為模板，以引物sdaA-down-F(accctcagccttagcggtacggctttaacacgg)和sdaA-down-R(at ccccgggtaccgagct cggaatgcc cc t gtgg tgat caac)為引物進行PCR，獲得 sdaA下游約100bp的同源片段sdaA-down并進行PCR產(chǎn)物純化。以谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組為模板，以引物serA-F(accctcagccTTGACATTAATTTGAATCTGTGTTATAATGGTTCattcctagtttttcc
serA基因片段(含N段333個氨基酸)并進行PCR產(chǎn)物純化。以谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組為模板，以弓丨物 serC-F(tctggcttaaccaagcgcagaaagttgcc)和 serC-R(catgtctgagttacttccttgcaaaaccgccatcg)為引物進行 PCR，獲得 serC 基因片段并進行 PCR產(chǎn)物純化。以谷氨酸棒桿菌A T C C I 3 O 3 2的基因組為模板，以引物s e r B - F(aaggaagtaactcagacatgagacaattgttgccg)和serB-R(gtaccgctaattaggcattggtcaatggaacgc)為引物進行 PCR，獲得 serB 基因片段并進行 PCR 產(chǎn)物純化。將谷氨酸棒桿菌自殺性質(zhì)粒pK18mobsacB(Journal of B1technology 104(2003)287-299)用EcoRI進行單酶切，利用GibsonAssemb Iy試劑盒(NEB)將sdaA_up、serA、serC、serB和sdaA-down片段一步連接到pK18mobsacB上，獲得的重組質(zhì)粒命名為pK18_serACB。利用電穿孔儀(伯樂)將pK18-pabABC通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到谷氨酸棒桿菌ATCC13032中，電擊條件為電壓2.5KV，電阻600Ω，電容25yF(電擊杯寬度為2mm)。一次重組菌在含25mg/L的卡那霉素LB平板上篩選。該重組菌進一步在液體LB培養(yǎng)基里過夜培養(yǎng)，之后在含有100g/L的蔗糖LB平板上進行二次篩選。利用sdaA-up-F和sdaA-down-R為引物進行菌落PCR篩選正確的重組菌，該菌命名為C.glutamicum Δ pabABC Δ sdaA#serACB。
[0060]實施例6利用葡萄糖直接產(chǎn)乙二醇的重組谷氨酸棒桿菌的構(gòu)建。
[0061]將質(zhì)粒pEC-AtAGT-PpMdlC-yqhD通過電轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)化到谷氨酸棒桿菌C.glutamicumΔpabABCΔsdaA#serACB,C.glutamicum ATCCl3032,C.glutamicum#serACB,中(電轉(zhuǎn)條件如實施例1所示)，獲得重組菌命名為C.glutamicum Δ pabABC Δ sdaASserACB/pEC-AtAGT-PpMdlC-yqhD，C.glutamicum ATCCl3032/pEC-AtAGT-PpMdlC-yqhD，C.glutamicum#serACB/pEC-AtAGT-PpMdIC-yqhD。
[0062]將上述三株菌株以及野生的C.glutamicum ATCC13032菌株在250ml搖瓶中培養(yǎng)24h(含30ml培養(yǎng)基)，溫度為32°C，轉(zhuǎn)速為200rpm。
[0〇63]培養(yǎng)基配方為(每升):40g 葡萄糖，20g(NH4)2S04，5g 尿素，0.25g MgS(k.7H2O, IgKH2P04，lg K2HP04，42g 3-嗎啉丙磺酸，1mg CaCl2,1mg FeSO4.7H20a0mg MnSO4.H2O,Img ZnSCU.7Η2〇，0.2mg CuS04，0.02mg NiCl2.6H2O，0.2mg 生物素，and 30mg 原兒茶酸，25mg卡那霉素。
[0064]發(fā)酵24h后，利用高效液相色譜檢測乙二醇的產(chǎn)量。四株菌株C.glutamicum ΔpabABC Δ sdaASserACB/pEC-AtAGT-PpMdlC-yqhD (本發(fā)明重組菌),C.glutami cumATCC13032(野生菌株)，C.glutamicum ATCC13032/pEC-AtAGT_PpMdlC-yqhD(引入外源基因但未過表達絲氨酸合成基因)，C.glutamicum#serACB/pEC-AtAGT_PpMdlC-yqhD(引入外源基因過表達絲氨酸合成基因但未敲除絲氨酸降解基因)乙二醇產(chǎn)量分別達到4.2g/L，0g/L，0.7g/L，1.4g/L。其中C.glutamicum Δ pabABC Δ sdaA#serACB/pEC_At AGT-PpMdl C-y qhD (本發(fā)明重組菌)乙二醇產(chǎn)量最高，轉(zhuǎn)化率達到10%。
[0065]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權(quán)項】
