一種重組谷氨酸棒桿菌與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及重組微生物，具體地說，涉及一種可將發(fā)酵糖直接轉(zhuǎn)化為乙二醇的重組谷氨酸棒桿菌與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]乙二醇是一種重要的化工原料，可作為溶劑、防凍劑以及合成聚酯的原料等，其最主要的用途是作為合成的聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)的單體。PET是合成樹脂、纖維、塑料瓶的重要原料，每年的市場需求量超過2000萬噸。
[0003]目前，乙二醇的生產(chǎn)方法主要是通過以石油資源為基礎(chǔ)的化學(xué)法生產(chǎn)，特別是以乙烯為原料合成環(huán)氧乙烷，再水合制成乙二醇。由于石油資源的不斷枯竭，開發(fā)可利用可再生原料特別是價(jià)格低廉的生物質(zhì)原料如木質(zhì)纖維素為原料一步法生產(chǎn)乙二醇的生物法技術(shù)路線具有重要的意義。
[0004]目前文獻(xiàn)報(bào)到的生物基乙二醇的技術(shù)路線主要是通過發(fā)酵法和化學(xué)法相結(jié)合的方式實(shí)現(xiàn)的。首先以可發(fā)酵糖為底物利用微生物如釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇。進(jìn)一步將生物乙醇通過化學(xué)法脫水獲得乙烯。乙烯再通過化學(xué)法生產(chǎn)乙二醇。這一技術(shù)路線步驟冗長，副產(chǎn)物多，經(jīng)濟(jì)效益差。
[0005]自然界不存在天然的微生物可以直接發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)乙二醇。目前，僅有的文獻(xiàn)報(bào)道通過改造大腸桿菌實(shí)現(xiàn)利用木糖生產(chǎn)乙二醇的方法(4口口11;[01'013；[0113;[(^60111101(2013)97: 3409-3417)。其代謝途徑包括:木糖在木糖脫氫酶的作用下生成木糖酸，木糖在木糖酸脫水酶的作用下生成2-酮-3-脫氧-木糖酸。后者在2-酮-3-脫氧-木糖酸醛縮酶的催化下裂解生成乙醇醛和丙酮酸。乙醇醛可以在醇脫氫酶的作用下生產(chǎn)乙二醇。然而這一代謝途徑，乙二醇對(duì)木糖的最高理論轉(zhuǎn)化率僅為0.41g/g，極大限制了其經(jīng)濟(jì)可行性。同時(shí)，利用這一代謝途徑無法將葡萄糖等重要可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)變?yōu)橐叶肌?br>
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種可將發(fā)酵糖直接轉(zhuǎn)化為乙二醇的重組谷氨酸棒桿菌與應(yīng)用。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]本發(fā)明首先提供一種重組谷氨酸棒桿菌，其是以谷氨酸棒桿菌作為出發(fā)菌，引入以下外源基因構(gòu)建得到的重組菌:
[0009]1)催化絲氨酸轉(zhuǎn)化為羥基丙酮酸的基因；
[0010]2)催化羥基丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醇醛的基因；
[0011]3)催化乙醇醛轉(zhuǎn)化為乙二醇的基因。
[0012]上述基因的引入，能夠使得重組谷氨酸棒桿菌通過表達(dá)外源基因具備相應(yīng)的催化性能，從而獨(dú)立的完成圖1所示的乙二醇代謝途徑。
[0013]進(jìn)一步優(yōu)選，所述重組谷氨酸棒桿菌還上調(diào)了谷氨酸棒桿菌絲氨酸合成的基因。使得重組谷氨酸棒桿菌通過過表達(dá)所述基因，高效地合成絲氨酸，提高絲氨酸的產(chǎn)量，從而為絲氨酸-乙二醇的代謝途徑提供更多的原料，提高乙二醇的產(chǎn)量。
[0014]進(jìn)一步優(yōu)選，所述重組谷氨酸棒桿菌還敲除了使谷氨酸棒桿菌絲氨酸降解的基因。目的在于敲除能夠使絲氨酸降解的基因，保證微生物內(nèi)絲氨酸的含量，從而為絲氨酸-乙二醇的代謝途徑提供更多的原料，提高乙二醇的產(chǎn)量。
[0015]作為優(yōu)選，所述催化絲氨酸轉(zhuǎn)化為羥基丙酮酸的基因?yàn)榘被崦摎涿富蚧蛘甙被徂D(zhuǎn)氨酶基因。更為優(yōu)選，所述催化絲氨酸轉(zhuǎn)化為羥基丙酮酸的基因?yàn)榘被徂D(zhuǎn)氨酶基因。
[0016]例如，所述氨基酸脫氫酶基因包括來自Streptomyces cinnamonensis的繳氨酸脫氫酶基因vdh(序列如SEQ ID N0.1O所不)、來自Thermoactinomycesintermedius的苯丙氨酸脫氫酶基因pdh(序列如SEQ ID N0.11所示)，來自Geobacillusstearothermophilus的亮氨酸脫氫酶基因ldh(序列如SEQ ID N0.12所示)。
[00Π]例如，所述氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因包括來自Arabidopsis thaliana的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因agt(序列如SEQ ID N0.7所示)、來自Thermotogamaritima的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因agt(序列如SEQ ID Νο.8所示)、來自Rattusnorvegicus的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因agt(序列如SEQ IDN0.9所示)。
[0018]作為優(yōu)選，所述催化羥基丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醇醛的基因?yàn)?-酮酸脫羧酶基因。
