專利名稱：：一種定量檢測BCR/ABLmRNA水平的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種定量檢測BCR/ABLmRNA水平的試劑盒。
背景技術(shù)：
：95%的慢性髓性白血病(CML)、25-30%的成人急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)及2-5y。的兒童ALL患者均具有特征性的Ph染色體，由t(9;22)交互異位形成，分子水平表現(xiàn)為22號染色體上的BCR基因與9號染色體上的ABL基因形成BCR/ABL融合基因。ABL基因上的斷裂點集中于外顯子lb上游、lb與la之間或a2上游，在mRNA水平上ABL融合部分均為a2。BCR基因上的斷裂點主要集中于以下三個區(qū)域跨越外顯子12-16的5.8kb區(qū)域，即M-BCR區(qū)；第1內(nèi)含子上的55kb區(qū)域，即m-BCR區(qū)和第19內(nèi)含子上，g卩u-BCR區(qū)。由于BCR基因上斷裂點的不同導(dǎo)致翻譯出不同分子量大小的BCR/ABL融合蛋白，分別為P21CT，L融合蛋白、Pi90BeR/AB1'融合蛋白和P23(T皿融合蛋白。CML患者BCR/ABL融合基因基本為M-型，個別為型，m-型極少見。35X成人及20X兒童Ph(+)ALL的BCR/ABL融合基因大多為M-型，其余為m-型。采用PCR技術(shù)檢測BCR/ABL融合基因?qū)τ谠贑ML和ALL的診斷及治療過程中微小殘留病(MRD)的監(jiān)測具有重要的應(yīng)用價值。近幾年發(fā)明的實時定量PCR技術(shù)(RQ-PCR)實現(xiàn)了PCR從定性到真正意義的定量的飛躍。與普通PCR相比，RQ-PCR除了能夠定量之外還具有以下優(yōu)點(1)通過在PCR反應(yīng)體系中加入探針或通過制作熔解曲線，使特異性增強、靈敏度提高；(2)擴增過程中閉管操作，實時收集數(shù)據(jù)，降低了污染機會，減少假陽性結(jié)果；(3)無需電泳，縮短了操作時間；(4)通過定量內(nèi)參基因來評價樣本質(zhì)量，減少了假陰性結(jié)果?；赥叫Man探針的RQ-PCR技術(shù)關(guān)鍵之處在于PCR反應(yīng)體系中除了上、下游引物外還加入了TaqMan探針，該探針的5'端和3'端分別標(biāo)有熒光報告基團(tuán)(如F細(xì)或TET)和熒光淬滅基團(tuán)(如T細(xì)RA)。PCR反應(yīng)前，探針完整，熒光報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被熒光淬滅基團(tuán)淬滅；隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，Taq酶發(fā)揮5'—3'的外切活性，使切下來的熒光報告基團(tuán)遠(yuǎn)離熒光淬滅基團(tuán)，產(chǎn)生熒光信號，熒光信號的強度與初始模板DNA的量成正比，當(dāng)熒光信號強度大于閾值(基線以上IO個SD)時，即可被熒光探測器定期實時監(jiān)測，每個樣本的CT值(PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)數(shù))與起始模板量的對數(shù)值成正比，可以根據(jù)CT值利用標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算出目的基因及內(nèi)參基因的量，二者相除的比值即為目的基因的相對水平。要計算出起始模板的量必須利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作是采用經(jīng)過系列稀釋的已知起始量的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行RQ-PCR，標(biāo)準(zhǔn)品可以是已知質(zhì)量的cDNA或已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒，前者制作比較簡單，但是得到的未知樣品結(jié)果不直觀，較難理解；而質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品盡管制備比較繁瑣，但是利用它可以計算出未知樣品的拷貝數(shù)，且結(jié)果直觀，是目前應(yīng)用最廣泛的標(biāo)準(zhǔn)品類型。內(nèi)參基因選擇的目的是為了消除不同樣本之間mRNA質(zhì)量、數(shù)量以及逆轉(zhuǎn)錄效率等方面的差異，內(nèi)參基因的選擇有以下三大要求(1)在所有有核細(xì)胞中均穩(wěn)定表達(dá)，與分化系列及分化階段無關(guān)，不受實驗處理的影響；(2)不存在假基因；(3)表達(dá)水平及降解水平與目的基因一致。采用RQ-PCR技術(shù)檢測BCR/ABLraRNA水平的臨床應(yīng)用價值主要體現(xiàn)在以下三大方面(1)診斷最新的冊0診斷標(biāo)準(zhǔn)要求，必須檢測到Ph染色體或BCR/ABLmRNA才能診斷為CML，因此所有的CML患者分子水平都應(yīng)存在BCR/ABL融合基因。RQ-PCR技術(shù)檢測BCR/ABLmRNA水平與染色體核型分析可以互為補充，克服隱匿異位等影響，大大提高CML的正確診斷率。(2)預(yù)后Ph(+)ALL患者的預(yù)后很差，必須進(jìn)行造血干細(xì)胞移植才能長期存活。采用RQ-PCR技術(shù)檢測患者BCR/ABLraRNA水平可以將患者分層，有助于臨床治療方案的選擇。(3)MRD的監(jiān)測目前對CML及Ph(+)ALL患者的治療已經(jīng)有造血干細(xì)胞及ABL酪氨酸激酶抑制劑(如格列衛(wèi)Glivec)等有效方法，可以使相當(dāng)多的患者獲得遺傳學(xué)完全緩解，其后MRD的監(jiān)測只能依靠目前公認(rèn)的最敏感的RQ-PCR技術(shù)。