一種培養(yǎng)Vero細胞用的無血清培養(yǎng)基及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制品領(lǐng)域，涉及一種培養(yǎng)Vero細胞用的無血清培養(yǎng)基及其制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自1995年WHO呼吁采用細胞為基質(zhì)生產(chǎn)疫苗，細胞培養(yǎng)在疫苗生產(chǎn)過程中發(fā)揮的 作用越來越受人們的重視。而過去，在使用血清培養(yǎng)細胞的過程中，增加了細胞表達產(chǎn)物安 全性的不確定因素，并且采用含血清的培養(yǎng)基進行細胞的培養(yǎng)，可能由于血清的存在導(dǎo)致 過敏反應(yīng)發(fā)生、批次間差異大、易受污染和成本較高等缺點，這一現(xiàn)實問題已經(jīng)成為動物細 胞無血清培養(yǎng)技術(shù)研究和應(yīng)用的發(fā)展動力。隨著無血清培養(yǎng)技術(shù)的不斷進步，無血清培養(yǎng) 已成為包括疫苗在內(nèi)的生物技術(shù)藥物生產(chǎn)的總趨勢。
[0003] Vero細胞是WHO允許用于疫苗生產(chǎn)的細胞株，它對多種病毒敏感，是現(xiàn)階段病毒疫 苗生產(chǎn)的最主要的細胞基質(zhì)。Vero細胞無血清培養(yǎng)技術(shù)提高了病毒疫苗生產(chǎn)工藝的可靠 性、產(chǎn)品質(zhì)量的可控性和安全性。目前，Vero細胞無血清培養(yǎng)已在包括狂犬病疫苗、流行性 乙型腦炎疫苗、流感疫苗、腎綜合征出血熱疫苗、甲型肝炎疫苗、呼腸病毒疫苗等的研發(fā)和 生產(chǎn)中得到應(yīng)用。
[0004] 無血清培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入成分明確的血清替代成分，既能滿 足細胞的培養(yǎng)要求，又能有效避免因使用血清帶來的諸多不利因素。因此，發(fā)展無血清培養(yǎng) 基是細胞走向臨床應(yīng)用的重要條件。目前已有一些市售的無血清培養(yǎng)基，如Sigma公司的 EX-CELL MDCK和GIB⑶公司的VP-SFM，但是現(xiàn)有市售無血清培養(yǎng)基存在細胞貼壁性差、細胞 增殖不夠理想、價格昂貴、成分不明等缺陷。
[0005] 中國專利申請?zhí)枮?00710187466.7的專利，公開了一種用于Vero細胞的培養(yǎng)基及 其培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)基以SFM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加的細胞因子及其他組分50多種，組分非常 復(fù)雜。
[0006] 因此，現(xiàn)有技術(shù)存在細胞貼壁性差，組分過于復(fù)雜，細胞增殖速率不夠理想等問 題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種質(zhì)量可控、安全可靠、成分簡單的培養(yǎng)Vero細胞用的 無血清培養(yǎng)基及其制備方法。
[0008] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下： 一種培養(yǎng)Vero細胞用的無血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述培養(yǎng)基由以下按體積百分數(shù) 計的成分組成:基礎(chǔ)培養(yǎng)液85-95%、氨基酸溶液2-5%、血清替代因子溶液2-7%、抗氧化劑溶 液0.1-0.5%、酵母抽提物溶液0.8-2%、乙醇胺溶液0.1-0.5%; 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液選自MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、DMEM-F12培養(yǎng)基（1:1)、HB培養(yǎng)基、BEM培 養(yǎng)基中的一種； 所述氨基酸溶液中的溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，溶質(zhì)由以下重量的成分組成:賴氨酸0.5-lg、 色氨酸〇. 5-1.5g、苯異亮氨酸0.5-lg、繳氨酸0.5-lg、亮氨酸0.5-1.5g、甘氨酸o-lg、異亮氨 酸0.5-1.5g、蘇氨酸0-1 g、絲氨酸0.5-lg、精氨酸0.5-lg、天冬氨酸0-1 g和谷氨酰胺0.5-lg; 所述血清替代因子溶液中溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，溶質(zhì)為生長因子、結(jié)合蛋白和貼壁因子 中的一種或幾種組合； 所述抗氧化劑溶液中溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，溶質(zhì)為抗壞血酸、谷胱甘肽、維生素 E、類胡蘿 卜素、尿酸、枸櫞酸、EDTA、泛醌和多酚類抗氧化劑中的一種； 所述酵母抽提物溶液溶劑為PBS，溶質(zhì)為酵母提取物； 所述乙醇胺溶液溶劑為PBS，溶質(zhì)為乙醇胺。
