一種枯草芽孢桿菌基因工程菌株及其構(gòu)建方法與在生產(chǎn)乳果糖中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種利用表達(dá)纖維二糖差向異構(gòu)酶的重 組枯草芽抱桿菌生產(chǎn)乳果糖的方法。
【背景技術(shù)】 陽(yáng)00引乳果糖（4-0-β-D-化喃半乳糖基-D-果糖）又稱乳酬糖，是半乳糖和果糖W0 -1，4-糖巧鍵結(jié)合而成的二糖。純?nèi)楣菫榘咨灰?guī)則粉末，相對(duì)密度1. 35,烙點(diǎn)為 16 9 °C，易溶于水。商業(yè)化的乳果糖糖漿一般呈淡黃色略透明，甜度僅為薦糖的4 8 %~ 70%，它的熱值低、安全性高、穩(wěn)定性好，且不發(fā)生美拉德反應(yīng)。乳果糖不僅僅是一種雙歧桿 菌增殖因子，還具有促進(jìn)對(duì)礦物質(zhì)的吸附、影響骨骼、降低血液中谷氨酸、降低膽固醇、減少 尿石癥患病風(fēng)險(xiǎn)、預(yù)防或降低尿路感染等諸多生理功能，因此乳果糖在醫(yī)藥、食品和動(dòng)物飼 料領(lǐng)域都具有十分廣泛的應(yīng)用前景。
[0003] 目前，商業(yè)化的乳果糖一般通過(guò)化學(xué)法合成。其基本原理是基于還原性乳糖在堿 性條件下，熱處理過(guò)程中乳糖單元上的葡萄糖會(huì)被直接異構(gòu)化成果糖，進(jìn)而產(chǎn)生乳果糖。但 是強(qiáng)堿試劑的使用不僅帶來(lái)了副產(chǎn)物和色素的產(chǎn)生，降低了乳果糖產(chǎn)率，而且使產(chǎn)物分離 復(fù)雜繁瑣。而利用復(fù)合催化劑來(lái)生產(chǎn)乳果糖，雖然提高了產(chǎn)率，但催化劑中的棚酸難W完全 去除，帶來(lái)產(chǎn)品的安全性威脅，而且增加了成本和能耗，W上問(wèn)題制約了化學(xué)異構(gòu)法生產(chǎn)乳 果糖的發(fā)展。
[0004] 為了克服化學(xué)法帶來(lái)的問(wèn)題，一些學(xué)者提出了一種新的思路即利用微生物產(chǎn)酶來(lái) 催化乳糖生產(chǎn)乳果糖。用于生產(chǎn)乳果糖的酶有糖基水解酶和纖維二糖差向異構(gòu)酶。在糖基 水解酶家族中，已報(bào)道用β-糖巧酶和β-半乳糖巧酶轉(zhuǎn)化半乳糖基制備乳果糖，但是用糖 基水解酶生產(chǎn)乳果糖的轉(zhuǎn)化率很低（<30% )，并不適合乳果糖的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。而纖維二糖 差向異構(gòu)酶能夠直接將乳糖上的葡萄糖基異構(gòu)成果糖基從而生成乳果糖，是目前已知的酶 法合成乳果糖方法中最為有效的酶。纖維二糖差向異構(gòu)酶是一種嗜熱酶，在高溫下底物溶 解度、反應(yīng)速率都會(huì)提高，應(yīng)用纖維二糖差向異構(gòu)酶的好處在于它不需要額外添加底物果 糖，成本低廉；而且轉(zhuǎn)化率高、反應(yīng)過(guò)程不易染菌，所W未來(lái)利用它進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)乳果糖 的前景十分廣闊。目前有研究表明利用重組大腸桿菌產(chǎn)纖維二糖差向異構(gòu)酶并催化生產(chǎn)乳 果糖的轉(zhuǎn)化率較高。但是，乳果糖作為一種功能性低聚糖，在醫(yī)藥、保健、食品等領(lǐng)域有著較 廣泛的應(yīng)用，安全性至關(guān)重要。大腸桿菌本身會(huì)產(chǎn)內(nèi)毒素，帶來(lái)很大的安全隱患，不適合在 食品領(lǐng)域進(jìn)行工業(yè)化應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一株枯草芽抱桿菌基因工程菌。
[0006] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供上述枯草芽抱桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法。
[0007] 本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供上述枯草芽抱桿菌基因工程菌在制備乳果 糖中的應(yīng)用。
[000引為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] 一株枯草芽抱桿菌基因工程菌，該枯草芽抱桿菌中導(dǎo)入了纖維二糖差向異構(gòu)酶基 因。
[0010] 其中，纖維二糖差向異構(gòu)酶基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0011] 其中，所述的枯草芽抱桿菌為枯草芽抱桿菌Bacillussubtilisstr. 168或者 BacillussubtilisWB800〇
[0012] 上述枯草芽抱桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，該方法包括如下步驟：
[0013] (1)將纖維二糖差向異構(gòu)酶基因克隆到pHT-01或pHT-43質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒；
[0014] (2)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽抱桿菌，即得到重組枯草芽抱桿菌。
[0015] 具體的構(gòu)建方法如下：
[0016] (1)將纖維二糖差向異構(gòu)酶基因與經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI和Smal雙酶切的 pHT-01質(zhì)粒在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接得到重組質(zhì)粒pHT-01-CsCE;或?qū)⒗w維二糖差向 異構(gòu)酶基因與經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI和Smal雙酶切的pHT-43質(zhì)粒在T4連接酶的作用下 進(jìn)行連接得到重組質(zhì)粒抑T-43-CsCE。
