 是以強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或氧化物等使熱源降解的方法。這種方法有可能造成有效成分的降解或失 活，因此，該方法的使用需結(jié)合產(chǎn)品的理化性質(zhì)，透明質(zhì)酸等產(chǎn)品不適用。層析法包括離子 交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析等。層析法選擇性差，由于熱源在高鹽溶液中容易形成 聚集體，往往需要多種不同的層析方法相結(jié)合才能達(dá)到去除熱源的目的，而這將需要耗費(fèi) 大量時(shí)間。相分離法雖然操作簡(jiǎn)單快速，但處理量小，并且中間有低溫到高溫的溫度變化， 這對(duì)不穩(wěn)定的透明質(zhì)酸極為不利。此外，后續(xù)抽提試劑的去除也是一個(gè)問題。超濾是以壓力 差為推動(dòng)力的膜分離過程，可廣泛用于微粒的脫除，其中包括細(xì)菌、病毒、熱原和其他異物 的去除。在此情況下，如何開發(fā)一種高效的熱源去除方法，在保證產(chǎn)品活性的基礎(chǔ)上提升去 除率、降低產(chǎn)品成本成為了亟待解決的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種去除透明質(zhì)酸中熱源的方法，以 解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的熱源去除效率較低的技術(shù)問題。
[0007] 本發(fā)明解決的另一技術(shù)問題是提供一種不影響透明質(zhì)酸成分和性質(zhì)的熱源去除 方法。
[0008] 本發(fā)明解決的再一技術(shù)問題是提供一種降低透明質(zhì)酸中熱源去除工藝的成本。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0010] -種去除透明質(zhì)酸中熱源的方法，包括以下步驟：
[0011] 1)對(duì)待處理樣品進(jìn)行層析純化，收集目的多糖；
[0012] 2)取步驟1)得到的目的多糖利用超濾膜包進(jìn)行超濾，收集濾過液，其中膜包進(jìn)口 壓力為3〇~40psi，回流口壓力為10~Kpsi ;
[0013] 3)取步驟2)產(chǎn)物用0.22~0.45μπι孔徑的濾膜過濾，收集濾過液。
[0014]優(yōu)選的，步驟2)所述膜包中的膜面積與待處理樣品總量的比例不低于0.1ft2/L。
[0015] 優(yōu)選的，步驟2)用于超濾的加壓栗對(duì)每平方英尺膜面積其流量不低于1.2L/min。
[0016] 優(yōu)選的，步驟3)收集濾過液后，利用NaOH溶液或H3P〇4溶液或NaCLO溶液或 Tergazyme清洗劑或Henkel P3-11清洗膜包;在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)選的，所述NaOH溶液的濃 度為0.1~0.5mM。
[0017] 優(yōu)選的，步驟2)所述膜包的截留分子量為100~1000KD。
[0018]優(yōu)選的，步驟2)所述膜包的截留分子量為1~100KD。
[0019] 優(yōu)選的，步驟2)對(duì)目的多糖超濾后，利用緩沖液繼續(xù)執(zhí)行超濾3~5min，收集濾過 的緩沖液與超濾后的目的多糖混合，而后執(zhí)行步驟3)。
[0020] 優(yōu)選的，步驟2)所述的超濾為切向流過濾。
[0021] 優(yōu)選的，步驟1)所述的層析是親和層析或離子交換層析或疏水層析或凝膠過濾層 析。
[0022] 在以上技術(shù)方案中，層析純化可以根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇相應(yīng)的填料，可以是特異 性的也可以非特異性的純化目的多糖，該步驟一方面可以對(duì)多糖起到純化作用，同時(shí)可以 去除部分熱源。步驟2)中利用膜包執(zhí)行超濾，在特定的截留分子量及壓力條件下一方面能 夠有效去除熱源，同時(shí)還能夠?qū)悠范嗵瞧鸬綕饪s作用，便于后續(xù)生產(chǎn)。在執(zhí)行超濾操作 后，進(jìn)一步以〇. 22~0.45μπι孔徑的濾膜執(zhí)行過濾能進(jìn)一步去除熱源，該孔徑條件下對(duì)過濾 壓力要求不大，能夠滿足規(guī)模化處理的工藝要求。
[0023] 在優(yōu)選技術(shù)方案中，限定膜面積與待處理樣品比例、限定加壓栗流量均是為了在 滿足裝置耐受能力的條件下確保較快的處理速度，其中單位ft2是平方英尺。在超濾后增加 對(duì)膜包的清洗步驟能夠顯著延長(zhǎng)膜包使用壽命，節(jié)約成本，所選用的清洗劑中Henkel P3- 11是商品名稱，具體限定由Henkel公司生產(chǎn)的、型號(hào)為P3-11的清洗劑，Tergazyme同樣也是 商品名，具體限定由ALC0N0X公司生產(chǎn)的型號(hào)為Tergazyme的酶活性清潔劑。限定截留膜包 的兩種截留孔徑是發(fā)現(xiàn)該條件下超濾對(duì)多糖性質(zhì)無任何影響同時(shí)又能夠最大程度的取出 熱源。在對(duì)目的多糖執(zhí)行超濾后進(jìn)一步利用緩沖液超濾3~5min并予以收集是為了盡可能 完全的利用，避免多糖損失。
