一種提高鼠李糖脂產(chǎn)量的基因工程方法及其專用菌株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種提高鼠李糖脂產(chǎn)量的基因工程方法及其 專用菌株。
【背景技術(shù)】
[0002] 鼠李糖脂是由假單胞菌或伯克氏菌類產(chǎn)生的一種糖脂類生物表面活性劑。根據(jù)鼠 李糖脂的化學結(jié)構(gòu)可以分為單鼠李糖脂和雙鼠李糖脂，其親水基團一般由1-2分子的鼠李 糖環(huán)構(gòu)成，疏水基團則由1-2分子具有不同碳鏈長度的飽和或不飽和脂肪酸構(gòu)成。在合成 過程中，這些基團之間可能相互連接而生成多種化學結(jié)構(gòu)相近的同系物。到目前為止已經(jīng) 鑒定了假單胞菌屬和伯克氏菌屬的60多種鼠李糖脂，最常見的由銅綠假單胞菌產(chǎn)生的鼠 李糖脂為雙糖雙脂（Rha-Rha-C10-C10)和雙糖單脂（Rha-Rha-C10)。
[0003] 鼠李糖脂作為一種生物表面活性劑，不僅溶于甲醇、氯仿和乙醚，在堿性水溶液中 也表現(xiàn)出良好的溶解特性，并兼具無毒和生物降解的特性。鼠李糖脂可以降低水表面張力， 可以作為潤濕劑、乳化劑和發(fā)泡劑使用，而且它可以在溫度、PH值及鹽度處于極端狀況下使 用。因此，鼠李糖脂應用于石油工業(yè)、綠色農(nóng)業(yè)、環(huán)境治理、醫(yī)藥、食品加工、化妝品等行業(yè)。
[0004] 目前，鼠李糖脂的生產(chǎn)菌株主要是銅綠假單胞菌，其生產(chǎn)性能的提高一般是通過 各種理化誘變技術(shù)和基因改造手段提高菌株鼠李糖脂的生產(chǎn)能力。理化誘變能夠篩選到高 產(chǎn)鼠李糖脂菌株，但是極易回復突變，造成菌株生產(chǎn)性能的不穩(wěn)定。基因改造手段能夠定向 的對菌株進行改造，但因為鼠李糖脂的合成的代謝途徑復雜，需要改造合適的基因才能提 高鼠李糖脂的產(chǎn)量。
[0005] 銅綠假單胞菌中鼠李糖脂的合成包括三個連續(xù)的反應：首先由RhlA催化形成 0-羥基脂肪酸，然后由鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶I RhlB催化和dTDP-L-鼠李糖反應生成單鼠李糖 月旨，最后由鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶II RhlC以單鼠李糖脂和dTDP-L-鼠李糖反應生成雙鼠李糖脂。 dTDP-L-鼠李糖前體為鼠李糖脂的親水部分，由D-葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖磷酸變位酶 AlgC和RmlDBAC的作用下合成。脂質(zhì)疏水部分的脂肪酸一部分來自于脂肪酸降解氧化 途徑的中間產(chǎn)物，另一部分則由類型II的脂肪酸合成酶（FAS II)催化從新合成的。
[0006] 目前，對于酶PA3286 (由pa3286基因編碼）的研宄大多是認為與脂肪酸代謝途徑 有關(guān)，但pa3286對于鼠李糖脂產(chǎn)量的影響并未有相關(guān)文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種提高鼠李糖脂產(chǎn)量的基因工程方法，并提 供利用所述方法制備的鼠李糖脂生產(chǎn)菌。
[0008] 本發(fā)明通過在鼠李糖脂生產(chǎn)菌中對pa3286基因的過表達實現(xiàn)的。pa3286基因，并 不參與鼠李糖脂的生物合成途徑，但是當在載體上克隆該基因并在細菌中表達時，可以提 高所述細菌中鼠李糖脂產(chǎn)量，此外以其他形式，如在染色體上過表達所述基因或者調(diào)控所 述基因的表達調(diào)控序列也可以使所述細菌中鼠李糖脂產(chǎn)量明顯提高。
[0009] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：
[0010] -種提高鼠李糖脂產(chǎn)量的基因工程方法，包括以下步驟：