1.一種重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，其是以谷氨酸棒桿菌作為出發(fā)菌，引入以下外源基因構(gòu)建得到的重組菌: 1)催化絲氨酸轉(zhuǎn)化為羥基丙酮酸的基因； 2)催化羥基丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醇醛的基因； 3)催化乙醇醛轉(zhuǎn)化為乙二醇的基因。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，其還上調(diào)了谷氨酸棒桿菌絲氨酸合成的基因。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，其還敲除了使谷氨酸棒桿菌絲氨酸降解的基因。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述催化絲氨酸轉(zhuǎn)化為羥基丙酮酸的基因為氨基酸脫氫酶基因或者氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因； 作為優(yōu)選，所述氨基酸脫氫酶基因可為來自Streptomyces cinnamonensis的繳氨酸脫氫酶基因vdh(序列如SEQ ID N0.10所不)、來自Thermoactinomycesintermedius的苯丙氨酸脫氫酶基因pdh(序列如SEQ ID N0.11所示)，來自Geobacillusstearothermophilus的亮氨酸脫氫酶基因ldh(序列如SEQ ID N0.12所示)； 所述氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因可為來自Arabidopsis thaliana的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因agt(序列如SEQ ID Νο.7所示)、來自Thermotogamaritima的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因agt(序列如SEQ IDN0.8所示)、來自Rattusnorvegicus的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因agt(序列如SEQ ID N0.9所示)。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述催化羥基丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醇醛的基因為2-酮酸脫羧酶基因； 作為優(yōu)選，所述2-酮酸脫羧酶基因可為來自Saccharomyces cerevisiae的丙酮酸脫羧酶基因pdc(序列如SEQ ID N0.2所示)、來自Triticum aestivum的丙酮酸脫羧酶基因pdc(序列如SEQ ID 1'10.3所示)、來自1^(:1:0(30(^11813(31^8的2-酮異戊二酸脫羧酶基因1^￥0(序列如SEQ ID Νο.4所示)、來自Pseudomonasputida的苯甲酰脫羧酶基因mdlC(序列如SEQ IDN0.5所不)、來自My cobacterium tuberculosis的2_酮戊二酸脫竣酶基因sucA(序列如SEQID N0.6所示)。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述催化乙醇醛轉(zhuǎn)化為乙二醇的基因為醇脫氫酶基因； 作為優(yōu)選，所述醇脫氫酶為來自大腸桿菌MG1655的yqhD基因片段(序列如SEQ ID N0.l所示)。7.根據(jù)權(quán)利要求4?6任一項所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述谷氨酸棒桿菌絲氨酸合成的基因選自serA(磷酸甘油酸脫氫酶)，serC(磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶)和serB(磷酸絲氨酸磷酸化酶)酶基因中的一種或多種;作為優(yōu)選，所述谷氨酸棒桿菌絲氨酸合成的基因為以上三種。8.根據(jù)權(quán)利要求4?6任一項所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述使谷氨酸棒桿菌絲氨酸降解的基因選自sdaA(絲氨酸脫氨酶)和pabABC(4_氨基苯甲酸合成酶)中的一種或兩種;作為優(yōu)選，所述使谷氨酸棒桿菌絲氨酸降解的基因為以上兩種。9.權(quán)利要求1?8任一項所述重組谷氨酸棒桿菌在生產(chǎn)乙二醇方面的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述重組谷氨酸棒桿菌在利用發(fā)酵糖直接發(fā)酵生產(chǎn)乙二醇；所述發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度為30-32°C，通氣量為l-2vvm，溶氧控制在10 %以上。
【專利摘要】本發(fā)明涉及重組微生物，具體公開了一種可將發(fā)酵糖直接轉(zhuǎn)化為乙二醇的重組谷氨酸棒桿菌與應(yīng)用。本發(fā)明通過在谷氨酸棒桿菌的基礎(chǔ)上引入外源基因，并上調(diào)了絲氨酸合成基因，敲除了絲氨酸降解基因，得到重組谷氨酸棒桿菌。使其在具有絲氨酸高含量的基礎(chǔ)上，通過表達外源基因，獨立的完成絲氨酸-乙二醇的代謝途徑。即，所述重組谷氨酸棒桿菌能夠以發(fā)酵糖為碳源，直接生產(chǎn)乙二醇，而不需要借助其他外源酶，彌補了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，為建立生物法乙二醇的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。經(jīng)本發(fā)明提供的重組谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的乙二醇，實際轉(zhuǎn)化率達10％以上。
【IPC分類】C12R1/15, C12P7/18, C12N1/21
【公開號】CN105441372
【申請?zhí)枴緾N201510729258
【發(fā)明人】陳振, 劉德華
【申請人】清華大學(xué), 東莞深圳清華大學(xué)研究院創(chuàng)新中心
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2015年10月30日