一種提高轉(zhuǎn)基因雞孵化率的方法及使用的蛋殼開口器的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高轉(zhuǎn)基因雞孵化率的方法，同時還涉及該方法使用的蛋殼開口 器，屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和 細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。雞 具有世代周期短、低成本、繁殖力高、卵中天然存在著蛋白酶抑制劑和良好的無菌環(huán)境，表 達(dá)的重組蛋白易提純、效益高等優(yōu)點(diǎn)，因此轉(zhuǎn)基因雞的研究是目前科學(xué)研究的熱點(diǎn)和生物 制藥領(lǐng)域的新興產(chǎn)業(yè)之一。胚盤顯微注射法是制備轉(zhuǎn)基因雞的常用手段，其中雞蛋開窗法 是雞胚盤顯微注射法的的關(guān)鍵技術(shù)之一，它在很大程度上決定了轉(zhuǎn)基因雞的孵化率。胚盤 顯微注射法必須在種蛋上打開一個小窗，這就無可避免的破外了雞蛋外殼的正常結(jié)構(gòu)，改 變了蛋殼內(nèi)外的壓力平衡和雞胚發(fā)育的內(nèi)環(huán)境，從而造成雞胚的非正常死亡。同時，開窗處 理使蛋殼受損，極易造成雞胚受到污染，大大降低了孵化率。因此，研發(fā)出一種行之有效的 提高轉(zhuǎn)基因雞孵化率的方法具有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種提高轉(zhuǎn)基因雞孵化率的方法及使用的蛋 殼開口器，能夠有效提高轉(zhuǎn)基因雞的孵化率。
[0004]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供一種提高轉(zhuǎn)基因雞孵化率的 方法，包括以下步驟：
[0005] (1)孵化器的消毒及種蛋的預(yù)孵化處理
[0006] 對孵化器進(jìn)行消毒，種蛋進(jìn)行預(yù)孵化處理，放入孵化箱內(nèi)開始孵化；l-18d的孵化 溫度為37. 8°C，濕度為60%，19-21d的孵化溫度為37°C，濕度為78% ;
[0007] (2)種蛋的開口
[0008] 開口前將蛋殼開口器和無菌操作臺進(jìn)行消毒，將孵化12-24h的種蛋從孵化箱內(nèi) 取出，在種蛋的赤道位置先用碘酊后用75%酒精擦拭消毒，用砂輪在蛋殼赤道面處研磨，一 邊研磨一邊用酒精棉球擦拭蛋殼碎末，直至蛋殼赤道面上出現(xiàn)開口，觀察雞胚孵育情況；
[0009] (3)外源基因的注射
[0010] 將開口后的雞蛋，開口向上，放在操作臺內(nèi)靜置2min，使雞胚盤的位置漂浮在雞蛋 的開口處，將含有外源基因的轉(zhuǎn)染液注射入雞的胚盤中，用抗生素對開口處進(jìn)行殺菌；
[0011] ⑷種蛋的封口
[0012] 種蛋的封口采用蛋清+蛋殼膜封口的方法，封口后放入孵化箱繼續(xù)孵化；其中蛋 清+蛋殼膜封口的方法為：將蛋殼膜在蛋清中潤洗，然后在開口處覆蓋第一層蛋殼膜，再在 第一層蛋殼膜上交叉覆蓋第二層蛋殼膜。
[0013] 優(yōu)選的，第一層蛋殼膜和第二層蛋殼膜呈十字形交叉覆蓋。
[0014] 步驟⑴中孵化器的消毒方法為：將孵化器進(jìn)行清洗，關(guān)閉進(jìn)出氣孔和風(fēng)機(jī)，按照 每立方米空間高錳酸鉀l〇g，福爾馬林15mL的比例依次加入高錳酸鉀和福爾馬林，混合，當(dāng) 混合溶液冒煙時，關(guān)閉孵化器門，消毒lh，消毒溫度為15-20°C，濕度彡75%;
[0015] 步驟⑴中種蛋的預(yù)孵化方法為：將新潔爾滅和水按照質(zhì)量比1:1000的比例配制 成新潔爾滅溶液，其中水溫為30°C，將種蛋浸入新潔爾滅溶液中5min，洗凈，取出，用脫脂 棉擦拭干凈。
[0016] 步驟（3)中抗生素的制備方法：將青鏈霉素加入生理鹽水中，使其終濃度為 〇· 1μg/μL〇
[0017] 所述外源基因為表達(dá)載體pEGFP-Nl-p53/MAR，是將人抑癌基因p53和雞的核基質(zhì) 附著區(qū)MAR基因插入表達(dá)載體中構(gòu)建而成，包括如SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列。