例如，所述2-酮酸脫羧酶基因包括來自Saccharomyces cerevisiae的丙酮酸脫羧酶基因pdc(序列如SEQ ID N0.2所示)、來自Triticum aestivum的丙酮酸脫羧酶基因pdc(序列如SEQ ID N0.3所示)、來自LactococcusIactis的2-酮異戊二酸脫羧酶基因kivD(序列如SEQ ID Νο.4所示)、來自Pseudomonasputida的苯甲酰脫羧酶基因mdlC(序列如SEQ IDN0.5所不)、來自My cobacterium tuberculosis的2_酮戊二酸脫竣酶基因sucA(序列如SEQID N0.6所示)。
[0020]作為優(yōu)選，所述催化乙醇醛轉(zhuǎn)化為乙二醇的基因?yàn)榇济摎涿富颉?br>[0021]更為優(yōu)選，所述醇脫氫酶可為來自大腸桿菌MG1655的yqhD基因片段(序列如SEQID N0.1所示)。
[0022]可催化乙醇醛轉(zhuǎn)化為乙二醇的還有來自大腸桿菌的乳醛脫氫酶基因fucO基因，但經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，來自大腸桿菌MG1655的yqhD基因片段較優(yōu)。
[0023]進(jìn)一步地，所述上調(diào)谷氨酸棒桿菌絲氨酸合成的外源基因選自serA(磷酸甘油酸脫氫酶)，serC(磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶)和serB(磷酸絲氨酸磷酸化酶)酶基因中的一種或多種；作為優(yōu)選，所述上調(diào)谷氨酸棒桿菌絲氨酸合成的基因?yàn)橐陨先N。
[0024]進(jìn)一步地，所述使谷氨酸棒桿菌絲氨酸降解的基因選自SdaA(絲氨酸脫氨酶)和pabABC(4_氨基苯甲酸合成酶)中的一種或兩種;作為優(yōu)選，所述使谷氨酸棒桿菌絲氨酸降解的基因?yàn)橐陨蟽煞N。
[0025]敲除時(shí)，優(yōu)先敲除sdaA和pabABC基因。
[0026]本發(fā)明還進(jìn)一步提供了前述重組谷氨酸棒桿菌在生產(chǎn)乙二醇方面的應(yīng)用。
[0027]具體的說，所述應(yīng)用為前述重組谷氨酸棒桿菌利用發(fā)酵糖直接生產(chǎn)乙二醇。
[0028]作為優(yōu)選，所述發(fā)酵糖為葡萄糖。
[0029]作為優(yōu)選，通過優(yōu)化培養(yǎng)基及發(fā)酵條件可以進(jìn)一步提高乙二醇的產(chǎn)量或者轉(zhuǎn)化率。
[0030]例如，培養(yǎng)基為(單位為g/L)
[0031 ]葡萄糖20-100，(NH4)2S04 1 0-40，尿素 1-5，MgS04.7Η20 0.Η，ΚΗ2Ρ04 1-5,Κ2ΗΡ04
1-5，3-嗎啉丙磺酸 0-50，CaCl20-0.5，F(xiàn)eS04.7Η200_0.5，MnS〇4.H20 0-0.5,ZnS04.7H200-0.5，CuS040-0.5，NiCl2.6H2OO-0.5，生物素0.1-1,原兒茶酸0-1，卡那霉素0-0.5。
[0032]更為優(yōu)選，在培養(yǎng)基中額外添加10_40g/L玉米漿。
[0033]作為優(yōu)選，培養(yǎng)溫度為30_32°C，通氣量為l_2vvm，通過調(diào)整轉(zhuǎn)速使得溶氧水平達(dá)到10%以上。能夠進(jìn)一步提高乙二醇的產(chǎn)量或者轉(zhuǎn)化率。
[0034]本發(fā)明的有益效果在于:
[0035]本發(fā)明通過在谷氨酸棒桿菌的基礎(chǔ)上引入外源基因，并上調(diào)了絲氨酸合成基因，敲除了絲氨酸降解基因，得到重組谷氨酸棒桿菌。使其在具有絲氨酸高含量的基礎(chǔ)上，通過表達(dá)外源基因，獨(dú)立的完成絲氨酸-乙二醇的代謝途徑。即，所述重組谷氨酸棒桿菌能夠以發(fā)酵糖為碳源，直接生產(chǎn)乙二醇，而不需要借助其他外源酶，彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，為建立生物法乙二醇的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。經(jīng)本發(fā)明提供的重組谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的乙二醇，實(shí)際轉(zhuǎn)化率達(dá)10 %以上。
【附圖說明】
[0036]圖1為乙二醇代謝途徑。
【具體實(shí)施方式】
[0037]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。
[0038]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0039]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0040]實(shí)施例1在谷氨酸棒桿菌中過表達(dá)醇脫氫酶基因yqhD
[0041]以大腸桿菌MG 1 6 5 5的基因組為模板，以引物y q h D - F(atGAATTCTTGACATTAATTTGAATCTGTGTTATAATGGTTCAAGGAGATATACCatgAACAACTTTAATCTGCACACC)和 y qhD-R (atGAATTCGCGGGCGGCTTCGTATATAC)為引物進(jìn)行 PCR，獲得 yqhD 基因片段(yqhD序列如SEQ ID N0.1所示)并進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化(天根生物PCR產(chǎn)物純化試劑盒)。將大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭質(zhì)粒pEC_K18mob2(Journal of B1technology 104(2003)287-299)用EcoRI進(jìn)行單酶切，利用GibsonAssembly試劑盒(NEB)將yqhD基因片段一步連接到pEC-K18mob2上，獲得的重組質(zhì)粒命名為pEC-yqhD.該質(zhì)粒利用lac為啟動(dòng)子，無需添加外源的誘導(dǎo)劑即可過表達(dá)yqhD基因。
[0042]利用電穿孔儀(伯樂)將pE C