RQ-PCR技術(shù)檢測出的BCR/ABLraRNA水平不僅反映出患者體內(nèi)的白血病負(fù)荷，而且特定時間里BCR/ABLmRNA水平的下降程度與長期療效相關(guān)。MRD水平的確定是療效評價、治療方案選擇(如提高藥物劑量、針對移植患者的供者淋巴細(xì)胞輸注等臨床干預(yù)措施)的重要依據(jù)，對于預(yù)防臨床復(fù)發(fā)、提高患者緩解率、治愈率及生存率具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測BCR/ABLmRNA水平的試劑盒。本發(fā)明所提供的定量檢測BCR/ABLmRNA水平的試劑盒包括用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系和下述三種實時定量PCR體系中的至少一種:M-型BCR/ABL實時定量PCR體系、m-型BCR/ABL實時定量PCR體系和^型BCR/ABL實時定量PCR體系；所述M-型、m-型和|1-型BCR/ABL實時定量PCR體系均包括上游引物、下游引物和TaqMan探針，所述M-型BCR/ABL實時定量PCR體系中，上游引物的核苷酸序列如序列表中序列l(wèi)所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示，TaqMan探針的核苷酸序列如序列表中序列3所示;所述m-型BCR/ABL實時定量PCR體系中，上游引物的核苷酸序列如序列表中序列4所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列5所示，TaqMan探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示；所述(a-型BCR/ABL實時定量PCR體系中，上游引物的核苷酸序列如序列表中序列7所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列8所示，TaqMan探針的核苷酸序列如序列表中序列9所示。所述內(nèi)參基因優(yōu)選為ABL基因，以ABL基因作為內(nèi)參基因時，所述內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系包括上游引物、下游引物和TaqMan探針，所述內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系的上游引物的核苷酸序列如序列表中序列IO所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列11所示，T叫Man探針的核苷酸序列如序列表中序列12所示。上述內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系、M-型、ra-型和p-型BCR/ABL實時定量PCR體系中還可包括熒光PCR的MasterMix。本發(fā)明中，上述M-型BCR/ABL、m-型BCR/ABL、)i-型BCR/ABL及內(nèi)參基因四種實時定量PCR體系中的TaqMan探針的3'端連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，5'端連接有熒光報告基團(tuán)FAM。上述定量檢測BCR/ABLmRNA水平的試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品為含有ABL基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，所述ABL基因的核苷酸序列如序列表中序列13所示。為了方便使用，上述定量檢測BCR/ABLmRNA水平的試劑盒還包括陰性對照、M「型、m-型和p型BCR/ABL陽性對照。本發(fā)明的定量檢測BCR/ABLmRNA水平的試劑盒具有以下特點1、覆蓋面廣本試劑盒包含檢測M-型BCR/ABL、m-型BCR/ABL和p-型BCR/ABL的引物和探針，基本覆蓋了CML及ALL患者可能的BCR/ABL融合基因類型，提高了陽性檢出率。2、敏感度高可重復(fù)敏感度為5個拷貝。3、成本低實驗體系僅為1(^1，各成分用量均減少一半以上，從而使成本明顯降低。此外，檢測目的基因及內(nèi)參基因共用一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，既簡便又降低成本。4、實用性強本試劑盒同時包括內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，可同時定量出樣本中BCR/ABL融合基因及內(nèi)參基因ABL的拷貝數(shù)，最終計算出樣本BCR/ABLmRNA水平。5、使用簡便使用時只需加入待測樣品的cDNA即可開始PCR反應(yīng)。6、儲存期長-20。C條件下可以長期保存(〉1.5年)，且不影響檢測效果。本發(fā)明的試劑盒可以準(zhǔn)確、快速、定量測定各型BCR/ABLmRNA水平，用于慢性髓性白血病及表達(dá)BCR/ABL的急性淋巴細(xì)胞性白血病的診斷及治療過程中微小殘留病的監(jiān)測，為臨床疾病的確診、治療方案的確定、療效評價及預(yù)后提供重要的分子依據(jù)。圖1為利用內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系擴增1X1(T—1X1(^拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線具體實施例方式如果兩種基因的PCR擴增效率一致，那么分別利用它們的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制作的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線也是一樣的，即標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率及縱截距與基因類型無關(guān)。