沉淀。樣本重復(fù) Ξ次。發(fā)明人對等量的血漿和純化RNA進(jìn)行免抽提miRFLP直接測定，操作步驟與測試實例 3所述相同，所得結(jié)果列于表7。W血漿直接測定的結(jié)果為基準(zhǔn)值，即使加入了大量細(xì)菌RNA 作為保護(hù)劑，RNA純化后測定結(jié)果的回收率僅為35%左右。樣本中不同miRNA,miR-122及 miR-451的回收率均接近35%，間接說明RNA純化、miRFLP測定W及免抽提miRFLP直接測 定過程中均沒有發(fā)生miRNA的選擇性丟失。
[0080] 表7 :等量血漿miR-122/451直接測定結(jié)果與經(jīng)RNA純化后測定結(jié)果的比較
[0081]
[0082]表7中各miRNA的測定率W血漿直接測定值為基準(zhǔn)值，100%。
[008引實施例7 :免抽提miRFLP直接測定法的檢測線性范圍評估。
[0084] 發(fā)明人選取了兩個血漿N1和Nil進(jìn)行免抽提miRFLP直接測定，用W對免抽提 miRFLP直接測定法的檢測線性范圍進(jìn)行評估。每μ1N1血漿約含200, 000個miR-122,每 微升Nil血漿約含800個miR-122。用N1與Nil血漿W1:1混合，得到N2 ;再WN2與Nil W1:1混合得到N3 ;W此類推，得到混合樣本肥至N10。將N1 -Nil血漿用Wng/μ1的細(xì) 菌RNA溶液W1:10稀釋，每個樣本重復(fù)四次。取2微升稀釋液與6微升RNA變性液混合， 加熱至75°C3分鐘，冰上冷卻。余下的操作步驟與測試實例3所述相同，唯一的改變?yōu)椋河?2微升Dynabeads?MyOne?StreptavidinC1代替10微升的瓊脂糖鏈霉素試劑。依據(jù)C抑A 的《體外診斷試劑分析性能評估系列指導(dǎo)原則》及美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化組織（Clinical andL油oratoryStandardsInsti1:udeW下稱為(XSI)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，對所得結(jié)果進(jìn) 行線性范圍評估，結(jié)果如圖3所示，顯示本發(fā)明的免抽提miRFLP直接測定法的檢測線性范 圍在844 - 212585拷貝數(shù)/微升血漿的濃度區(qū)間有良好的線性回歸擬合，滿足臨床對miRNA 分析的要求。表8中為回歸方程及精密度檢測，結(jié)果顯示，不精密度^滿足判斷式，說明數(shù) C 據(jù)的精密度好可作線性評價。
[0085] 表8回歸方程及精密度檢測：
[0086]
[0087] 測試實例8:凍融次數(shù)對血漿miR-122/451濃度測定的影響。
[0088] 在不加入凍存保護(hù)劑的條件下，反復(fù)凍融對膜結(jié)構(gòu)造成破壞，破壞的程度隨著凍 融次數(shù)而增加。用反復(fù)凍融的方法處理血漿，分泌泡中的miRNA可能隨著釋放的miRNA會 增加血漿中能被免抽提miRFLP檢測法檢測到的miRNA的數(shù)量。將血漿S11-1均勻分裝成 20微升，凍于-20°C的冰箱，溫度范圍為-14°C至-28°C。4-12小時后在室溫解凍，血漿完全 融化后，混勻，此為一個完整循環(huán)。將分裝的血漿樣本用不同次數(shù)的循環(huán)反復(fù)處理，然后進(jìn) 行測定，具體的miRFLP測定操作步驟與測試實例3中所述相同。結(jié)果顯示，經(jīng)過5次W內(nèi) 的凍融處理對血漿miR-122/451的濃度沒有明顯的影響（圖4和圖5)，但經(jīng)過6次及W上 的凍融處理引起血漿miR-122/451濃度的明顯升高，miR-451的濃度升高達(dá)到12倍，見表 9。有意思的是，5次W內(nèi)的凍融處理對血漿miRNA濃度測定的誤差變動很小，僅為8. 9%和 19. 3%，說明5次W內(nèi)的凍融處理對分泌泡膜結(jié)構(gòu)沒有大的影響。6次W上及10次W下的 凍融處理是血漿miRNA的濃度測定值大幅升高，而誤差變動也僅為12. 1 %W下，說明凍融6 次后可W完全破壞分泌泡膜結(jié)構(gòu)。miRNA測定量在細(xì)胞分泌泡被破壞后達(dá)到最大值，隨著進(jìn) 一步的凍融處理而出現(xiàn)降低，
[0089] 表9 :反復(fù)凍融處理對血漿miRNA濃度測定的影響。
[0090]
[0091] 單位：miRNA拷貝數(shù)/微升血漿
[0092] 測試實例9 :二甲基亞諷對血漿miR-122/451濃度測定的影響。