[0024] 本發(fā)明中所述的膜包可以根據(jù)不同樣品分子量大小、溶劑性質(zhì)、有效成分性質(zhì)，判 斷和選擇膜包的材質(zhì)、孔徑。根據(jù)處理樣品的多少可以選擇不同大小面積的膜，對(duì)于每10L 的處理流體，至少要選用lft2的膜面積，要保證足夠的過濾效率，對(duì)于每平方英尺的膜面 積，栗的能力應(yīng)至少達(dá)到1.2L/min。
[0025] 本發(fā)明方法可以在不改變制劑原有性質(zhì)的條件下，有效地去除多糖樣品中的熱 源，可以用于大規(guī)模生物醫(yī)藥制劑的生產(chǎn)過程中。另一方面，本發(fā)明方法首先運(yùn)用層析法進(jìn) 行預(yù)處理，在純化了目的多糖的同時(shí)去除了部分熱源。此外，本發(fā)明中運(yùn)用膜包在去除熱源 的同時(shí)更重要的可以將樣品進(jìn)行濃縮，操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、便于大規(guī)模應(yīng)用。
[0026]綜合來看，本發(fā)明處理量大、處理時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、生產(chǎn)成本低、可將熱源含量降 低至畜禽臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)，并且在去除熱源的同時(shí)不影響制品本身的性質(zhì)，適合規(guī) ?；a(chǎn)應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 以下將對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在 以下實(shí)施例中對(duì)屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0028] 以下實(shí)施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情 況下可允許數(shù)量有一定的變動(dòng)。因此，用"大約"、"左右"等語言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn)確 數(shù)值本身。在一些實(shí)施例中，"大約"表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十（10%)的范圍 內(nèi)變化，比如，"大約100"表示的可以是90至ijllO之間的任何數(shù)值。此外，在"大約第一數(shù)值到 第二數(shù)值"的表述中，大約同時(shí)修正第一和第二數(shù)值兩個(gè)數(shù)值。在某些情況下，近似性語言 可能與測(cè)量?jī)x器的精度有關(guān)。
[0029]除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人 員普遍理解的相同含義。
[0030] 實(shí)施例1.1(透明質(zhì)酸粗品的純化）
[0031] 介質(zhì)混勻，裝柱；用大約4個(gè)柱體積的平衡液(50mM NaH2P〇4,300mM NaCl，PH 8.0) 平衡介質(zhì)，直到流出液A280值接近零;取收集的上清液上樣，流速約l-2mL/min;用平衡液清 洗介質(zhì)，直到流出液A280值趨于平衡；用約2個(gè)柱體積的洗液(50mM NaH2P〇4,300mM NaCl，PH 8.0)清洗Ni2+柱，直到流出液A280值趨于平衡;洗脫液(50mM NaH2P〇4，10mM Tris-Cl，250mM 咪唑，8M尿素 ，PH 8.0)洗脫多糖，收集洗脫液，即為目的多糖。
[0032]實(shí)施例1.2(膜包濃縮）
[0033]采用截留分子量為300KD和5KD的膜包進(jìn)行切向流過濾濃縮。首先用去離子水沖洗 回路，控制進(jìn)液口壓力不超過〇 · IMPa，出液口壓力不超過0 · 05MPa。再用緩沖液在系統(tǒng)中循 環(huán)3~5min，以減少樣品的損失。之后對(duì)收集的目的多糖進(jìn)行超濾濃縮，直至所需濃縮倍數(shù)。 [0034]實(shí)施例1.3(濾膜過濾）
[0035]濃縮后的樣品用0.22um的微孔濾膜過濾，收集濾液，即為目的多糖。
[0036] 實(shí)施例1.4(以上方法去除熱源后，對(duì)產(chǎn)物中熱源含量的檢測(cè)）
[0037] 應(yīng)用鱟試劑凝膠半定量法測(cè)定樣品中熱源含量。
[0038] (1)對(duì)鱟試劑靈敏度復(fù)核:使用廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司生產(chǎn)的鱟試劑盒(靈 敏度A = 0.5EU/ml)和熱源標(biāo)準(zhǔn)品（10EU/ml)，按廠家說明書進(jìn)行操作。經(jīng)測(cè)定，該批鱟試劑 靈敏度的測(cè)定值在〇. 5λ~2λ(包含〇. 5λ及2λ)，可用于細(xì)菌熱源檢查