因此本發(fā)明在驗證目的基因BCR/ABL和內(nèi)參基因ABL的PCR擴增效率一致后，采用一條標(biāo)準(zhǔn)曲線同時定量目的基因和內(nèi)參基因的拷貝數(shù)，這樣不僅簡便經(jīng)濟，更可以消除質(zhì)粒定量帶來的差異，提高RQ-PCR的準(zhǔn)確度。實施例1、定量檢測BCR/ABLmRNA水平的試劑盒的制備一、定量檢測BCR/ABLmRNA水平的試劑盒中引物和探針的設(shè)計M-型BCR/ABL實時定量PCR體系組成如下(1)上游引物(位于BCR外顯子13):5，-CCGCTGACCATCAATAAGGAA-3'(序列表中序列l(wèi))，終濃度為0.3^M;(2)下游引物(位于ABL外顯子2):5，-CTCAGACCCTGAGGCTCAAAGT-3，(序列表中序列2)，終濃度為O.3pM;(3)TaqMan探針(位于ABL外顯子2):5，-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-3，(序列表中序列3)，終濃度為0.2pM;(4)熒光PCR的MasterMix(購自美國ABI公司)。m-型BCR/ABL實時定量PCR體系組成如下(1)上游引物(位于BCR外顯子1):5，-CTGGCCCAACGATGGCGA-3，(序列表中序列4)，終濃度為O.3pM;(2)下游引物(位于ABL外顯子2):5，-CACTCAGACCCTGAGGCTCAA-3，(序列表中序列5)，終濃度為O.3(iM;(3)TaqMan探針(位于ABL外顯子2):5，-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-3，(序列表中序列6)，終濃度為0.2pM;(4)熒光PCR的MasterMix(購自美國ABI公司)。p-型BCR/ABL實時定量PCR體系組成如下(1)上游引物(位于BCR外顯子19):5，-CGGACATCCAGGCACTGAA-3，(序列表中序列7)，終濃度為0.3pM;(2)下游引物(位于ABL外顯子2):5，-CTCAGACCCTGAGGCTCAAAGT-3，(序列表中序列8)，終濃度為0.3pM;(3)TaqMan探針(位于ABL外顯子2):5，-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-3，(序列表中序列9)，終濃度為0.2pM;(4)熒光PCR的MasterMix(購自美國ABI公司)。內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系組成如下(1)上游引物(位于ABL外顯子2):5，-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3，(序列表中序列10)，終濃度為0.3pM;(2)下游引物(位于ABL外顯子3):5，-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3，(序列表中序列l(wèi)l)，終濃度為0.3pM;(3)TaqMan探針(位于ABL外顯子3):5，-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-3'(序列表中序列8)，終濃度為0.2pM;(4)熒光PCR的MasterMix(購自美國ABI公司)。上述M-型BCR/ABL、m-型BCR/ABL、p-型BCR/ABL及內(nèi)參基因四種實時定量PCR體系中的T叫Man探針的3'端連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，5'端連接有熒光報告基團(tuán)FAM。二、ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品包括1Xl()6拷貝/nL、1X1()5拷貝/VL、1Xl(T拷貝AiL、IX103拷貝AiL和1X102拷貝AiL五個濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，其具體制備方法如下依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品序列覆蓋并大于RQ-PCR擴增產(chǎn)物的原則設(shè)計PCR擴增ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的引物，具體序列為上游引物5，-CCTTCAGCGGCCAGTAGC-3，，下游引物5，-GGACACAGGCCCATGGTAC-3，。提取正常人離體外周血單個核細(xì)胞的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA并以該cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收、純化，將純化后的產(chǎn)物連接到pGEM-TEasy載體上，并轉(zhuǎn)染T0P10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，利用藍(lán)白斑篩選陽性克隆。提取陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒小提并測序，測序結(jié)果表明，連接到pGEM-TEasy載體上的ABL基因的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列13所示。