[0019] 作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案：所述待測(cè)miRNA樣本來自血漿、血清、血液或體液， 待測(cè)miRNA樣本不經(jīng)過RNA提取，直接進(jìn)行檢檢測(cè)。
[0020] 作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案：所述待測(cè)miRNA樣本中加入細(xì)菌RNA。
[0021] 作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案：在低溫冷凍保存樣本時(shí)，加入10%的二甲基亞諷W 保持細(xì)胞分泌泡的完整性
[0022] 作為更進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案：所述待測(cè)miRNA樣本中加入表面活性劑，在75°C下保溫3min，W釋放受蛋白質(zhì)保護(hù)的miRNA。
[0023] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案：所述miRNA逆轉(zhuǎn)錄過程中，采用的引物為經(jīng)過生物素標(biāo)記 的歐米伽引物。
[0024] 現(xiàn)有的miRFLP定量分析方法，其步驟如圖1中A所示，首先利用歐米伽引物對(duì) miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，WmiRNA為模版合成出相應(yīng)的歐米伽引物次生探針。用含有與相應(yīng)次生 探針序列和PCR祀點(diǎn)序列互補(bǔ)的適配寡聚核巧酸鏈（adapter)為模版，利用新生成的歐米 伽引物次生探針進(jìn)行cDNA加尾，形成PCR擴(kuò)增模版。最后用一對(duì)巧光標(biāo)記的PCR通用引物 對(duì)反應(yīng)中所有PCR擴(kuò)增模版進(jìn)行競爭性同步擴(kuò)增，完成miRFLP的反應(yīng)步驟。該方法的缺陷 是適配寡聚核巧酸鏈既可W作為歐米伽次生引物的模版，也可用作為DNA合成引物。利用 產(chǎn)物的長度，適配寡聚核巧酸鏈作為歐米伽次生引物的模版可W精確地區(qū)分成熟miRNA與 其前體產(chǎn)生的片段，但作為引物時(shí)，不能區(qū)分miRNA的成熟體及前體的降解產(chǎn)物。本發(fā)明對(duì) 適配寡聚核巧酸鏈的3'末端進(jìn)行了一系列的修飾，阻止適配寡聚核巧酸引發(fā)的多聚反應(yīng)。 采用的修飾方法可W是對(duì)適配寡聚核巧酸鏈3'末端進(jìn)行修飾，如碳鏈修飾，可W改造寡核 巧酸的空間距離，修改和抑制DNA聚合酶活性；必要時(shí)也可W加長碳鏈長度，達(dá)到所需的效 果。其它的修飾方法如對(duì)適配寡聚核巧酸鏈3'末端進(jìn)行氨基修飾等，也可達(dá)到同樣的效果。 在適配寡聚核巧酸鏈的3'末端加上一個(gè)序列相同的寡聚核巧酸短鏈，如：AATTAAA，也可起 到阻止DNA聚合酶活性的功效。運(yùn)樣3'末端修飾過的適配寡聚核巧酸鏈，只能用作模版， 用于對(duì)待測(cè)miRNA的長度進(jìn)行精確分析，本發(fā)明的定量分析檢測(cè)方法如圖1中的B所示，在 適配寡聚核巧酸3'末端加上不同的序列，也能使從適配寡聚核巧酸鏈產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物用長 度差異加W區(qū)分。
[00巧]歐米伽引物可W專一識(shí)別miRNA3'末端，低溫雜交條件下高效地逆轉(zhuǎn)錄捕獲的miRNA;適配寡聚核巧酸鏈序列與目標(biāo)miRNA的序列互補(bǔ)，可W識(shí)別miRNA5'末端。miRNA前 體等RNA片段可能生成的歐米伽次生探針與adapter序列產(chǎn)生錯(cuò)配，或無法延長，或產(chǎn)生不 同長度的PCR擴(kuò)增模版。
