一種提高天然脫落酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提高天然脫落酸發(fā)酵產(chǎn)量的新方法。
【背景技術(shù)】
[0002]脫落酸是植物五大天然生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑之一。它在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起多方面的作用，在農(nóng)業(yè)上有廣闊的應(yīng)用前景，可以提高植物的抗旱和耐鹽力，對(duì)開(kāi)發(fā)利用低產(chǎn)田以及植樹(shù)造林、綠化沙漠等有極高的價(jià)值；脫落酸還是抑制種子萌發(fā)的有效抑制劑，因此可以用于種子貯藏，保證種子、果實(shí)的貯藏質(zhì)量；此外，脫落酸還能引起葉片氣孔的迅速關(guān)閉，可用于花的保鮮，調(diào)節(jié)花期，促進(jìn)生根等，在花卉園藝上有較大的應(yīng)用價(jià)值。然而由于植物體中脫落酸含量極低，從中提取不可行；人工合成的外消旋型脫落酸是天然型和非天然型脫落酸的混合物，需拆分，不僅價(jià)格昂貴，而且生理活性低，極大地限制了它的研究應(yīng)用。
[0003]為了解決和滿足脫落酸應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要，近年來(lái)，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)脫落酸受到關(guān)注，目前微生物發(fā)酵所用菌種以灰葡萄孢霉菌居多，例如，1982年，日本MarumoS等找到一種脫落酸產(chǎn)生菌-灰葡萄孢，該菌發(fā)酵7天可以積累52Pg/g的脫落酸；1993年，吳少伯等報(bào)道用灰葡萄孢固體發(fā)酵方法產(chǎn)生脫落酸產(chǎn)量?jī)H為29ng/mL ;1995年，莫才清等報(bào)道從土壤中篩選出產(chǎn)脫落酸的真菌-灰葡萄孢霉菌，產(chǎn)量為18Pg/mL。為了提高灰葡萄孢霉菌發(fā)酵生產(chǎn)脫落酸的產(chǎn)量，人們對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝進(jìn)行了不同方面的優(yōu)化及改進(jìn)。例如，2007年，張卉等利用正交試驗(yàn)對(duì)脫落酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定出了使脫落酸產(chǎn)量提高的最佳組合，但其產(chǎn)量提升的幅度不是最高；2002年，鄭珩等報(bào)道在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)玉米粉、前體物質(zhì)檸檬酸三鈉以及改變葡萄糖與蔗糖的比例等可以提高灰葡萄孢霉菌發(fā)酵產(chǎn)脫落酸的產(chǎn)量，但所加入前體物質(zhì)的濃度較高，使用量大，造成資源的浪費(fèi)；公開(kāi)號(hào)為CN101041837B的專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種在發(fā)酵過(guò)程中流加肌醇解除葡萄糖阻遏的工藝來(lái)制備天然脫落酸的方法，可使脫落酸的產(chǎn)量提高；公開(kāi)號(hào)為CN1067724C的專利通過(guò)改造現(xiàn)有脫落酸產(chǎn)生菌，改變培養(yǎng)基配方，改液體批次發(fā)酵工藝為連續(xù)流加補(bǔ)料出料，添加關(guān)鍵底物的方法來(lái)提高脫落酸的產(chǎn)量；公開(kāi)號(hào)為CN102399827B的專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種在發(fā)酵過(guò)程中流加乙酰輔酶A作為菌株合成脫落酸的前體物質(zhì)，同時(shí)，添加生物表面活性劑吐溫-20改善發(fā)酵液的溶氧狀況來(lái)制備天然脫落酸的方法來(lái)提高脫落酸的產(chǎn)量，但肌醇和乙酰輔酶A價(jià)格相對(duì)昂貴，不利于節(jié)約成本。公開(kāi)號(hào)為CN103409474A的專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種真菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脫落酸的方法，與液體發(fā)酵相比，脫落酸產(chǎn)量明顯提高。雖然以上現(xiàn)有技術(shù)在一定程度上提高了脫落酸的發(fā)酵產(chǎn)量，但發(fā)酵工藝繁瑣，發(fā)酵產(chǎn)生的副產(chǎn)物較多，對(duì)氧的利用不充分；另外，添加的促進(jìn)物質(zhì)成本較高，不利于企業(yè)的后續(xù)推廣；同時(shí)，脫落酸固態(tài)發(fā)酵操作復(fù)雜，不適于企業(yè)大規(guī)模的生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種提高天然脫落酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，可以使菌株以較高的產(chǎn)物合成速率生產(chǎn)脫落酸，利于后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是菌體對(duì)氧的利用不充分，添加的發(fā)酵促進(jìn)劑成本較尚，發(fā)酵液易粘桐。
[0006]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
提供一種提高天然脫落酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，包括以下步驟:首先將能夠產(chǎn)生脫落酸的灰葡萄孢霉菌接種在土豆葡萄糖瓊脂(PDA)固體平板上活化培養(yǎng)4-5天，培養(yǎng)溫度為25-28°C，然后將在平板上活化好的灰葡萄孢霉菌在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)48-72h，將種子液以5% ~10%的接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)9~10天產(chǎn)生脫落酸；所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基需要添加植物浸提液、丁二酸鈉、鉬酸銨中的一種或者兩種以上組合。
[0007]本發(fā)明所述的提供一種提高天然脫落酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加植物浸提液、丁二酸鈉、鉬酸銨的一種或者兩種以上組合。從而提高真菌發(fā)酵產(chǎn)天然脫落酸的產(chǎn)量。本發(fā)明中所用真菌為產(chǎn)天然脫落酸的灰葡萄孢霉菌，是我們從西紅柿病果上分離篩選而得。