[0009] 進一步地，所述抗氧化劑溶液的濃度為0.5-2mg/L; 所述酵母抽提物溶液的濃度為4-10mg/L; 所述乙醇胺溶液的濃度為〇. 5-2mL/L。
[0010] 進一步地，所述血清替代因子的溶質(zhì)由生長因子、結(jié)合蛋白和貼壁因子以配比為 (0 · 2-1): (0-1): (0 · 4-1)混合所得的混合物。
[0011] 進一步地，所述生長因子為胰島素、白介素-2、表皮生長因子、成纖維生長因子、皮 質(zhì)醇和甲狀腺激素中的一種或幾種組合； 所述結(jié)合蛋白為轉(zhuǎn)鐵蛋白、磷蛋白、脂蛋白、糖蛋白、金屬蛋白和色蛋白中的一種或幾 種組合； 所述貼壁因子為魚精蛋白、聚賴氨酸、糖蛋白、球蛋白和脂蛋白中的一種或幾種組合。
[0012] 優(yōu)選地，一種培養(yǎng)Vero細胞用的無血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述培養(yǎng)基由以下按 體積百分數(shù)計的成分組成:基礎(chǔ)培養(yǎng)液90%、氨基酸溶液4%、血清替代因子溶液5%、抗氧化劑 溶液0.1%、酵母抽提物溶液0.8%、乙醇胺溶液0.1%; 所述氨基酸溶液中的溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，溶質(zhì)由以下重量的成分組成:賴氨酸〇.5g、色 氨酸lg、苯異亮氨酸〇.5g、繳氨酸lg、亮氨酸lg、甘氨酸0.5g、異亮氨酸lg、蘇氨酸0.5g、絲氨 酸0.5g、精氨酸1 g、天冬氨酸0.5g和谷氨酰胺0.5g; 所述血清替代因子的溶質(zhì)由皮質(zhì)醇、轉(zhuǎn)鐵蛋白和魚精蛋白以配比為0.5:0.5:0.8混合 所得的混合物； 所述抗氧化劑溶液的溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，溶質(zhì)為谷胱甘肽，濃度為lmg/L; 所述酵母抽提物溶液的溶劑為PBS，溶質(zhì)為酵母抽提物，濃度為6mg/L; 所述乙醇胺溶液的的溶劑為PBS，溶質(zhì)為乙醇胺，濃度為0.5mL/L。
[0013] 相應(yīng)地，本發(fā)明還提供該培養(yǎng)Vero細胞用的無血清培養(yǎng)基的制備方法，其特征在 于，所述制備方法步驟為:分別取配方量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液、氨基酸溶液、血清替代因子溶液、抗 氧化劑溶液、酵母抽提物溶液和乙醇胺溶液，混合，即得； 所述氨基酸溶液由如下方法制成:取配方量的賴氨酸、色氨酸、苯異亮氨酸、纈氨酸、亮 氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺，然后溶在配方量的 基礎(chǔ)培養(yǎng)液，即得； 所述血清替代因子溶液由如下方法制成：取配方量的由生長因子、結(jié)合蛋白和貼壁因 子，溶解于配方量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，即得： 所述抗氧化劑溶液由如下方法制成:取抗氧化劑，溶解于基礎(chǔ)培養(yǎng)液，配成濃度為ο. 5-2mg/L的溶液，即得： 所述酵母抽提物溶液由如下方法制成:取酵母抽提物，溶解于PBS，配成濃度為4-10mg/ L的溶液，即得； 所述乙醇胺溶液由如下方法制成：取乙醇胺，溶解于PBS，配成濃度為0.5-2mlVL的溶 液，即得。
[0014] 此外，本發(fā)明還提供該培養(yǎng)Vero細胞用的無血清培養(yǎng)基在Vero細胞培養(yǎng)中的用 途。
[0015] 與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下技術(shù)優(yōu)勢： 本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)Vero細胞用的無血清培養(yǎng)基，與市售的無血清培養(yǎng)基相比，本 發(fā)明提供的培養(yǎng)基能夠促進Vero細胞的快速貼壁，培養(yǎng)的Vero細胞能夠保持較好的細胞形 態(tài)，具有更好的細胞增殖速率，且本發(fā)明無血清培養(yǎng)基組分簡單，降低了成本。此外，本發(fā)明 提供的制備方法簡單，制得的無血清培養(yǎng)基用于Vero細胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)獲得的細胞表現(xiàn)出 優(yōu)異的細胞性能。
