專利名稱：：一種定量檢測(cè)AML1/ETOmRNA水平的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種定量檢測(cè)AML1/ET0mRNA水平的試劑盒。技術(shù)背景急性髓性白血病(AML)染色體異位t(8;21)(q22;q22)在分子水平上表現(xiàn)為AML1基因與ET0基因形成融合基因AML1/ET0，約有8-12%的成人及兒童原發(fā)性AML中含有該融合基因，約有40X的M2型AML患者含有該融合基因，此外M0型、Ml型及M4型AML患者中亦有少數(shù)病例報(bào)道。AML1基因編碼異二聚體轉(zhuǎn)錄因子CBF的ct亞單位，它是造血系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵因子，ETO蛋白則是一個(gè)轉(zhuǎn)錄共抑制因子。目前關(guān)于AML1/ET0引發(fā)AML的機(jī)制還不十分清楚。AMU/ETO融合基因類型單一，AML1上的斷裂點(diǎn)均在內(nèi)含子5上，而ETO上的斷裂點(diǎn)均在外顯子2的上游，因此采用一套引物即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增AML1/ET0融合基因。采用PCR技術(shù)檢測(cè)AML1/ET0融合基因?qū)τ谠贏ML的診斷、預(yù)后及治療過程中微小殘留病(MRD)的監(jiān)測(cè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。近幾年發(fā)明的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(RQ-PCR)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到真正意義的定量的飛躍。與普通PCR相比，RQ-PCR除了能夠定量之外還具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)通過在PCR反應(yīng)體系中加入探針或通過制作熔解曲線，使特異性增強(qiáng)、靈敏度提高；(2)擴(kuò)增過程中閉管操作，實(shí)時(shí)收集數(shù)據(jù)，降低了污染機(jī)會(huì)，減少假陽性結(jié)果；(3)無需電泳，縮短了操作時(shí)間；(4)通過定量內(nèi)參基因來評(píng)價(jià)樣本質(zhì)量，減少了假陰性結(jié)果。基于TaqMan探針的RQ-PCR技術(shù)關(guān)鍵之處在于PCR反應(yīng)體系中除了上、下游引物外還加入了TaqMan探針，該探針的5'端和3'端分別標(biāo)有熒光報(bào)告基團(tuán)(如FAM或TET)和熒光淬滅基團(tuán)(如TAMRA)。PCR反應(yīng)前，探針完整，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被熒光淬滅基團(tuán)淬滅；隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，Taq酶發(fā)揮5'—3'的外切活性，使切下來的熒光報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離熒光淬滅基團(tuán)，產(chǎn)生熒光信號(hào)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與初始模板DNA的量成正比，當(dāng)熒光信號(hào)強(qiáng)度大于閾值(基線以上IO個(gè)SD)時(shí)，即可被熒光探測(cè)器定期實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，每個(gè)樣本的CT值(PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù))與起始模板量的對(duì)數(shù)值成正比，可以根據(jù)CT值利用標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算出目的基因及內(nèi)參基因的量，二者相除的比值即為目的基因的相對(duì)水平。要計(jì)算出起始模板的量必須利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作是采用經(jīng)過系列稀釋的已知起始量的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行RQ-PCR，標(biāo)準(zhǔn)品可以是已知質(zhì)量的cDNA或已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒，前者制作比較簡單，但是得到的未知樣品結(jié)果不直觀，較難理解；而質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品盡管制備比較繁瑣，但是利用它可以計(jì)算出未知樣品的拷貝數(shù)，且結(jié)果直觀，是目前應(yīng)用最廣泛的標(biāo)準(zhǔn)品類型。內(nèi)參基因選擇的目的是為了消除不同樣本之間raRNA質(zhì)量、數(shù)量以及逆轉(zhuǎn)錄效率等方面的差異，內(nèi)參基因的選擇有以下三大要求(1)在所有有核細(xì)胞中均穩(wěn)定表達(dá)，與分化系列及分化階段無關(guān)，不受實(shí)驗(yàn)處理的影響；(2)不存在假基因；(3)表達(dá)水平及降解水平與目的基因一致。采用RQ-PCR技術(shù)檢測(cè)AML1/ET0mRNA水平的臨床應(yīng)用價(jià)值主要體現(xiàn)在以下三大方面(1)診斷AML1/ET0mRNA為AML、尤其是M2型AML患者所特有，而急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者不表達(dá)該融合基因，因此采用RQ-PCR技術(shù)檢測(cè)AML1/ET0mRNA水平有利于AML的確診，并尋找出適合MRD監(jiān)測(cè)的敏感特異的分子指標(biāo)。最新的WH0診斷標(biāo)準(zhǔn)中已將AML1/ET0(+)AML單列為一種獨(dú)立類型。(2)預(yù)后AML1/ET0(+)患者的預(yù)后良好，因此采用RQ-PCR技術(shù)檢測(cè)AML1/ET0mRNA水平可以將患者分層，有助于臨床治療方案的選擇。(3)MRD的監(jiān)測(cè)目前對(duì)AML1/ET0(+)AML患者的治療包括化療及造血干細(xì)胞移植兩大類，它們可以使大部分患者獲得遺傳學(xué)完全緩解，其后MRD的監(jiān)測(cè)只能依靠目前公認(rèn)的最敏感的RQ-PCR技術(shù)。MRD水平的確定是療效評(píng)價(jià)、治療方案的選擇(如改變化療方案、針對(duì)移植患者的供者淋巴細(xì)胞輸注等臨床干預(yù)措施)的重要依據(jù)，對(duì)于預(yù)防臨床復(fù)發(fā)、提高患者緩解率、治愈率及生存率具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測(cè)AML1/ET0mRNA水平的試劑盒。