2%、酵母抽提物溶液0.6%、乙醇 胺溶液0.2%; 所述氨基酸溶液中的溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，溶質(zhì)由以下重量的成分組成:賴氨酸〇.5g、色 氨酸lg、苯異亮氨酸lg、纈氨酸lg、亮氨酸lg、甘氨酸〇.5g、異亮氨酸lg、蘇氨酸0.5g、絲氨酸 lg、精氨酸lg、天冬氨酸〇.5g和谷氨酰胺lg; 所述血清替代因子的溶質(zhì)由表皮生長(zhǎng)因子、磷蛋白和脂蛋白以配比為0.6:0.4:0.8混 合所得的混合物； 所述抗氧化劑溶液的溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，溶質(zhì)為枸櫞酸，濃度為〇. 8mg/L; 所述酵母抽提物溶液的濃度為l〇mg/L; 所述乙醇胺溶液的濃度為〇. 5mL/L。
[0022] 制備方法參考實(shí)施例1。
[0023] 實(shí)施例4 一種培養(yǎng)Vero細(xì)胞用的無(wú)血清培養(yǎng)基由以下按體積百分?jǐn)?shù)計(jì)的成分組成:基礎(chǔ)培養(yǎng)液 88%、氨基酸溶液5%、血清替代因子溶液6%、抗氧化劑溶液0.3%、酵母抽提物溶液0.6%、乙醇 胺溶液0.1%; 所述氨基酸溶液中的溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，溶質(zhì)由以下重量的成分組成:賴氨酸〇.5g、色 氨酸1.5g、苯異亮氨酸0.5g、繳氨酸lg、亮氨酸1.5g、甘氨酸lg、異亮氨酸1.5g、蘇氨酸0.5g、 絲氨酸lg、精氨酸〇.5g、天冬氨酸0.5g和谷氨酰胺lg; 所述血清替代因子的溶質(zhì)由成纖維生長(zhǎng)因子、磷蛋白和聚賴氨酸以配比為0.4:0.2: 0.6混合所得的混合物； 所述抗氧化劑溶液的溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，溶質(zhì)為枸櫞酸，濃度為lmg/L; 所述酵母抽提物溶液的濃度為l〇mg/L; 所述乙醇胺溶液的濃度為lmL/L。
[0024]制備方法參考實(shí)施例1。
[0025]試驗(yàn)例1不同培養(yǎng)基對(duì)Vero細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 1、實(shí)驗(yàn)方法:在工作體積為250 ml的轉(zhuǎn)瓶中，分別用實(shí)施例1-4制得的無(wú)血清培養(yǎng)基 培養(yǎng)Vero細(xì)胞，并以市售Invitrogen公司的無(wú)血清培養(yǎng)基VP-SFM(貨號(hào)11681020)作為對(duì) 照，、以相同的密度接種，并加入經(jīng)洗滌的Cytode X3微載體，培養(yǎng)條件:37°C，5% C02，轉(zhuǎn) 速40 r/min。觀察不同培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。采用結(jié)晶紫方法計(jì)數(shù)。
[0026] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果:見(jiàn)表1和表2。
[0027]在轉(zhuǎn)瓶中，采用實(shí)施例1-4無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的Vero細(xì)胞與市售VP-SFM培養(yǎng)的 Vero細(xì)胞生長(zhǎng)情況大致相同，細(xì)胞先經(jīng)過(guò)一個(gè)短暫的延遲期(0-12h)，再進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。 由表1可知，用實(shí)施例1-4無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的Vero細(xì)胞，在培養(yǎng)72h后細(xì)胞密度達(dá)到最高， 96h后細(xì)胞開(kāi)始凋亡，實(shí)施例1-4培養(yǎng)基培養(yǎng)的Vero細(xì)胞最高密度平均為14.95 X 105個(gè)/ml， 要高于市售VP-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)的Vero細(xì)胞最高密度12.8 X 105個(gè)/ml。由表2可知，實(shí)施例ΙΑ 無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的 Vero 細(xì)胞在 24-72h 的平均比生長(zhǎng)速率分別為 ： 0 . 64CT1、 0 . 59CT1、 0.58d-1和0.57 d-1，均大于市售VP-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)的Vero細(xì)胞在24-72h的平均比生長(zhǎng)速率 0.47CT 1。以上結(jié)果表明，實(shí)施例1-4培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞的活性要比市售的VP-SFM培養(yǎng)基效 果要好，其中以實(shí)施例1制得的培養(yǎng)基效果較佳。