[0026]本發(fā)明中，優(yōu)選采用生物素標(biāo)記的歐米伽引物對(duì)短鏈RNA進(jìn)行捕獲，RT反應(yīng)，然后 用瓊脂糖鏈霉素或鏈霉素磁珠進(jìn)行純化，使樣本的實(shí)際上樣量達(dá)到0. 4μ1，并因此大大改 善了方法的測(cè)定誤差。
[0027]游離RNA極易受到核酸酶攻擊而降解，難于保存和定量，一直是RNA臨床診斷應(yīng)用 的難題。循環(huán)miRNA受蛋白質(zhì)包裹保護(hù)，部分循環(huán)miRNA還可能進(jìn)一步受到細(xì)胞分泌泡脂質(zhì) 膜的保護(hù)，因而異常的穩(wěn)定。將miRNA從蛋白質(zhì)中釋放后用RNA酶抑制劑巧I)保護(hù)，可直接 進(jìn)行測(cè)定，避免樣本收集、運(yùn)輸、保存、RNA純化過程帶來的丟失和降解。已有用RT-qPCR技 術(shù)對(duì)血清樣本中miRNA利用高濃度表面活性劑（1. 25%Tween-20)裂解，直接測(cè)定的實(shí)驗(yàn)報(bào) 道，但沒有考慮到樣本個(gè)體差異和酶反應(yīng)效率的影響，高濃度表面活性劑對(duì)反應(yīng)的抑制，因 而沒有實(shí)用價(jià)值。利用內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)RNA的miRFLP測(cè)定法可W排除樣本個(gè)體差異和反應(yīng)效率 的影響，客觀地對(duì)不同樣本中的miRNA釋放處理后直接進(jìn)行定量測(cè)定，避免了RNA的提取， 簡化操作，避免RNA丟失和降解，降低測(cè)定誤差和增加測(cè)定的重復(fù)性。
[0028] 血漿樣本中核酸酶活性各不相同，加上循環(huán)miRNA的含量低，因此，核酸酶的降解 W及試管管壁的吸附均可對(duì)定量結(jié)果帶來不可預(yù)期的影響。本發(fā)明的免提取miRFLP直接 測(cè)定法，優(yōu)選利用細(xì)菌RNA作為保護(hù)載體對(duì)血漿進(jìn)行稀釋，對(duì)樣本進(jìn)行保護(hù)，增加測(cè)定的重 復(fù)性，尤其是對(duì)低含量循環(huán)miRNA的測(cè)定。所述細(xì)菌可W采用大腸桿菌D冊(cè)a等等。原核生 物不產(chǎn)生miRNA，因此任何一種細(xì)菌產(chǎn)生的RNA均可用于本發(fā)明作為miRNA測(cè)定時(shí)的RNA保 護(hù)載體。測(cè)試結(jié)果表明，Wng/μ1的細(xì)菌RNA對(duì)表2是對(duì)用TRIZol試劑純化的肝損傷患者 血漿RNA和血漿直接測(cè)定結(jié)果的比較。由于RNA純化過程的丟失和降解，純化RNA的定量 結(jié)果低于血漿直接測(cè)定的結(jié)果，僅為直接測(cè)定結(jié)果的33. 5% -38. 9%。人工合成RNA或M2 隧菌體RNA等不含有待測(cè)miRNA片段的RNA均可作為細(xì)菌RNA的代替物。
[0029] 經(jīng)過上述改進(jìn)的免提取miRFLP直接測(cè)定法在檢測(cè)的專一性、靈敏度和重復(fù)性方 面均有提高，可用與于對(duì)血漿中循環(huán)miR-122和循環(huán)miR-451的直接測(cè)定。對(duì)25個(gè)健康人 血漿測(cè)定結(jié)果顯示，女性循環(huán)miR-122的平均值為每微升血漿1409個(gè)分子，男性每微升血 漿含3169個(gè)分子。對(duì)運(yùn)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行t-檢驗(yàn)，得出的P值為0. 046,顯示二者的差別具有統(tǒng) 計(jì)意義。而血漿miR-122水平與年齡的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示沒有關(guān)聯(lián)。與常用的肝損傷血清學(xué)指 標(biāo)ALT、AST等相比，循環(huán)miR-122顯示出更好的靈敏度。對(duì)8個(gè)ICU住院病人血漿miR-122 的測(cè)定結(jié)果，證實(shí)循環(huán)miR-122高表達(dá)是一個(gè)普遍現(xiàn)象。