本發(fā)明所提供的定量檢測(cè)AML1/ET0mRNA水平的試劑盒包括用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系和AML1/ET0實(shí)時(shí)定量PCR體系；所述AML1/ET0實(shí)時(shí)定量PCR體系包括上游引物、下游引物和TaqMan探針，所述AML1/ET0實(shí)時(shí)定量PCR體系的上游引物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，下游引物的核苷酸序列如序列泰中序列2所示，TaqMan探針的核苷酸序列如序列表中序列3所示。所述內(nèi)參基因優(yōu)選為ABL基因，以ABL基因作為內(nèi)參基因時(shí)，所述內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系包括上游引物、下游引物和TaqMan探針；所述內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系的上游引物的核苷酸序列如序列表中序列4所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列5所示，TaqMan探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示；上述內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系、AML1/ET0實(shí)時(shí)定量PCR體系中還包括熒光PCR的MasterMix。本發(fā)明中，上述AML1/ET0實(shí)時(shí)定量PCR體系及內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系中的TaqMan探針的3'端連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，5'端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。上述定量檢測(cè)AML1/ET0raRNA水平的試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品為含有ABL基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，所述ABL基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示。為了方便使用，上述定量檢測(cè)AML1/ET0mRNA水平的試劑盒還包括陰性對(duì)照和AML1/ET0陽性對(duì)照。本發(fā)明的定量檢測(cè)AML1/ET0mRNA水平的試劑盒具有以下特點(diǎn)1、敏感度高可重復(fù)敏感度為5個(gè)拷貝。2、成本低實(shí)驗(yàn)體系僅為l(Hil，各成分用量均減少一半以上，從而使成本明顯降低。此外，檢測(cè)目的基因及內(nèi)參基因共用一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，既簡便又降低成本。3、實(shí)用性強(qiáng)本試劑盒同時(shí)包括內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，可同時(shí)定量出樣本中AML1/ET0融合基因及內(nèi)參基因ABL的拷貝數(shù)，最終計(jì)算出樣本AML1/ET0mRNA水平。4、使用簡便使用時(shí)只需加入待測(cè)樣品的cDNA即可開始PCR反應(yīng)。5、儲(chǔ)存期長-2(TC條件下可以長期保存(M.5年)，且不影響檢測(cè)效果。本發(fā)明的試劑盒可以準(zhǔn)確、快速、定量測(cè)定AMLl/ET0mRNA水平，用于急性髓性白血病的診斷及治療過程中微小殘留病的監(jiān)測(cè)，為臨床疾病的確診、治療方案的確定、療效評(píng)價(jià)及預(yù)后提供重要的分子依據(jù)。圖1為利用內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系擴(kuò)增1X106—1X102拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線具體實(shí)施例方式如果兩種基因的PCR擴(kuò)增效率一致，那么分別利用它們的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制作的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線也是一樣的，即標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率及縱截距與基因類型無關(guān)。因此本發(fā)明在驗(yàn)證目的基因AML1/ET0和內(nèi)參基因ABL的PCR擴(kuò)增效率一致后，采用一條標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)定量目的基因和內(nèi)參基因的拷貝數(shù)，這樣不僅簡便經(jīng)濟(jì)，更可以消除質(zhì)粒定量帶來的差異，提高RQ-PCR的準(zhǔn)確度。實(shí)施例1、定量檢測(cè)AML1/ET0mRNA水平的試劑盒的制備一、定量檢測(cè)AML1/ET0mRNA水平的試劑盒中引物和探針的設(shè)計(jì)AML1/ET0實(shí)時(shí)定量PCR體系如下(1)上游引物(位于AML1外顯子5):5，-CACCTACCACAGAGCCATCAAA-3，(序列表中序列l(wèi))，終濃度為0.3jxM;(2)下游引物(位于ET0外顯子2):5，-ATCCACAGGTGAGTCTGGCATT-3，(序列表中序列2)，終濃度為0.3pM;(3)TaqMan探針(位于ETO外顯子2):5，-AACCTCGAAATCGTACTGAGAAGCACTCCA-3'(序列表中序列3)，終濃度為0.2pM;(4)熒光PCR的MasterMix(購自美國ABI公司)。內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系如下(1)上游引物(位于ABL外顯子2):5，-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3，(序列表中序列4)，終濃度為0.3pM;(2)下游引物(位于ABL外顯子3):5，-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3，(序列表中序列5)，終濃度為0.3pM;(3)TaqMan探針(位于ABL外顯子3):5，-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-3'(序列表中序列6)，終濃度為0.2pM;(4)熒光PCR的MasterMix(購自美國ABI公司)。上述AML1/ET0實(shí)時(shí)定量PCR體系及內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系中的TaqMan探針的3'端連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，5'端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。