[0008]本發(fā)明所述的提供一種提高天然脫落酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于，所用液體種子培養(yǎng)基的成分及含量如下，葡萄糖20g/L，MgS04.7H20 0.2g/L，KC1 0.5g/L，KH2P04
0.8g/L，維生素 B1 lmg/L,谷氨酸單鈉鹽 3.0g/L, FeS04.7H20 0.5mg/L，ZnS04.7H20 2.5mg/L，CuS04.7H20 4mg/L，用蒸餾水補(bǔ)足 1L。
[0009]本發(fā)明所述的提供一種提高天然脫落酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于，所用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基為ro液體培養(yǎng)基或?qū)Ｓ靡后w發(fā)酵培養(yǎng)基；ro液體培養(yǎng)基的成分及比例如下，葡萄糖20g/L，土豆200g，洗凈去皮，切塊蒸煮后取其濾液，用蒸餾水補(bǔ)足1L ;專用液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及含量如下，葡萄糖 20g/L，MgS04.7H20 0.2g/L，KC1 0.5g/L，CaC03 5g/L，KH2P04 0.8g/L，維生素 B1 lmg/L,谷氨酸單鈉鹽 3.0g/L, FeS04.7H20 0.5mg/L，ZnS04.7H20
2.5mg/L，CuS04.7H20 4mg/L，玉米粉 4g/L，用蒸饋水補(bǔ)足 1L。
[0010]本發(fā)明所述的提供一種提高天然脫落酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于，所用植物浸提液為辣椒葉，番茄葉的浸提液，浸提時(shí)采用0.1M的磷酸鹽緩沖液與粉碎的植物葉片組織按照重量比1: (0.02-0.2)在4°C下浸提12-24h，浸提后離心取其上清液作為浸提液，植物浸提液用孔徑為0.22-0.45Mffl的膜過(guò)濾器過(guò)濾后加入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中。
[0011 ] 液體發(fā)酵培養(yǎng)基中植物浸提液的加入量為2mL-10mL/L。
[0012]本發(fā)明所述的提供一種提高天然脫落酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于，所用液體發(fā)酵培養(yǎng)基中丁二酸鈉的濃度為l_15mM/L。
[0013]本發(fā)明所述的提供一種提高天然脫落酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于，所用液體發(fā)酵培養(yǎng)基中鉬酸銨的濃度為0.05-5mM/Lo
[0014]本發(fā)明所述的提供一種提高天然脫落酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于，所用液體發(fā)酵培養(yǎng)基中丁二酸鈉和鉬酸銨的質(zhì)量比為1: (0.2-12)。
[0015]本發(fā)明所述的提供一種提高天然脫落酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，對(duì)灰葡萄孢霉菌發(fā)酵生產(chǎn)天然脫落酸具有明顯的促進(jìn)作用，所添加的物質(zhì)無(wú)毒，對(duì)環(huán)境無(wú)污染。其中，植物浸提液中的有效成分可以加速灰葡萄孢霉菌的生長(zhǎng)，提高對(duì)氧的利用率，使菌株以較高的產(chǎn)物合成速率生產(chǎn)脫落酸；丁二酸鈉作為前提物質(zhì)，對(duì)灰葡萄孢霉菌發(fā)酵產(chǎn)天然脫落酸的產(chǎn)量有明顯的提升作用；鉬酸銨可以使發(fā)酵環(huán)境穩(wěn)定，使發(fā)酵液粘度降低，促進(jìn)脫落酸的合成；同時(shí)，本發(fā)酵工藝所添加物質(zhì)來(lái)源廣泛，成本較低，工藝簡(jiǎn)單，利于后續(xù)工業(yè)的生產(chǎn)應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下列實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0017]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0018]下述實(shí)施例中所使用的菌種為灰葡萄孢霉菌，均為我們從西紅柿病果上分離純化而來(lái)。
[0019]實(shí)施例1
首先將保存的菌種在PDA平板上活化培養(yǎng)，將配制好的PDA培養(yǎng)基在121°C高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌30分鐘后倒平板備用。然后將菌種在超凈工作臺(tái)中接種到固體平板上，在26-28°C下活化培養(yǎng)4-5天。將活化好的菌體用無(wú)菌接種環(huán)挑取到液體種子培養(yǎng)基中，打散搖勻，在28°C下?lián)u瓶培養(yǎng)72h左右。
[0020]將種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的菌種以5 %的接種量接入裝有液體培養(yǎng)基的搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，PD液體培養(yǎng)基的成分及含量為:葡萄糖20g/L，土豆200g，洗凈去皮后切成丁狀，放入鍋內(nèi)在電磁爐上煮沸，定時(shí)30分鐘，然后用四層紗布將煮好的土豆進(jìn)行過(guò)濾，將其濾液用蒸餾水稀釋到1L ;將辣椒葉片充分粉碎，按照0.1M的磷酸鹽緩沖液與粉碎的辣椒葉片組織的重量比1:0.2浸提，浸提溫度4°C，浸提時(shí)間為24h，離心后將其上清液用孔徑為
0.45Pffl的膜過(guò)濾器過(guò)濾后備用；然后將配制好的ro液體培養(yǎng)基滅菌后分為兩組，一組按10mL/L的用量加入辣椒葉浸提液，另一組不加辣椒葉浸提液作為對(duì)照；在28°C下以150轉(zhuǎn)/分振蕩發(fā)酵培養(yǎng)9天。
[0021 ] 通過(guò)高效液相色譜測(cè)得對(duì)照組脫落酸產(chǎn)量為4.65mg/L，加辣椒葉浸提液組脫落酸產(chǎn)量為29.8lmg/L,比對(duì)照組提高了 541.08%。
[0022]實(shí)施例2
菌種活化及種子培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。將活化好的菌種以10%的接種量接入裝有專用液體發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，