[0018] 所述表達(dá)載體pEGFP-Nl_p53/MAR的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0019] (1)抽取癌癥病人的外周血液，提取外周血液總RNA，設(shè)計上下游引物Primera、 Primerb，RT-PCR擴(kuò)增人抑癌基因p53,瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物并純化回收；
[0020] RT-PCR反應(yīng)體系為：2XPCR Buffer 22 yL，上下游引物各1. 5 yL，RT/Taq Master Mix 2 μL，總RNA模板 3μL ;
[0021] RT-PCR反應(yīng)條件為：①cDNA合成和預(yù)變性：40°C、30min，94°C、2min;②PCR擴(kuò)增 共40個循環(huán)：94°C預(yù)變性30s、前5個循環(huán)65°C退火30s，后35個循環(huán)68°C退火30s、72°C 延伸90s;③72°C充分延伸lOmin，反應(yīng)結(jié)束；
[0022] (2)將質(zhì)粒PMD18-T與人抑癌基因p53 16 °C連接過夜，得到連接產(chǎn)物 pMD18-T-p53 ;將連接產(chǎn)物pMD18-T-p53轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)，根據(jù)上下游引物Primera、 Primerb，挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測，篩選出陽性菌落，提取連接產(chǎn)物pMD18-T-p53,再進(jìn)行 酶切鑒定和測序鑒定，鑒定正確的為重組質(zhì)粒pMD18-T-p53 ;
[0023] 所述連接的反應(yīng)體系為：人抑癌基因p53 8 μL、質(zhì)粒pMD18_T 2 μL、solution I 10 yL；
[0024] (3)提取雞肝臟組織中的DNA，設(shè)計上下游引物Primerc、Primerd，PCR擴(kuò)增雞 MAR基因，瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物并純化回收；
[0025]所述PCR的反應(yīng)體系為：10X PCR Buffer 3 μL、dNTP Mixture 2 μL、總DNA模板 1.5 μL、上下游引物各1μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL，加滅菌去離子水補(bǔ)充至總體積20μL ;
[0026] 所述PCR的反應(yīng)條件為：①預(yù)變性：94°C、4min;②PCR擴(kuò)增共40個循環(huán)，前5個 循環(huán)：94°C預(yù)變性30s、54°C退火40s、72°C延伸90s;中間五個：94°C預(yù)變性30s、56°C退火 4〇8、72°(：延伸9〇8;最后3()個循環(huán)：94°(：預(yù)變性3〇8、60°(：退火4〇8、72°(：延伸9〇8 ;@721€ 充分延伸l〇min，反應(yīng)結(jié)束；
[0027] (4)將重組質(zhì)粒pMD18-T-p53和載體pEGFP-Nl分別用HindIII和BamHI限制 性內(nèi)切酶雙酶切，純化回收人抑癌基因P53和載體pEGFP-Nl酶切產(chǎn)物，20°C連接5h，得 到連接產(chǎn)物pEGEP-Nl-p53;將連接產(chǎn)物pEGEP-Nl-p53轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)，根據(jù)上下 游引物Primera、Primerb，挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測，篩選出陽性菌落，提取連接產(chǎn)物 pEGEP-Nl-p53,再進(jìn)行酶切鑒定和測序鑒定，鑒定正確的為重組質(zhì)粒pEGEP-Nl-p53;
[0028]所述雙酶切的反應(yīng)體系為：重組質(zhì)粒pMD18-T-p53或載體pEGFP-Nl20μL、 Buffer Κ5μL、滅菌去離子水 51μL、Hind III和BamH I各 2μL;30°C酶切 4h;
[0029] 所述連接的反應(yīng)體系為：人抑癌基因p53 5μL、載體pEGFP-Nl酶切產(chǎn)物1μL、T4 連接酶lyL、10XT4DNALigaseBuffer2.5yL，補(bǔ)加滅菌去離子水至總體積為20yL;