[0028]表1轉(zhuǎn)瓶中不同培養(yǎng)基對(duì)Vero細(xì)胞生長(zhǎng)密度的影響 表2轉(zhuǎn)瓶中不同培養(yǎng)基對(duì)Vero細(xì)胞比生長(zhǎng)速率的影響 試驗(yàn)例2不同培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞生產(chǎn)狂犬病病毒的比較 1、實(shí)驗(yàn)方法:在96孔板上使用本發(fā)明實(shí)施例1-4制得的培養(yǎng)基和市售VP-SFM培養(yǎng)基培 養(yǎng)Vero細(xì)胞，每孔接種60yL狂犬病病毒，密封后將培養(yǎng)板置于37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 每隔24h測(cè)定細(xì)胞上清液中的病毒滴度。
[0029] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果:見(jiàn)表3。
[0030]由表3可知，狂犬病病毒接種在不同的培養(yǎng)基中，在接種72-120h，均以實(shí)施例1培 養(yǎng)基上清的病毒滴度最高，在72-120h平均病毒滴度為9.1 l〇g2，而實(shí)施例2-4培養(yǎng)基上清在 72-120h平均病毒滴度分別為8.9 log2、8.71噸2和8.61og2，本發(fā)明實(shí)施例1-4培養(yǎng)基上清在 72-120h平均病毒滴度均高于市售VP-SFM培養(yǎng)基上清的平均病毒滴度7.68.61og 2，以上結(jié) 果表明，實(shí)施例1-4培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞生產(chǎn)狂犬病病毒要比市售的VP-SFM培養(yǎng)基效果要 好，其中以實(shí)施例1制得的培養(yǎng)基效果較佳。
[0031 ]表3狂犬病病毒接種在Vero細(xì)胞后不同培養(yǎng)基培養(yǎng)液上清的病毒滴度(log2) 由于已經(jīng)通過(guò)以上較佳實(shí)施例描述了本發(fā)明，在本發(fā)明的精神和/或范圍內(nèi)，任何針對(duì) 本發(fā)明的替換/或組合來(lái)實(shí)施本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是顯而易見(jiàn)的，且包含 在本發(fā)明之中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種培養(yǎng)Vero細(xì)胞用的無(wú)血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述培養(yǎng)基由以下按體積百分 數(shù)計(jì)的成分組成:基礎(chǔ)培養(yǎng)液85-95%、氨基酸溶液2-5%、血清替代因子溶液2-7%、抗氧化劑 溶液0.1-0.5%、酵母抽提物溶液0.8-2%、乙醇胺溶液0.1-0.5%。2. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)Vero細(xì)胞用的無(wú)血清培養(yǎng)基，其特征在于： 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液選自MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、DMEM-F12培養(yǎng)基（1:1)、HB培養(yǎng)基、BEM培 養(yǎng)基中的一種； 所述氨基酸溶液中的溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，溶質(zhì)由以下重量的成分組成:賴氨酸〇.5-lg、 色氨酸〇. 5-1.5g、苯異亮氨酸0.5-lg、繳氨酸0.5-lg、亮氨酸0.5-1.5g、甘氨酸Ο-lg、異亮氨 酸0.5-1.5g、蘇氨酸Ο-lg、絲氨酸0.5-lg、精氨酸0.5-lg、天冬氨酸Ο-lg和谷氨酰胺0.5-lg; 所述血清替代因子溶液中溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，溶質(zhì)為生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白和貼壁因子 中的一種或幾種； 所述抗氧化劑溶液中溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，溶質(zhì)為抗壞血酸、谷胱甘肽、維生素E、類胡蘿 卜素、尿酸、枸櫞酸、EDTA、泛醌和多酚類抗氧化劑中的一種； 所述酵母抽提物溶液溶劑為PBS，溶質(zhì)為酵母提取物； 所述乙醇胺溶液溶劑為PBS，溶質(zhì)為乙醇胺。3. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)Vero細(xì)胞用的無(wú)血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述培養(yǎng)基由以 下按體積百分?jǐn)?shù)計(jì)的成分組成:基礎(chǔ)培養(yǎng)液90%、氨基酸溶液4%、血清替代因子溶液5%、抗氧 化劑溶液〇. 1%、酵母抽提物溶液〇. 8%、乙醇胺溶液0.1%; 所述氨基酸溶液中的溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，溶質(zhì)由以下重量的成分組成:賴氨酸〇.5g、色 氨酸lg、苯異亮氨酸〇.5g、繳氨酸lg、亮氨酸lg、甘氨酸0.5g、異亮氨酸lg、蘇氨酸0.5g、絲氨 酸0.5g、精氨酸1g、天冬氨酸0.5g和谷氨酰胺0.5g; 所述血清替代因子溶液中溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，溶質(zhì)為生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白和貼壁因子 的混合物； 所述抗氧化劑溶液的濃度為〇. 