[0017] (2)將重組質(zhì)粒pHT-01-CsCE(或pHT-43-CsCE)轉(zhuǎn)化至Bacillussubtilis str. 168或BacillussubtilisWB800,涂布于含100μg/ml氨節(jié)青霉素的固體培養(yǎng)基上， 37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)得到初步陽(yáng)性克?。?br>[0018] (3)經(jīng)抗性培養(yǎng)基篩選得到陽(yáng)性克??；分別挑取初步陽(yáng)性克隆于5ml含有100μg/ ml氨節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C、200rpm過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Ndel 和化〇1雙酶切，根據(jù)電泳結(jié)果判斷，含有1182bp片段的質(zhì)粒對(duì)應(yīng)的菌株即為含有纖維二糖 差向異構(gòu)酶基因的重組枯草芽抱桿菌。
[0019] 上述重組枯草芽抱桿菌在制備乳果糖中的應(yīng)用在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0020] 其中，枯草芽抱桿菌基因工程菌的培養(yǎng)方法如下：
[0021] 將活化后的重組枯草芽抱桿菌轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中，10~50°C、50~50化pm培養(yǎng) 至0D600為0. 3~1. 2時(shí)，向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑，繼續(xù)培養(yǎng)1~4她，得到重組枯草芽抱桿 菌發(fā)酵液。 陽(yáng)0巧其中，所述的誘導(dǎo)劑為乳糖或異丙基-β-D-硫代半乳糖巧，所述異丙基-β-D-硫 代半乳糖巧的濃度為0. 01~1. 所述異丙基-β-D-硫代半乳糖巧的濃度為優(yōu)選 為0. 2~1.Ommol/L，所述異丙基-β-D-硫代半乳糖巧的濃度為最優(yōu)選為0. 6mmol/L;所述 乳糖的濃度為0. 1~50g/l，所述乳糖的濃度優(yōu)選為10~30g/l，所述乳糖的濃度最優(yōu)選為 lOg/Lo
[0023] 其中，利用枯草芽抱桿菌基因工程菌催化乳糖轉(zhuǎn)化為乳果糖，其催化溫度為50~ l〇〇°C，催化溫度優(yōu)選為60~80,催化溫度最優(yōu)選為65°C。
[0024] 其中，利用枯草芽抱桿菌基因工程菌催化乳糖轉(zhuǎn)化為乳果糖，其催化時(shí)間為1~ lOOh，催化時(shí)間優(yōu)選3~24h，催化時(shí)間最優(yōu)選為24h。
[00巧]其中，利用枯草芽抱桿菌基因工程菌催化乳糖轉(zhuǎn)化為乳果糖，其反應(yīng)體系中乳糖 的濃度為10~700g/L。
[00%] 具體的重組枯草芽抱桿菌的培養(yǎng)方法如下：
[0027] 將重組枯草芽抱桿菌接種于添加了 100μg/ml氨節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C、200巧m搖床過(guò)夜；再W0. 1~5%的接種量轉(zhuǎn)接到含100μg/ml氨節(jié)青霉素的LB培 養(yǎng)基中，37°C發(fā)酵2~4小時(shí)，使ODe。。達(dá)到0. 3~1.2時(shí)，加入0.01~Immol/L的異丙 基-β-D-硫代半乳糖巧（IPTG)或0. 1~50g/L的乳糖繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)5~48小時(shí)后，離屯、 收集菌體。
[0028] 具體的催化方法如下：
[0029] W10-700g/L的乳糖為底物，加入經(jīng)上述表達(dá)方法誘導(dǎo)后的產(chǎn)纖維二糖差向異構(gòu) 酶的重組枯草芽抱桿菌B.subtilispHT-01-CsCE，菌體用量為10~lOOg/L(濕重），反應(yīng) 溫度20~100°C，反應(yīng)時(shí)間1~lOOh，其中，反應(yīng)溫度優(yōu)選為60~80。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為 3~2地。
[0030] 或者，將底物乳糖10~700g/l，直接加入經(jīng)上述表達(dá)方法誘導(dǎo)后的產(chǎn)纖維二糖差 向異構(gòu)酶的重組枯草芽抱桿菌B.subtilispHT-43-CsCE的發(fā)酵液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)溫 度20~100°C，反應(yīng)時(shí)間1~10化，其中，反應(yīng)溫度優(yōu)選為60~80°C，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為3~ 2地。
[0031] 有益效果：
[0032] (1)本發(fā)明采用食品級(jí)枯草芽抱桿菌作為生產(chǎn)菌株，安全無(wú)毒，操作簡(jiǎn)單，為重組 枯草芽抱桿菌工業(yè)化生產(chǎn)乳果糖提供了借鑒。
[003引 似直接在發(fā)酵液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，避免了酶分離純化過(guò)程中的酶活損失，有效降低成 本，提高產(chǎn)率。
[0034] (3)本發(fā)明通過(guò)生物法制備乳果糖，安全無(wú)毒，操作方便，分離純化相對(duì)簡(jiǎn)單且能 耗低，綠色環(huán)保；符合節(jié)約資源，環(huán)境友好的生產(chǎn)理念。為安全、高效的生物法生產(chǎn)乳果糖提 供了參考與借鑒。
【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1為重組質(zhì)粒pHT-01-CsCE的構(gòu)建示意圖。
[0036] 圖2為重組纖維二糖差向異構(gòu)酶SDS-PAGE電泳圖，泳道1為枯草芽抱桿菌全細(xì) 胞，泳道2為枯草芽抱桿菌破碎離屯、上清液、泳道3為枯草芽抱桿菌細(xì)胞發(fā)酵液（不含細(xì) 胞）。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 根據(jù)下述實(shí)施例，可W更好地理解本發(fā)