[0030] 血漿miRNA可W在低溫條件下長期保存，并在經(jīng)歷了 10次W上的反復(fù)凍融后，純 化RNA為測(cè)定樣本，含量不會(huì)發(fā)生明顯的改變。miRNA在血漿中的存在形式有兩種，大部分 血漿miRNA嵌合于ago蛋白質(zhì)內(nèi)，如血漿中的miR-122/21/155等，成熟miRNA主要被蛋白 質(zhì)包裹的形式存在（游離miRNA);而let-7/miR-451等則除了被蛋白質(zhì)包裹，還進(jìn)一步被 細(xì)胞分泌泡裹挾。細(xì)胞分泌泡的多寡與被檢測(cè)目標(biāo)的生理病理狀態(tài)有關(guān)，如腫瘤病人血漿 中細(xì)胞分泌泡的數(shù)量就比正常人高出數(shù)倍。目前還沒有直接的測(cè)定方法對(duì)DNA、RNA和蛋白 質(zhì)在血漿中不同存在形式的數(shù)量比例作出準(zhǔn)確的評(píng)估。免抽提miRFLP測(cè)定法利用加熱松 散蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，釋放出miRNA,并進(jìn)行定量測(cè)定，因?yàn)楸砻婊钚詣┖可跷?，不破壞膜結(jié)構(gòu)， 因而不能測(cè)定細(xì)胞分泌泡中的RNA。因此，miRFLP測(cè)定法測(cè)定的是自由態(tài)的、蛋白質(zhì)包裹的 miRNA。在不加入凍存保護(hù)劑時(shí)，反復(fù)凍融對(duì)細(xì)胞分泌泡膜結(jié)構(gòu)造成破壞，釋放出的miRNA 會(huì)增加血漿中能被免抽提miRFLP檢測(cè)法檢測(cè)到的。
[0031] 活細(xì)胞凍存時(shí)，優(yōu)選加入凍存保護(hù)劑，如二甲基亞諷或甘油，增加膜的通透性，避 免微晶的形成，降低細(xì)胞受凍融過程所受的損傷。沒有凍存保護(hù)劑，反復(fù)凍融對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu) 造成破壞，破壞的程度與凍融次數(shù)有關(guān)。細(xì)胞分泌泡（exosome)的膜成份來自細(xì)胞膜，二者 具有相同的特性。用反復(fù)凍融的方法處理，血漿中細(xì)胞分泌泡裹挾的內(nèi)含物可W隨著膜結(jié) 構(gòu)的破壞而釋放，增加樣本中能被免抽提miRFLP檢測(cè)法檢測(cè)到的miRNA的數(shù)量。10%的 二甲基亞諷避免水溶液形成微晶，增加細(xì)胞膜的通透性，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的凍存保護(hù)；血漿 中加入10%的二甲基亞諷可W在低溫凍存時(shí)保存細(xì)胞分泌泡的完整性，可用于區(qū)分細(xì)胞分 泌泡內(nèi)外的物質(zhì)成份及含量的分別測(cè)定。高濃度二甲基亞諷使蛋白質(zhì)變性，并在濃度達(dá)到 93%時(shí)使蛋白質(zhì)完全結(jié)晶，滅活核酸酶。含90%二甲基亞諷的血漿在20°C溫度下不影響細(xì) 胞分泌泡的膜結(jié)構(gòu)，加熱后，膜結(jié)構(gòu)被破壞，miRNA游離出來，增加被檢測(cè)目標(biāo)的濃度，測(cè)定 結(jié)果與經(jīng)過6次及W上的凍融處理引起血漿miR-122/451濃度的升高一致。