【具體實施方式】
[0016] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，以下實施例中所公開的技術(shù)代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā) 明的實踐中發(fā)揮良好作用的技術(shù)。然而，在所公開的具體實施方案中可以做出許多改變，并 仍然獲得相同或相似的結(jié)果，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。
[0017] 實施例！ 一種培養(yǎng)Vero細胞用的無血清培養(yǎng)基由以下按體積百分數(shù)計的成分組成:基礎(chǔ)培養(yǎng)液 90%、氨基酸溶液4%、血清替代因子溶液5%、抗氧化劑溶液0.1%、酵母抽提物溶液0.8%、乙醇 胺溶液0.1%; 所述氨基酸溶液中的溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，溶質(zhì)由以下重量的成分組成:賴氨酸〇.5g、色 氨酸lg、苯異亮氨酸〇.5g、繳氨酸lg、亮氨酸lg、甘氨酸0.5g、異亮氨酸lg、蘇氨酸0.5g、絲氨 酸0.5g、精氨酸1 g、天冬氨酸0.5g和谷氨酰胺0.5g; 所述血清替代因子的溶質(zhì)由皮質(zhì)醇、轉(zhuǎn)鐵蛋白和魚精蛋白以配比為0.5:0.5:0.8混合 所得的混合物； 所述抗氧化劑溶液的溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，溶質(zhì)為谷胱甘肽，濃度為lmg/L; 所述酵母抽提物溶液的濃度為6mg/L; 所述乙醇胺溶液的濃度為〇. 5mL/L。
[0018]該培養(yǎng)Vero細胞用的無血清培養(yǎng)基的制備方法，其步驟為:分別取配方量的基礎(chǔ) 培養(yǎng)液、氨基酸溶液、血清替代因子溶液、抗氧化劑溶液、酵母抽提物溶液和乙醇胺溶液，混 合，即得； 其中氨基酸溶液制備方法為:取配方量的賴氨酸、色氨酸、苯異亮氨酸、纈氨酸、亮氨 酸、甘氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺，然后溶在配方量的基 礎(chǔ)培養(yǎng)液，即得； 血清替代因子溶液制備方法為:取配方量的由生長因子、結(jié)合蛋白和貼壁因子，溶解于 配方量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，即得： 抗氧化劑溶液制備方法為:取谷胱甘肽，溶解于基礎(chǔ)培養(yǎng)液，配成濃度為lmg/L的溶液， 即得： 酵母抽提物溶液制備方法為:取酵母抽提物，溶解于PBS，配成濃度為6mg/L的溶液，即 得； 乙醇胺溶液制備方法為:取乙醇胺，溶解于PBS，配成濃度為0.5mL/L的溶液，即得。
[0019] 實施例2 一種培養(yǎng)Vero細胞用的無血清培養(yǎng)基由以下按體積百分數(shù)計的成分組成:基礎(chǔ)培養(yǎng)液 92%、氨基酸溶液2%、血清替代因子溶液5%、抗氧化劑溶液0.2%、酵母抽提物溶液0.7%、乙醇 胺溶液0.1%; 所述氨基酸溶液中的溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，溶質(zhì)由以下重量的成分組成:賴氨酸lg、色氨 酸0.5g、苯異亮氨酸lg、繳氨酸0.5g、亮氨酸0.5g、甘氨酸lg、異亮氨酸lg、蘇氨酸0.5g、絲氨 酸1 g、精氨酸〇. 5g、天冬氨酸0.5g和谷氨酰胺0.5g; 所述血清替代因子的溶質(zhì)由胰島素、色蛋白和聚賴氨酸以配比為0.4:0.2:0.6混合所 得的混合物； 所述抗氧化劑溶液的溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，溶質(zhì)為類胡蘿卜素，濃度為〇. 5mg/L; 所述酵母抽提物溶液的濃度為8mg/L; 所述乙醇胺溶液的濃度為〇. 8mL/L。
[0020] 制備方法參考實施例1。
[0021] 實施例3 一種培養(yǎng)Vero細胞用的無血清培養(yǎng)基由以下按體積百分數(shù)計的成分組成:基礎(chǔ)培養(yǎng)液 92%、氨基酸溶液3%、血清替代因子溶液4%、抗氧化劑溶液0.