[0011] 1)構(gòu)建pa3286基因編碼的蛋白表達量增加的鼠李糖脂生產(chǎn)菌，所述pa3286基因 具有如SEQ ID NO :1中35-1087所示的核酸序列；
[0012] 2)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟1)構(gòu)建的鼠李糖脂生產(chǎn)菌；
[0013] 3)提取步驟2)培養(yǎng)基中的鼠李糖脂，并檢測鼠李糖脂的產(chǎn)量。
[0014] 本發(fā)明所述的蛋白表達量增加指蛋白濃度的增加和/或蛋白活性增加。
[0015] 所述pa3286基因具有如SEQ ID NO :1所示的核酸序列或者含有對序列表SEQ ID NO: 1中核酸序列缺失、替換、插入或添加一個或多個堿基后所得到的序列，所述得到的核酸 序列與原序列相比仍然具有同樣的功能或者活性增加。
[0016] 所述pa3286基因編碼的蛋白具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或者含有對 序列表SEQ ID NO:2中氨基酸序列缺失、替換、插入或添加一個或多個氨基酸后所得到的氨 基酸序列，所述得到的序列與原序列仍然具有同樣的功能或者活性增加。
[0017] 所述構(gòu)建pa3286基因編碼的蛋白表達量增加的鼠李糖脂生產(chǎn)菌的方法，可以將 上述pa3286基因克隆到多拷貝載體上再轉(zhuǎn)入鼠李糖脂生產(chǎn)菌中，也可以將pa3286基因整 合到染色體上，或者對pa3286基因的表達調(diào)控序列進行改造使其蛋白表達量增加。
[0018] 所述鼠李糖脂生產(chǎn)菌只需要能夠產(chǎn)生鼠李糖脂或者具備產(chǎn)生鼠李糖脂的潛力即 可，對于菌株的所屬株系也并無特別限定，可以為銅綠假單胞菌；對于所述鼠李糖脂生產(chǎn)菌 的來源可以是野生株系也可以通過人工或自然突變或改造獲得的菌株。
[0019] 進一步，步驟1)中，構(gòu)建pa3286基因編碼的蛋白表達量增加的鼠李糖脂生產(chǎn)菌的 方法為：
[0020] 1)克隆 pa3286 基因；
[0021] 2)構(gòu)建表達pa3286基因的重組質(zhì)粒；
[0022] 3)將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到鼠李糖脂生產(chǎn)菌中，獲得重組菌。
[0023] 在構(gòu)建含有pa3286基因的重組質(zhì)粒時，對于選擇的載體并無特殊限制，使pa3286 基因能夠表達即可。對于選擇載體的個數(shù)也并無限制?？梢允筽a3286基因處于一個載體 上，也可以使pa3286基因處于不同的載體上。
[0024] 進一步，在培養(yǎng)已經(jīng)構(gòu)建的pa3286基因編碼的蛋白表達量增加的鼠李糖脂生產(chǎn) 菌，所述培養(yǎng)基中添加10_80g/L油脂。
[0025] 本發(fā)明還提供一種利用上述方法制備的鼠李糖脂生產(chǎn)菌。
[0026] 本發(fā)明的有益效果是：
[0027] 本發(fā)明提供了一種提高鼠李糖脂的方法及應用這種方法制備的鼠李糖脂的生產(chǎn) 菌。目前，對于利用銅綠假單胞菌生產(chǎn)鼠李糖脂的研宄中，大多從鼠李糖脂代謝途徑著手 進行基因工程改造，關(guān)于其他代謝途徑對于鼠李糖脂產(chǎn)量的影響并不清楚。本發(fā)明通過在 銅綠假單胞菌中過表達pa3286基因，構(gòu)建了重組菌，并選擇合適的培養(yǎng)基以及發(fā)酵培養(yǎng)條 件，所述重組銅綠假單胞菌與作為出發(fā)菌株的銅綠假單胞菌相比，鼠李糖脂的合成能力顯 著提高，，提高了 50-65% ;所述表達pa3286基因重組銅綠假單胞菌與表達其他基因重組的 銅綠假單胞菌相比鼠李糖脂的合成能力顯著提高?？赡苁怯捎趬驍r截脂肪酸降解途徑中的 C8-CoA與丙二酸單酰ACP縮合成脂肪酸合成的中間產(chǎn)物0 -酮癸脂酰ACP，這一關(guān)鍵的中 間產(chǎn)物能夠延伸供給細胞所需的脂肪酸，包括不飽和和飽和脂肪酸，以及脂多糖中