二、ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品包括1X1()6拷貝/VL、1Xl()5拷貝/^iL、1乂104拷貝/^、IX1()3拷貝/nL和1X1()2拷貝/VL五個(gè)濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，其具體制備方法如下依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品序列覆蓋并大于RQ-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的原則設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的引物，具體序列為上游引物5'-CCTTCAGCGGCCAGTAGC-3，，下游引物5，-GGACACAGGCCCATGGTAC-3，。提取正常人離體外周血單個(gè)核細(xì)胞的總RNA,將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA并以該cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、回收、純化，將純化后的產(chǎn)物連接到pGEM-TEasy載體上，并轉(zhuǎn)染T0P10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，利用藍(lán)白斑篩選陽性克隆。提取陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒小提并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，連接到pGEM-TEasy載體上的ABL基因的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列7所示。其中，自5'末端第142位一第172位為上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系的上游引物，自5，末端第210位一第237位為上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系的TaqMan探針序列，自5，末端第245位一第265位為上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系的下游引物。將上述測(cè)序結(jié)果正確的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒中提，并測(cè)定質(zhì)粒濃度、計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)、進(jìn)行10倍系列稀釋，最后分裝成lXl()6拷貝AiL、1X105拷貝/iiL、1X104拷貝/VL、1X103拷貝AiL、1X1()2拷貝/VL、1XW拷貝/VL，置一8(TC凍存?zhèn)溆?。三、陰性?duì)照質(zhì)粒-WT1及AML1/ET0陽性對(duì)照的制備1、陰性對(duì)照質(zhì)粒-WT1的制備提取1例己經(jīng)確診為急性早幼粒細(xì)胞白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成c靈，以該c醒為模板，以5，-ccacagcacagggtacgaga-3，禾口5，-ctcagatgccgaccgtacaa-3，為引物PCR擴(kuò)增WT1基因。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收、純化后的產(chǎn)物連接到pGEM-TEasy載體上，并轉(zhuǎn)染TOP10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，利用藍(lán)白斑篩選陽性克隆。提取陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒小提并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，連接到pGEM-TEasy載體上的WTl基因的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列8所示。得到的測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒即為陰性對(duì)照質(zhì)粒-WTl。2、細(xì)L1/ET0陽性對(duì)照的制備分離1例來自人民醫(yī)院的初診為顏L1/ET0(+)急性髓性白血病患者的離體骨髓單個(gè)核細(xì)胞，提取其總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，該cDNA即為AML1/ET0陽性對(duì)照。四、使用方法所有待測(cè)樣品均需擴(kuò)增內(nèi)參基因ABL，計(jì)算ABL的拷貝數(shù)并確定待測(cè)樣品的質(zhì)量。待測(cè)樣品合格(ABL拷貝數(shù)》30000的標(biāo)本認(rèn)為合格，否則需重新抽取標(biāo)本再檢測(cè))的患者，再擴(kuò)增AML1/ET0融合基因。具體使用方法如下1、取離體的待檢測(cè)病人骨髓或外周血單個(gè)核細(xì)胞，提取其總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。2、在9pL上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系中加入lpL步驟1的待測(cè)樣品的cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，然后計(jì)算ABL的拷貝數(shù)并確定待測(cè)樣品的質(zhì)對(duì)于待測(cè)樣品合格(ABL拷貝數(shù)》30000的標(biāo)本認(rèn)為合格，否則需重新抽取標(biāo)本再檢測(cè))的患者，在9pL上述步驟一的AML1/ET0實(shí)時(shí)定量PCR體系中加入lpL步驟1的待測(cè)樣品的cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。上述實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的條件為先5(TC2minl個(gè)循環(huán)；然后95°C10min1個(gè)循環(huán)；再95。C15s，62°Clmin，40個(gè)循環(huán)。3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作在9nL上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系中分別加入lpL上述步驟二制備的拷貝數(shù)為1X106、1X105、1X104、1X1()3及1X102五個(gè)濃度的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，先5(TC2min1個(gè)循環(huán)；然后95°C10min1個(gè)循環(huán)；再95。