5-2mg/L; 所述酵母抽提物溶液的濃度為4-10mg/L; 所述乙醇胺溶液的濃度為〇. 5-2mL/L。4. 如權(quán)利要求1-3任一所述的培養(yǎng)Vero細(xì)胞用的無(wú)血清培養(yǎng)基，其特征在于，所 述血清替代因子的溶質(zhì)由生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白和貼壁因子以配比為（0.2-1) :(0-1): (0.4-1)混合所得的混合物。5. 如權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)Vero細(xì)胞用的無(wú)血清培養(yǎng)基，其特征在于， 所述生長(zhǎng)因子為胰島素、白介素-2、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維生長(zhǎng)因子、皮質(zhì)醇和甲狀腺 激素中的一種或幾種； 所述結(jié)合蛋白為轉(zhuǎn)鐵蛋白、磷蛋白、脂蛋白、糖蛋白、金屬蛋白和色蛋白中的一種或幾 種； 所述貼壁因子為魚(yú)精蛋白、聚賴氨酸、糖蛋白、球蛋白和脂蛋白中的一種或幾種。6. 如權(quán)利要求1-5任一所述的培養(yǎng)Vero細(xì)胞用的無(wú)血清培養(yǎng)基的制備方法，其特征在 于， 所述制備方法步驟為:分別取配方量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液、氨基酸溶液、血清替代因子溶液、 抗氧化劑溶液、酵母抽提物溶液和乙醇胺溶液，混合，即得。7. 如權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)Vero細(xì)胞用的無(wú)血清培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于， 所述氨基酸溶液由如下方法制成:取配方量的賴氨酸、色氨酸、苯異亮氨酸、纈氨酸、亮 氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺，然后溶在配方量的 基礎(chǔ)培養(yǎng)液，即得。8. 如權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)Vero細(xì)胞用的無(wú)血清培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于， 所述血清替代因子溶液由如下方法制成：取配方量的由生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白和貼壁因 子，溶解于配方量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，即得； 所述抗氧化劑溶液由如下方法制成:取抗氧化劑，溶解于基礎(chǔ)培養(yǎng)液，配成濃度為〇. 5-2mg/L的溶液，即得。9. 如權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)Vero細(xì)胞用的無(wú)血清培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，所述 酵母抽提物溶液由如下方法制成:取酵母抽提物，溶解于PBS，配成濃度為4-10mg/L的溶液， 即得； 所述乙醇胺溶液由如下方法制成：取乙醇胺，溶解于PBS，配成濃度為0.5-2mL/L的溶 液，即得。10. 如權(quán)利要求1-9任一所述的培養(yǎng)Vero細(xì)胞用的無(wú)血清培養(yǎng)基在培養(yǎng)Vero細(xì)胞中的 用途。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)Vero細(xì)胞用的無(wú)血清培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由以下按體積百分?jǐn)?shù)計(jì)的成分組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)液85-95%、氨基酸溶液2-5%、血清替代因子溶液2-7%、抗氧化劑溶液0.1-0.5%、酵母抽提物溶液0.8-2%、乙醇胺溶液0.1-0.5%。本發(fā)明還提供該培養(yǎng)基的制備方法：分別取配方量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液、氨基酸溶液、血清替代因子溶液、抗氧化劑溶液、酵母抽提物溶液和乙醇胺溶液，混合，即得。本發(fā)明培養(yǎng)Vero細(xì)胞用的無(wú)血清培養(yǎng)基，能夠促進(jìn)Vero細(xì)胞的快速貼壁，培養(yǎng)的Vero細(xì)胞能夠保持較好的細(xì)胞形態(tài)，具有更好的細(xì)胞增殖速率，且本發(fā)明無(wú)血清培養(yǎng)基組分簡(jiǎn)單，降低了成本，制備容易。
【IPC分類】C12N5/071
【公開(kāi)號(hào)】CN105441378
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510965938
【發(fā)明人】陳瑞愛(ài), 徐家華, 唐兆新, 張文炎, 高艷
【申請(qǐng)人】肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司
【公開(kāi)日】2016年3月30日
【申請(qǐng)日】2015年12月22日