[0039] (2)對(duì)重組多糖的稀釋和凝膠半定量法測(cè)定熱源含量:按《中華人民共和國(guó)藥典》 2010版中《細(xì)菌熱源檢查法》的"凝膠半定量實(shí)驗(yàn)"進(jìn)行。用細(xì)菌熱源檢查用水稀釋供試品， 每一支裝有〇. lml鱟試劑的安碚瓶中分別加入0. lml系列稀釋的供試品作為試品管，每個(gè)稀 釋度做2個(gè)平行；另取2支加入0 . lml 2λ熱源工作標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對(duì)照；2支加入去熱源水 0.1ml作為陰性對(duì)照。將試管輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37°C 土 1°C的溫箱中，保溫60 ±2min(保溫過程和拿取試管要小心，避免因受到震動(dòng)造成陰性結(jié)果）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1~3 所示。
[0040] 表1 (第一部分)樣品經(jīng)純化、300KD和5KD膜包濃縮后，4倍稀釋后用凝膠半定量法 測(cè)定結(jié)果
[0041]
[0042] 表1 (第二部分)樣品經(jīng)純化、300KD和5KD膜包濃縮后，4倍稀釋后用凝膠半定量法 測(cè)定結(jié)果
[0043]
[0044] 表1中：樣品熱源濃度=λ X反應(yīng)終點(diǎn)濃度=〇. 5EU/ml X 64 = 32EU/ml
[0045] 供試品熱源終濃度= 32EU/ml X 4倍=128EU/ml
[0046] 表2 (第一部分）樣品純化、300KD和5KD膜包濃縮后，用0.22um濾膜過濾后，4倍稀 釋，凝膠半定量法測(cè)定結(jié)果
[0047]
L0048」表2(第二部分）樣品純化、300KD和5KD膜包濃縮后，用0.22um濾膜過濾后，4倍稀 釋，凝膠半定量法測(cè)定結(jié)果
[0049]
[0050] 表2中：樣品熱源濃度=λΧ反應(yīng)終點(diǎn)濃度=〇. 5EU/ml X 4 = 2EU/ml
[0051 ] 供試品熱源終濃度=2EU/ml X 4倍=8EU/ml
[0052] 表3(第一部分)樣品純化、5KD膜包濃縮后，4倍稀釋后用凝膠半定量法測(cè)定結(jié)果
[0053]
'[0054] 表3(k二部分)樣品純彳i、5KD膜4濃縮后，4倍稀釋貪用凝膠半定量法測(cè)i結(jié)果' rnnwi

[0056] 表3 中：G= (0.03125 Χ0·0625)1/2 = 0·4419 = 1:22.6
[0057] 樣品熱源濃度=λΧ反應(yīng)終點(diǎn)濃度=〇. 5EU/ml X 22.6 = 11.313EU/ml
[0058] 供試品熱源終濃度=11.313EU/ml X4倍= 45EU/ml
[0059] 如以上表1~3所示結(jié)果，樣品純化后，同時(shí)運(yùn)用300KD和5KD膜包濃縮，用0.22um濾 膜過濾后，熱源含量可降低至畜禽臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)。
[0060] 實(shí)施例2
[0061] -種去除透明質(zhì)酸中熱源的方法，包括以下步驟：
[0062] 1)對(duì)待處理樣品進(jìn)行層析純化，收集目的多糖；
[0063] 2)取步驟1)得到的目的多糖利用超濾膜包進(jìn)行超濾，收集濾過液，其中膜包進(jìn)口 壓力為35psi，回流口壓力為12psi;
[0064] 3)取步驟2)產(chǎn)物用0.22μπι孔徑的濾膜過濾，收集濾過液。
[0065] 在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：
[0066]步驟2)所述膜包中的膜面積與待處理樣品總量的比例為0.1ft2/L。
[0067] 步驟2)用于超濾的加壓栗對(duì)每平方英尺膜面積其流量為1.2L/min。
[0068] 步驟2)收集濾過液后，利用NaOH溶液或H3P〇4溶液或NaCLO溶液或Tergazyme清洗劑 或Henkel P3-11清洗膜包，其中所述NaOH溶液的濃度為0.1 mM。
[0069] 步驟2)所述膜包的截留分子量為100D。
[0070] 步驟2)所述膜包的截留分子量為3KD。
[0071] 步驟2)對(duì)目的多糖超濾后，利用緩沖液繼續(xù)執(zhí)行超濾3min，收集濾過的緩沖液與 超濾后的目的多糖混合，而后執(zhí)行步驟3)。
[0072] 步驟2)所述的超濾為切向流過濾。
[0073] 步驟1)所述的層析是親和層析或離子交換層析或疏水層析或凝膠過濾層析。
[0074] 實(shí)施例3
[0075] -種去除透明質(zhì)酸中熱源的方法，包括以下步驟：
[0076] 1)對(duì)待處理樣品進(jìn)行層析純化，收集目的多糖；
[0077] 2)取步驟1)得到的目的多糖利用超濾膜包進(jìn)行超濾，收集濾過液，其中膜包進(jìn)口 壓力為30psi，回流口壓力為lOpsi;
[0078] 3)取步驟2)產(chǎn)物用0.25μπι孔徑的濾膜過濾，收集濾過液。
[0079] 在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：
[0080] 步驟2)所述膜包中的膜面積與待處理樣品總量的比例為0.7ft2/L。