[0093] 二甲基亞諷對細(xì)胞分泌泡進(jìn)行保護(hù)可W影響血漿miR-122/451濃度的測定。將血 漿Sll-1用不同濃度二甲基亞諷進(jìn)行稀釋，然后分成兩組進(jìn)行加熱處理。一組在20°C解育 5分鐘，另一組在50°C解育5分鐘，加入細(xì)菌RNA及RI，然后進(jìn)行免抽提miRFLP測定，具體 的測定操作步驟與測試實例3中所述相同。10%的二甲基亞諷避免水溶液形成微晶，增加 細(xì)胞膜的通透性，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的凍存保護(hù)；高濃度二甲基亞諷使蛋白質(zhì)變性，并在濃度 達(dá)到93%時使蛋白質(zhì)完全結(jié)晶。免抽提miRFLP測定結(jié)果顯示，不同二甲基亞諷濃度也對免 抽提miRFLP測定結(jié)果造成不同的影響。90%的二甲基亞諷使蛋白質(zhì)變性（其中包括核酸 酶），保護(hù)蛋白質(zhì)松弛后游離的miRNA不受降解，測得的結(jié)果與經(jīng)過5次W內(nèi)凍融處理血漿 的miR-122/451濃度一致。90%的二甲基亞諷在20°C溫度下不影響細(xì)胞分泌泡的膜結(jié)構(gòu)， 加熱后，膜結(jié)構(gòu)被破壞，miRNA游離出來，增加被檢測目標(biāo)的濃度，測定結(jié)果與經(jīng)過6次及W 上的凍融處理引起血漿miR-122/451濃度一致。90%的二甲基亞諷在50°C加熱處理具有與 經(jīng)過6次及W上反復(fù)凍融相等的效果。
[0094]含10%二甲基亞諷的血漿經(jīng)加熱處理后，抑制RT反應(yīng)，但在20°C的低溫條件下對 RT及PCR反應(yīng)沒有抑制作用，并增加細(xì)胞膜的通透性，降低miRFLP測定處理過程中對膜結(jié) 構(gòu)的損傷，因此測定的結(jié)果是游離蛋白質(zhì)包裹的miRNA部份。隨著二甲基亞諷濃度的增加， 更多被蛋白質(zhì)包裹的miRNA游離出來，相繼被核酸酶降解，直到濃度達(dá)到90%，達(dá)到能夠抑 制核酸酶活性的臨界點。同樣的趨勢在miR-122/miR-451均可重復(fù)的表現(xiàn)出來。
[009引表10二甲基亞諷對血漿miR-122/451濃度測定的影響。
[0096]
[0097] 單位：miRNA拷貝數(shù)/微升血漿
[009引測試實例10 :對乙酷氨基酪誘導(dǎo)小鼠肝損傷與循環(huán)miR-122濃度的關(guān)系[0099] 我們利用對乙酷氨基酪（acetaminophen,APA巧誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型，評估循環(huán) miR-122濃度與肝損傷程度的關(guān)系。選用的藥物為市售的泰諾，含APAP，分為Ξ個劑量組， 高劑量組300mg/kg體重（皿）、中劑量組150mg/kg體重（MD)、低劑量組50mg/kg體重（LD)。 小鼠經(jīng)口服APAP的LD50為338mg/kg，腹腔注射LD50為300mg/kg。BALB/C小鼠6-8周齡， 雌雄各半，灌胃前禁食12小時，口服。給藥后2小時、8小時、24小時和48小時進(jìn)行血樣采 集，每只動物采集到抗凝血樣約100-200微升。檢測循環(huán)miR-122/451的表達(dá)水平，并取循 環(huán)miR-122/451高表達(dá)的小鼠肝臟做病理切片，進(jìn)行病理組織學(xué)分析。循環(huán)miRNA的測定 和病理組織學(xué)分析均W盲樣實驗的方式進(jìn)行。給藥2小時后，循環(huán)miR-122濃度在不同劑 量組均有不同程度的升高，8小時時持續(xù)升高，在24小時左右達(dá)到最大濃度，并在48小時時 有所降低。選取各時間段的肝組織進(jìn)行病理組織學(xué)分析，可見肝損傷與循環(huán)miR-122濃度 具有相關(guān)性，表11。圖6病理圖片上標(biāo)注為小鼠耳牌號和所使用物鏡的放大倍數(shù)，相應(yīng)的處 理方式和所測得的血清miR-122濃度見表11。
[0100] 表11 :APAP處理的小鼠肝臟中循環(huán)miR-122濃度與肝損傷的病理組織學(xué)分析比 較。
[0101]
[0102] 表12朝態(tài)標(biāo)準(zhǔn)RNA的序列。
[0103]