其中，自5'末端第142位一第172位為上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系的上游引物，自5'末端第210位一第237位為上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系的TaqMan探針序列，自5，末端第245位一第265位為上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系的下游引物。將上述測序結(jié)果正確的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒中提，并測定質(zhì)粒濃度、計算質(zhì)?？截悢?shù)、進(jìn)行10倍系列稀釋，最后分裝成lXl()6拷貝AiL、1X105拷貝AiL、1X104拷貝AiL、1X103拷貝/^iL、1Xl()2拷貝/nL、1X10'拷貝AiL，置一8(TC凍存?zhèn)溆?。三、陰性對照質(zhì)粒-WT1及M-型、m-型和^型BCR/ABL陽性對照的制備1、陰性對照質(zhì)粒-WT1的制備提取1例已經(jīng)確診為急性早幼粒細(xì)胞白血病患者骨髓單個核細(xì)胞的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成c腿，以該cDNA為模板，以5，-ccacagcacagggtacgaga-3，禾卩5，-ctcagatgccgaccgtacaa-3'為引物PCR擴增WT1基因。對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收、純化后的產(chǎn)物連接到pGEM-TEasy載體上，并轉(zhuǎn)染T0P10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，利用藍(lán)白斑篩選陽性克隆。提取陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒小提并測序，測序結(jié)果表明，連接到pGEM-TEasy載體上的WTl基因的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列14所示。得到的測序結(jié)果正確的質(zhì)粒即為陰性對照質(zhì)粒-WTl。2、M-型、m-型和p-型BCR/ABL陽性對照的制備分離1例來自人民醫(yī)院的初診為M-型BCR/ABL的CML患者的離體骨髓單個核細(xì)胞，提取其總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，該cDNA即為M-型BCR/ABL陽性對照。分離1例來自人民醫(yī)院的初診為m-型BCR/ABL的ALL患者的離體骨髓單個核細(xì)胞，提取其總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，該cDNA即為m-型BCR/ABL陽性對照。分離1例來自人民醫(yī)院的初診為^型BCR/ABL的CML患者的離體骨髓單個核細(xì)胞，提取其總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，該cDNA即為ii-型BCR/ABL陽性對照。四、使用方法所有待測樣品均需擴增內(nèi)參基因ABL，計算ABL的拷貝數(shù)并確定待測樣品的質(zhì)量。待測樣品合格(ABL拷貝數(shù)》30000的標(biāo)本認(rèn)為合格，否則需重新抽取標(biāo)本再檢測)的CML患者，首先擴增M-型BCR/ABL融合基因，若待測樣品為陰性，再擴增^型BCR/ABL融合基因及m-型BCR/ABL融合基因。對于待測樣品合格(ABL拷貝數(shù)》30000的標(biāo)本認(rèn)為合格，否則需重新抽取標(biāo)本再檢測)的ALL患者，同時擴增M-型BCR/ABL融合基因及m-型BCR/ABL融合基因。具體使用方法如下1、取離體的待檢測病人骨髓或外周血單個核細(xì)胞，提取其總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。2、在9pL上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系中加入lpL步驟1的待測樣品的cDNA，進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)，然后計算ABL的拷貝數(shù)并確定待測樣品的質(zhì)量。對于待測樣品合格(ABL拷貝數(shù)>30000的標(biāo)本認(rèn)為合格，否則需重新抽取標(biāo)本再檢測)的CML患者，在9pL上述步驟一的M-型BCR/ABL實時定量PCR體系中加入l^L步驟l的待測樣品的cDNA，進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)；若待測樣品為陰性，則在9pL上述步驟一的n-型BCR/ABL實時定量PCR體系和ra-型BCR/ABL實時定量PCR體系中分別加入lpL步驟1的待測樣品的cDNA，進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)。對于待測樣品合格(ABL拷貝數(shù)》30000的標(biāo)本認(rèn)為合格，否則需重新抽取標(biāo)本再檢測)的ALL患者，在9pL上述步驟一的M-型BCR/ABL實時定量PCR體系和m-型BCR/ABL實時定量PCR體系中分別加入lpL步驟1的待測樣品的cDNA，進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)。上述實時定量PCR反應(yīng)的條件為先50°C2min1個循環(huán)；然后95°C10min1個循環(huán)；再95。