C15s，62°Clmin，40個(gè)循環(huán)。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中1X102拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)做兩管平行管，其余各拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別擴(kuò)增一管。4、每批RQ-PCR反應(yīng)還需同時(shí)擴(kuò)增陽性及陰性對(duì)照。在9pL上述步驟一的AML1/ET0實(shí)時(shí)定量PCR體系中加入lpL上述步驟三制備的AML1/ET0陽性對(duì)照；在9pL上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系中加入l|iL上述步驟三制備的陰性對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。5、待測(cè)樣品的AML1/ET0inRNA水平按照如下公式計(jì)算待測(cè)樣品的AML1/ET0mRNA水平(％)=AML1/ET0拷貝數(shù)X100%ABL拷貝數(shù)本發(fā)明的定量檢測(cè)AML1/ET0mRNA水平的試劑盒的儲(chǔ)存條件為4。C避光儲(chǔ)存至少2個(gè)月或-2(TC避光儲(chǔ)存1.5年。五、本發(fā)明的定量檢測(cè)AML1/ET0mRNA水平的試劑盒的敏感度、特異性和穩(wěn)定性測(cè)定1、敏感度可重復(fù)敏感度為5個(gè)拷貝將按照上述步驟二的方法制備的5個(gè)拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品各5份，分別利用上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系進(jìn)行5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果每次實(shí)驗(yàn)中均有擴(kuò)增曲線，因此本發(fā)明的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系的可重復(fù)敏感度為5個(gè)拷貝。將上述步驟三制備的AML1/ET0陽性對(duì)照進(jìn)行系列稀釋，分別以系列稀釋后的cDNA為模板，利用上述步驟一的AML1/ET0實(shí)時(shí)定量PCR體系進(jìn)行5批次重復(fù)RQ-PCR反應(yīng)，每次反應(yīng)均同時(shí)擴(kuò)增ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果每次實(shí)驗(yàn)中相當(dāng)于5個(gè)拷貝及大于5個(gè)拷貝的稀釋后的AML1/ET0陽性對(duì)照均有擴(kuò)增曲線，因此本發(fā)明的AML1/ET0實(shí)時(shí)定量PCR體系的可重復(fù)敏感度為5個(gè)拷貝。2、特異性我們利用上述步驟一的AML1/ET0實(shí)時(shí)定量PCR體系檢測(cè)了陰性對(duì)照質(zhì)粒-WT1，結(jié)果未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，證實(shí)本發(fā)明的試劑盒具有特異性。因?yàn)槿祟愑泻说脑煅?xì)胞均含有ABL基因，利用上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系檢測(cè)了不含ABL基因的WT1質(zhì)粒，結(jié)果未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，證實(shí)ABL檢測(cè)具有特異性。3、穩(wěn)定性以下穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中所用的標(biāo)本均來自人民醫(yī)院，為自愿供體的離體骨髓單個(gè)核細(xì)胞。(l)日間差分析①提取標(biāo)本G717的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以該cDNA為模板，利用上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系進(jìn)行RQ-PCR反應(yīng)，共進(jìn)行5批次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下表所示，從表中數(shù)據(jù)可知，日間差變異系數(shù)(CV)為1.83%。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>②提取標(biāo)本A352的總RNA,將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以該cDNA為模板，利用上述步驟一的AML1/ET0實(shí)時(shí)定量PCR體系進(jìn)行RQ-PCR反應(yīng)，共進(jìn)行5批次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下表所示，從表中數(shù)據(jù)可知，日間差變異系數(shù)(CV)為0.61%。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(2)日內(nèi)差分析①提取標(biāo)本H236的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以該cDNA為模板，利用上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系進(jìn)行RQ-PCR反應(yīng)，在同一批次進(jìn)行了5個(gè)平行孔的RQ-PCR反應(yīng)，結(jié)果如下表所示，從表中數(shù)據(jù)可知，日內(nèi)差變異系數(shù)(CV)為1.35%,<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>②提取標(biāo)本A610的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成c咖A，并以該cDNA為模板，利用上述步驟一的AML1/ET0實(shí)時(shí)定量PCR體系進(jìn)行RQ-PCR反應(yīng)，在同一批次進(jìn)行了5個(gè)平行孔的RQ-PCR反應(yīng)，結(jié)果如下表所示，從表中數(shù)據(jù)可知，日內(nèi)差變異系數(shù)(CV)為1.30%。