含90%二甲 基亞諷的血漿，經(jīng)加熱處理，可釋放出細(xì)胞分泌泡內(nèi)的物質(zhì)，具有與經(jīng)過6次及W上反復(fù)凍 融相等的效果。含10%二甲基亞諷的血漿在20°C的低溫條件下對(duì)RT及PCR反應(yīng)沒有抑制 作用，并增加細(xì)胞膜的通透性，降低miRFLP測(cè)定處理過程中對(duì)膜結(jié)構(gòu)的損傷。在本發(fā)明中， 10%濃度的二甲基亞諷用于血漿冷凍保存時(shí)對(duì)細(xì)胞分泌泡完整性的保護(hù)，和游離蛋白質(zhì)包 裹的miRNA的測(cè)定；90%濃度的二甲基亞諷則用于對(duì)細(xì)胞分泌泡包裹的miRNA或RNA或DNA 的測(cè)定。
[0032] 本發(fā)明進(jìn)一步應(yīng)用是制備任何用于miRNA測(cè)定的試劑或試劑盒套裝。本發(fā)明可W 單獨(dú)進(jìn)行商業(yè)化利用，也可W作為特定應(yīng)用試劑盒的組成部分。本發(fā)明也包括在任何試劑 盒、服務(wù)、指導(dǎo)和手冊(cè)中利用免抽提miRFLP直接測(cè)定法對(duì)待測(cè)miRNA相對(duì)巧光強(qiáng)度的計(jì)算 方法。也包括在任何試劑盒、服務(wù)、指導(dǎo)和手冊(cè)中利用對(duì)數(shù)回歸方程模型作為miRNA相對(duì)巧 光強(qiáng)度-miRNA分子數(shù)校正曲線換算miRNA絕對(duì)數(shù)目的計(jì)算方法。
[0033]W上的描述說明僅WmiR-122為例，不應(yīng)解讀為對(duì)本發(fā)明應(yīng)用范圍的限制。成熟 miRNA、siRNA具有與miR-122-樣的物理、化學(xué)特性，將上述的miR-122改為miRNA或siRNA 一樣適用。本發(fā)明也適用于鑒定各種大分子RNA中的一段或幾段較小的序列，從而達(dá)到對(duì) 體液中各種不同RNA片段的定性、定量測(cè)定。
[0034] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0035] (1)利用3'修飾的適配寡聚核巧酸，降低反應(yīng)背景信號(hào)，避免RNA3'末端同源序列 的干擾；
[003引 似利用比如生物素-鏈霉素偶聯(lián)試劑對(duì)RT及PCR反應(yīng)物進(jìn)行富集，增加上樣量， 減低方法誤差；
[0037] 做加入細(xì)菌RNA作為保護(hù)試劑，降低測(cè)定誤差；
[003引 （4)經(jīng)過改進(jìn)的miR化P直接測(cè)定法可W對(duì)0. 4μ1血漿進(jìn)行直接測(cè)定，比現(xiàn)有的方 法提高了 20倍；在128個(gè)分子的測(cè)定水平時(shí)，測(cè)定變動(dòng)范圍降低至9. 9%，比現(xiàn)有的方法降 低50%W上，檢測(cè)的專一性、靈敏度和重復(fù)性方面均有顯著提高。
[0039] (5)利用90 %濃度的二甲基亞諷對(duì)樣本預(yù)處理，可W對(duì)游離miRNA和細(xì)胞分泌泡 內(nèi)含miRNA的進(jìn)行區(qū)別定量測(cè)定。
【附圖說明】
[0040] 圖1 :miRFLP的測(cè)定原理圖；
[0041] 圖中A為現(xiàn)有的即改進(jìn)前的miRFLP的測(cè)定原理；B為本發(fā)明即改進(jìn)后的miRFLP的 測(cè)定原理；
[0042] 圖2 :不同濃度SDS、TritonX-100W及Tween-80對(duì)miRFLP測(cè)定法的影響。
[0043] 圖3:免抽提miRFLP直接測(cè)定法測(cè)定血漿miR-122濃度的線性范圍評(píng)估結(jié)果圖。
[0044] 圖4 :凍融次數(shù)對(duì)血漿miR-122濃度測(cè)定的影響。