C15s，62°Clmin，40個循環(huán)。3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作在9)iL上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系中分別加入1^L上述步驟二制備的拷貝數(shù)為1X106、1X105、1X104、1X1()3及1X102五個濃度的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，先50°C2min1個循環(huán)；然后95°C10min1個循環(huán)；再95。C15s，62°Clmin，40個循環(huán)。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中1X102拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品同時做兩管平行管，其余各拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別擴增一管。利用上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系擴增1X1()6—1X102拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。4、每批RQ-PCR反應(yīng)還需同時擴增陽性及陰性對照。在9^^上述步驟一的1-型、m-型和p-型BCR/ABL實時定量PCR體系中分別加入l^L上述步驟三制備的M-型、m-型及|i-型BCR/ABL陽性對照；在9pL上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系中加入l|nL上述步驟三制備的陰性對照，進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)。5、待測樣品的BCR/ABLmRNA水平按照如下公式計算待測樣品的BCR/ABLmRNA水平(％)=BCR/ABL拷貝數(shù)X100%ABL拷貝數(shù)本發(fā)明的定量檢測BCR/ABLmRNA水平的試劑盒的儲存條件為4"C避光儲存至少2個月或-2(TC避光儲存1.5年。五、本發(fā)明的定量檢測BCR/ABLmRNA水平的試劑盒的敏感度、特異性和穩(wěn)定性測定1、敏感度內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系、M-型、m-型和n-型BCR/ABL實時定量PCR體系的可重復(fù)敏感度均為5個拷貝將按照上述步驟二的方法制備的5個拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品各5份，分別利用上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系進(jìn)行5次重復(fù)實驗，結(jié)果每次實驗中均有擴增曲線，因此本發(fā)明的內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系的可重復(fù)敏感度為5個拷貝。將上述步驟三制備的M-型、ra-型和p-型BCR/ABL陽性對照分別進(jìn)行系列稀釋，以系列稀釋后的cDNA為模板，分別利用上述步驟一的M-型、ra-型和p-型BCR/ABL實時定量PCR體系進(jìn)行5批次重復(fù)RQ-PCR反應(yīng)，每次反應(yīng)均同時擴增ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果每次實驗中相當(dāng)于5個拷貝及大于5個拷貝的稀釋后的M-型、m-型和^t-型BCR/ABL陽性對照均有擴增曲線，因此本發(fā)明的M-型、m-型和|i-型BCR/ABL實時定量PCR體系的可重復(fù)敏感度均為5個拷貝。2、特異性我們利用上述步驟一的M-型、m-型及p-型BCR/ABL實時定量PCR體系分別檢測了陰性對照質(zhì)粒-WTl，結(jié)果未出現(xiàn)擴增曲線，證實本發(fā)明的試劑盒具有特異性。因為人類有核的造血細(xì)胞均含有ABL基因，利用上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系檢測了不含ABL基因的WT1質(zhì)粒，結(jié)果未出現(xiàn)擴增曲線，證實ABL檢測具有特異性。3、穩(wěn)定性以下穩(wěn)定性實驗中所用的標(biāo)本均來自人民醫(yī)院，為自愿供體的離體骨髓單個核細(xì)胞。(l)日間差分析①提取標(biāo)本G717的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以該cDNA為模板，利用上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系進(jìn)行RQ-PCR反應(yīng)，共進(jìn)行5批次實驗，結(jié)果如下表所示，從表中數(shù)據(jù)可知，日間差變異系數(shù)(CV)為1.83%。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>②提取標(biāo)本H236的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以該cDNA為模板，利用上述步驟一的M-型BCR/ABL實時定量PCR體系進(jìn)行RQ-PCR反應(yīng)，共進(jìn)行5批次實驗，結(jié)果如下表所示，從表中數(shù)據(jù)可知，日間差變異系數(shù)(CV)為1.06%。