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4、以不同拷貝數(shù)的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為例檢測(cè)試劑盒的儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響利用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)1X103及1X107拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品室溫避光儲(chǔ)存1周、4t避光儲(chǔ)存3周、6周、9周及12周、-2(TC避光儲(chǔ)存18個(gè)月時(shí)的檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果用CT值表示，具體結(jié)果如下面兩表所示，從表中數(shù)據(jù)可以看出，隨著儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存時(shí)間的變化，CT值無明顯變化，表明試劑盒仍很穩(wěn)定。103拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品不同儲(chǔ)存溫度及時(shí)間下的CT值變化<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>107拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品不同儲(chǔ)存溫度及時(shí)間下的CT值變化<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>序列表<160〉8<210〉1<211>22<212〉DNA<213〉人工序列<400>1cacctaccacagagccatcaaa_22<210〉2<211>22〈212〉DNA<213>人工序列<400>2atccacaggtgagtctggcatt22<210>3<211〉30<212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉3肌cctcg3朋tcgta_ctg3ga_3gca_ctcc330〈210〉4<211〉31<212〉DNA〈213〉人工序列<400>4tgga_gat￡iacactctaagcataactaaaggt31〈210〉5<211〉21<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉5gatgtagttgcttgggaccca21〈210〉6<211〉28<212>DNA〈213〉人工序列<400>6ccatttttggtttgggcttcacaccatt28<210>7〈211>316<212〉DNA<213>人工序列〈400〉7ccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtg肌gccgctcgttg60gaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgc120eictgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagct180ccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggcca240aggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggta300ccatgggcctgtgtcc316〈210〉8〈211>151〈212>DNA〈213〉人工序列<400〉8ccacagcacagggtacgagagcgateiaccacacaacgcccatcctctgcggagcccaata60cagaatacacacgcacggtgtcttcagaggcattcaggatgtgcgacgtgtgcctggagt120agccccgactcttgtacggtcggcatctgag15權(quán)利要求1、一種定量檢測(cè)AML1/ETOmRNA水平的試劑盒，包括用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系和AML1/ETO實(shí)時(shí)定量PCR體系；所述AML1/ETO實(shí)時(shí)定量PCR體系包括上游引物、下游引物和TaqMan探針；所述AML1/ETO實(shí)時(shí)定量PCR體系上游引物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示，TaqMan探針的核苷酸序列如序列表中序列3所示。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述內(nèi)參基因?yàn)锳BL基因時(shí)，所述內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系包括上游引物、下游引物和TaqMan探針；所述內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系的上游引物的核苷酸序列如序列表中序列4所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列5所示，TaqMan探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示；3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系、AML1/ET0實(shí)時(shí)定量PCR體系中還包括熒光PCR的MasterMix。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述AML1/ET0實(shí)時(shí)定量PCR體系和內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系中的TaqMan探針的3'端連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，5'端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述標(biāo)準(zhǔn)品為含有ABL基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述ABL基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括AML1/ET0陽性對(duì)照。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括陰性對(duì)照。全文摘要本發(fā)明公開了一種定量檢測(cè)AML1/ETOmRNA水平的試劑盒。該試劑盒包括用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系和AML1/ETO實(shí)時(shí)定量PCR體系。本發(fā)明的試劑盒可以準(zhǔn)確、快速、定量測(cè)定AML1/ETOmRNA水平，用于急性髓性白血病的診斷及治療過程中微小殘留病的監(jiān)測(cè)，為臨床疾病的確診、治療方案的確定、療效評(píng)價(jià)及預(yù)后提供重要的分子依據(jù)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101624620SQ200810116600公開日2010年1月13日申請(qǐng)日期2008年7月11日優(yōu)先權(quán)日2008年7月11日發(fā)明者主鴻鵠,劉艷榮,李玲娣,李金蘭,秦亞溱申請(qǐng)人:北京大學(xué)人民醫(yī)院