[0081] 步驟2)用于超濾的加壓栗對(duì)每平方英尺膜面積其流量為2.5L/min。
[0082] 步驟2)收集濾過液后，利用NaOH溶液或H3P〇4溶液或NaCLO溶液或Tergazyme清洗劑 或Henkel P3-11清洗膜包，其中所述NaOH溶液的濃度為0.5mM。
[0083] 步驟2)所述膜包的截留分子量為500KD。
[0084]步驟2)所述膜包的截留分子量為10KD。
[0085]步驟2)對(duì)目的多糖超濾后，利用緩沖液繼續(xù)執(zhí)行超濾5min，收集濾過的緩沖液與 超濾后的目的多糖混合，而后執(zhí)行步驟3)。
[0086] 實(shí)施例4
[0087] -種去除透明質(zhì)酸中熱源的方法，包括以下步驟：
[0088] 1)對(duì)待處理樣品進(jìn)行層析純化，收集目的多糖；
[0089] 2)取步驟1)得到的目的多糖利用超濾膜包進(jìn)行超濾，收集濾過液，其中膜包進(jìn)口 壓力為40psi，回流口壓力為15psi ;
[0090] 3)取步驟2)產(chǎn)物用0.22μπι孔徑的濾膜過濾，收集濾過液。
[0091] 在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：
[0092]步驟2)所述膜包中的膜面積與待處理樣品總量的比例為0.4ft2/L。
[0093] 步驟2)用于超濾的加壓栗對(duì)每平方英尺膜面積其流量為1.7L/min。
[0094] 步驟2)收集濾過液后，利用NaOH溶液或H3P〇4溶液或NaCLO溶液或Tergazyme清洗劑 或拖111?51?3-11清洗膜包。
[0095] 步驟2)所述的超濾為切向流過濾。
[0096] 實(shí)施例5
[0097] -種去除透明質(zhì)酸中熱源的方法，包括以下步驟：
[0098] 1)對(duì)待處理樣品進(jìn)行層析純化，收集目的多糖；
[0099] 2)取步驟1)得到的目的多糖利用超濾膜包進(jìn)行超濾，收集濾過液，其中膜包進(jìn)口 壓力為32psi，回流口壓力為14psi;
[0100] 3)取步驟2)產(chǎn)物用0.45μΓπι孔徑的濾膜過濾，收集濾過液。
[0101] 以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例， 并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請(qǐng)范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng) 包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種去除透明質(zhì)酸中熱源的方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 對(duì)待處理樣品進(jìn)行層析純化，收集目的多糖； 2) 取步驟1)得到的目的多糖利用超濾膜包進(jìn)行超濾，收集濾過液，其中膜包進(jìn)口壓力 為30~40psi，回流口壓力為10~15psi ; 3) 取步驟2)產(chǎn)物用0.22~0.45μπι孔徑的濾膜過濾，收集濾過液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)所述膜包中的膜面積與待處理樣品 總量的比例不低于〇. lft2/L。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)用于超濾的加壓栗對(duì)每平方英尺膜 面積其流量不低于1.2L/min。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)收集濾過液后，利用NaOH溶液或H3P〇4 溶液或NaCLO溶液清洗膜包。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述NaOH溶液的濃度為0.1~0.5mM。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)所述膜包的截留分子量為100~ 1000KD〇7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)所述膜包的截留分子量為1~100KD。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)對(duì)目的多糖超濾后，利用緩沖液繼續(xù) 執(zhí)行超濾3~5min，收集濾過的緩沖液與超濾后的目的多糖混合，而后執(zhí)行步驟3)。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)所述的超濾為切向流過濾。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)所述的層析是親和層析或離子交換 層析或疏水層析或凝膠過濾層析。
【文檔編號(hào)】C08B37/08GK105837705SQ201610139266
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年3月4日
【發(fā)明人】馮翠軍, 楊君奎
【申請(qǐng)人】馮翠軍