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>③提取標(biāo)本H852的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以該cDNA為模板，利用上述步驟一的m-型BCR/ABL實時定量PCR體系進(jìn)行RQ-PCR反應(yīng)，共進(jìn)行5批次實驗，結(jié)果如下表所示，從表中數(shù)據(jù)可知，日間差變異系數(shù)(CV)為2.88%。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(2)日內(nèi)差分析①提取標(biāo)本H236的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以該cDNA為模板，利用上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系進(jìn)行RQ-PCR反應(yīng)，在同一批次進(jìn)行了5個平行孔的RQ-PCR反應(yīng)，結(jié)果如下表所示，從表中數(shù)據(jù)可知，日內(nèi)差變異系數(shù)(CV)為1.35%。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>②提取標(biāo)本H314的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以該cDNA為模板，利用上述步驟一的M-型BCR/ABL實時定量PCR體系進(jìn)行RQ-PCR反應(yīng)，在同一批次進(jìn)行了5個平行孔的RQ-PCR反應(yīng)，結(jié)果如下表所示，從表中數(shù)據(jù)可知，日內(nèi)差變異系數(shù)(CV)為1.64%。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>③提取標(biāo)本J320的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以該cDNA為模板，利用上述步驟一的m-型BCR/ABL實時定量PCR體系進(jìn)行RQ-PCR反應(yīng)，在同一批次進(jìn)行了5個平行孔的RQ-PCR反應(yīng)，結(jié)果如下表所示，從表中數(shù)據(jù)可知，日內(nèi)差變異系數(shù)(CV)為2.94%。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4、以不同拷貝數(shù)的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為例檢測試劑盒的儲存溫度和儲存時間對實驗結(jié)果的影響利用本發(fā)明試劑盒檢測1乂103及1X1(^拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品室溫避光儲存1周、4T:避光儲存3周、6周、9周及12周、-2(TC避光儲存18個月時的檢測結(jié)果，檢測結(jié)果用CT值表示，具體結(jié)果如下面兩表所示，從表中數(shù)據(jù)可以看出，隨著儲存溫度和儲存時間的變化，CT值無明顯變化，表明試劑盒仍很穩(wěn)定。103拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品不同儲存溫度及時間下的CT值變化<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>107拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品不同儲存溫度及時間下的CT值變化<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>序列表〈160>14〈210〉1〈211〉21<212>DNA<213>人工序列<400>1ccgctgaccatcaataaggaa21<210>2<211>22〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉2ctcagaccctgaggctcaaagt22<210〉3<211〉25<212〉靈〈213〉人工序列<400〉3agcccttcagcggccagtagcatct25〈210〉4<211〉18〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>4ctggcccaacgatggcga18<210〉5<211>21〈212〉DNA<213〉人工序列〈400〉5cactcagaccctgaggctcaa21〈210〉6〈211〉25<212〉DNA<213>人工序列<400>6agcccttcagcggccagtagcatct25<210>7<211>19〈212〉DNA<213〉人工序列<400〉7cggacatccaggcactgaa19<210>8<211〉22<212〉DNA<213〉人工序列<400〉8ctcagaccctgaggctcaaagt22<210〉9〈211〉25<212〉DNA<213>人工序列〈400〉9agcccttcagcggccagtagcatct25〈210〉10<211〉31<212〉DNA<213〉人工序列〈400〉10tggagataacactctaagcataactaaaggt31<210〉11〈211〉21〈212〉DNA<213〉人工序列<400>11gatgtagttgcttgggaccca21<210>12〈211〉28〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>12ccatttttggtttgggcttcacaccatt28<210>13〈211〉316〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉13ccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttg60gaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgc120actgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagct180ccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggcca240aggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggta300ccatgggcctgtgtcc<210〉14<211〉151316<212〉DNA<213>人工序列<400〉14ccacagcacagggtacgagagcgataaccacacaacgcccatcctctgcggagcccaata60C3g朋tac3c3cgca_cggtgtcttcagaggcattcagg3tgtgcga_cgtgtgcctggsgt120agccccgactcttgtacggtcggcatctgag15權(quán)利要求1、一種定量檢測BCR/ABLmRNA水平的試劑盒，包括用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系和下述三種實時定量PCR體系中的至少一種M-型BCR/ABL實時定量PCR體系、m-型BCR/ABL實時定量PCR體系和μ-型BCR/ABL實時定量PCR體系；所述M-型、m-型和μ-型BCR/ABL實時定量PCR體系均包括上游引物、下游引物和TaqMan探針；所述M-型BCR/ABL實時定量PCR體系中，上游引物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示，TaqMan探針的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述m-型BCR/ABL實時定量PCR體系中，上游引物的核苷酸序列如序列表中序列4所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列5所示，TaqMan探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示；所述μ-型BCR/ABL實時定量PCR體系中，上游引物的核苷酸序列如序列表中序列7所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列8所示，TaqMan探針的核苷酸序列如序列表中序列9所示。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于所述內(nèi)參基因為ABL基因，所述內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系包括上游引物、下游引物和TaqMan探針；所述內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系的上游引物的核苷酸序列如序列表中序列IO所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列l(wèi)l所示，TaqMan探針的核苷酸序列如序列表中序列12所示。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系、M-型、m-型和fi-型BCR/ABL實時定量PCR體系中還包括熒光PCR的MasterMix。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述M-型、m-型、p-型BCR/ABL實時定量PCR體系及內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系中的TaqMan探針的3'端連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，5'端連接有熒光報告基團(tuán)FAM。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于所述標(biāo)準(zhǔn)品為含有ABL基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述ABL基因的核苷酸序列如序列表中序列13所示。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括M-型、m-型或p-型BCR/ABL陽性對照。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括陰性對照。全文摘要本發(fā)明公開了一種定量檢測BCR/ABLmRNA水平的試劑盒。該試劑盒包括用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系和下述三種實時定量PCR體系中的至少一種M-型BCR/ABL實時定量PCR體系、m-型BCR/ABL實時定量PCR體系和μ-型BCR/ABL實時定量PCR體系。本發(fā)明的試劑盒可以準(zhǔn)確、快速、定量測定各型BCR/ABLmRNA水平，用于慢性髓性白血病及表達(dá)BCR/ABL的急性淋巴細(xì)胞性白血病的診斷及治療過程中微小殘留病的監(jiān)測，為臨床疾病的確診、治療方案的確定、療效評價及預(yù)后提供重要的分子依據(jù)。文檔編號C12Q1/68GK101624621SQ20081011660公開日2010年1月13日申請日期2008年7月11日優(yōu)先權(quán)日2008年7月11日發(fā)明者主鴻鵠,劉艷榮,李玲娣,李金蘭,秦亞溱,陳珊珊申請人:北京大學(xué)人民醫(yī)院