[0030] (5)將重組質(zhì)粒pEGEP-Nl-p53與MAR基因分別Xbal和Notl限制性內(nèi)切酶雙酶 切，純化回收后25°C連接3h，得到連接產(chǎn)物pEGEP-Nl-p53/MAR;將連接產(chǎn)物pEGEP-Nl-p53/ MAR轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)，根據(jù)引物Primera、Primerb、Primerc、Primerd，挑取單菌落 進(jìn)行PCR檢測人抑癌基因p53和MAR基因，篩選出陽性菌落，提取連接產(chǎn)物pEGEP-Nl-p53/ MAR，進(jìn)行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序，酶切檢測及測序正確的即 為表達(dá)載體pEGFP-Nl-p53/MAR;
[0031] 雙酶切的反應(yīng)體系為：重組質(zhì)粒pEGEP_Nl_p53 3μL、BufferO1μL、滅菌去離子 水 13μL、Xbal和Notl各L5μL;30°C反應(yīng) 4h;
[0032] 所述連接的體系為：MAR基因3yL、重組質(zhì)粒pEGEP-Nl-p53 2yL、T4連接酶 0.5yL、10XT4DNALigaseBuffer3yL;加滅菌去離子水至總體積 20yL。
[0033] 所述上下游引物Primera、Primerb為：
[0034]Primera:5'-CCCAAGCTTATGGAGGAGCCGCAGTC-3'
[0035]Primerb:5'-CGCGGATCCCAGTCTGAATCAGGCCCT-3'
[0036] 所述上下游引物Primerc、Primerd為：
[0037]Primerc:5'-TTTAGCGGCCGCCACTGTAGCCCTTA-3'
[0038]Primerd:5'-CATCTTCTAGAGCTGGAAATGGCAAAC-3' 〇
[0039]步驟（2)、（4)、（5)中的PCR檢測的反應(yīng)體系為：10XPCRBuffer3yL、dNTP Mixture2yL、菌落菌液1. 5yL、上下游引物各1yL、TaqDNA聚合酶0. 5yL，加滅菌去離子 水補(bǔ)充至總體積20μL;
[0040]步驟⑵、⑷和（5)中人抑癌基因p53的PCR檢測的反應(yīng)條件為：①94°C預(yù)變性 5min;②PCR擴(kuò)增共40個循環(huán)：94°C預(yù)變性30s、60°C退火30s、72°C延伸90s;③72°C充分 延伸lOmin;
[0041] 步驟（5)中MAR基因PCR檢測的反應(yīng)條件為：①94°C預(yù)變性5min;②PCR擴(kuò)增共 40個循環(huán)：94°C預(yù)變性30s、54°C退火30s、72°C延伸90s;③72°C充分延伸lOmin。
[0042] 步驟（2)、（5)中的酶切鑒定的反應(yīng)體系為：連接產(chǎn)物6μL、10XBufferK3μL、 滅菌去離子水8μL、HindIII和BamHI各1. 5μL，30°C反應(yīng)4h;
[0043] 步驟（4)中的酶切鑒定的反應(yīng)體系為：連接產(chǎn)物8yL、10XBufferK5yL、滅菌 去離子水 15μL、HindIII2μL，30°C反應(yīng) 4h。
[0044] 步驟（5)中酶切后的重組質(zhì)粒pEGEP-Nl-p53與MAR基因的純化回收方法為：
[0045] (1)取 15μL重組質(zhì)粒pEGFP-Nl-p53 的溶液，加入 3μL4mol/L的NaAc和 55μL 無水乙醇分析純沉淀DNA;
[0046] 取MAR基因的PCR產(chǎn)物30μL，加入6μL4mol/L的NaAc和110μL的無水乙醇分 析純沉淀DNA;
[0047] (2) 10000r/min離心5min，棄上清，在重組質(zhì)粒pEGFP_Nl_p53和MAR基因中分別 加入100μL和150μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)75 %的乙醇沖洗一次；
[0048] (3)重復(fù)步驟⑵一次；
[0049] (4) 10000r/min離心 5min，棄上清，室溫下干燥 5-10min;
[0050] (5)向重組質(zhì)粒pEGFP-Nl-p53和MAR基因的離心管中分別加入10yL和20yL的 滅菌