[0106]W上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用W限制本本發(fā)明，凡在本發(fā)明的 精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種直接對miRNA進(jìn)行絕對定量檢測的方法，采用miRFLP法，其步驟包括：將待測 miRNA樣本與動態(tài)miRNA標(biāo)準(zhǔn)混合均勻，然后經(jīng)過miRNA逆轉(zhuǎn)錄、cDNA加尾、PCR同步擴(kuò)增 及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光片段長度多態(tài)性分析，其特征在于：在所述cDNA加尾步驟中，對適配 寡聚核苷酸鏈3'末端進(jìn)行修飾。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：對待測樣本進(jìn)行預(yù)處理，所述預(yù)處理采 用的預(yù)處理試劑為質(zhì)量百分濃度10 %或90 %的二甲基亞砜，預(yù)處理方式為室溫孵育或加 熱處理。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述對適配寡聚核苷酸鏈3'末端進(jìn)行修 飾的方法為碳鏈修飾或氨基修飾或增加一個與所述適配寡聚核苷酸鏈序列相同的寡聚核 苷酸鏈。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：對miRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及PCR反應(yīng)物進(jìn)行 富集。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：富集時采用生物素-瓊脂糖鏈霉素偶聯(lián) 試劑或鏈霉素磁珠。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述待測miRNA樣本為含有miR-122的 樣本；所測動物模型中血漿miR-122濃度與肝損傷的組織學(xué)診斷有對應(yīng)關(guān)系。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述待測miRNA樣本來自血衆(zhòng)、血清、血 液或體液，待測miRNA樣本不經(jīng)過RNA提取，直接進(jìn)行檢檢測。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述待測miRNA樣本中加入細(xì)菌RNA。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：在低溫冷凍保存樣本時，加入10 %的二甲 基亞砜。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述miRNA逆轉(zhuǎn)錄過程中，采用的引物 為經(jīng)過生物素標(biāo)記的歐米伽引物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種直接對miRNA進(jìn)行絕對定量檢測的方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，采用miRFLP測定法，其步驟包括：待測樣本與動態(tài)miRNA標(biāo)準(zhǔn)混合均勻，經(jīng)過miRNA逆轉(zhuǎn)錄、cDNA加尾、PCR同步擴(kuò)增及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光片段長度多態(tài)性分析，在所述cDNA加尾步驟中，對適配寡聚核苷酸鏈3’末端進(jìn)行修飾，降低反應(yīng)背景信號，避免miRNA3’末端同源序列的干擾；采用生物素-瓊脂糖鏈霉素偶聯(lián)試劑或鏈霉素磁珠富集逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)物，增加上樣量，減低方法誤差，加入細(xì)菌RNA作為保護(hù)試劑，降低測定誤差，本方法可以對0.4μl的樣本進(jìn)行直接測定，在128個分子的測定水平，測定變動范圍降低至9.9％，本方法測定的靈敏度顯著提高，測定誤差范圍顯著縮小。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105331695
【申請?zhí)枴緾N201510740984
【發(fā)明人】徐凱, 唐放, 張耀藝, 羅德倫, 楊莉
【申請人】成都諾恩生物科技有限公司
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2015年11月4日