專利名稱：：一種獲得轉(zhuǎn)基因雞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：現(xiàn)在較常見的制備轉(zhuǎn)基因雞的方法主要為反轉(zhuǎn)錄病毒感染法、原始生殖細(xì)胞(PGCs)轉(zhuǎn)染法、胚盤顯微注射法、精子介導(dǎo)法。但是這些方法都存在各自的不足之處。(1)反轉(zhuǎn)錄病毒感染法由于部分病毒載體具有致瘤和引起病毒血癥的致病性危險(xiǎn)，外源DNA在各組織中分布不均勻，不易整合至生殖細(xì)胞，而且整合往往在多位點(diǎn)發(fā)生，故其后代會(huì)出現(xiàn)遺傳變異。(2)原始生殖細(xì)胞(PGCs)轉(zhuǎn)染法可獲得的PGCs細(xì)胞數(shù)量少，培養(yǎng)條件還不成熟，PGCs轉(zhuǎn)基因操作比較困難，限制了該技術(shù)的發(fā)展。(3)胚盤顯微注射法該法需要特殊的儀器設(shè)備，而且操作時(shí)難度較大，在進(jìn)行顯微注射時(shí)對(duì)雞胚盤造成損傷，破壞了蛋的結(jié)構(gòu)，因此在孵化過程中出現(xiàn)大量雞胚死亡。(4)精子介導(dǎo)法精子介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移法操作簡(jiǎn)單、易行，對(duì)卵原核無損傷，符合生理受精過程，易于大量制備，但是精子已經(jīng)分化，只能代表單個(gè)雄性個(gè)體某一階段的遺傳信息。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是發(fā)明一種遺傳信息全面、不會(huì)出現(xiàn)變異、不造成胚盤損傷、易于操作的獲得轉(zhuǎn)基因雞的方法。本發(fā)明用外源基因pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞，然后，在體內(nèi)繼續(xù)分化，得到攜帶有外源基因的精子。利用這些攜帶有外源基因的精子，可獲得大量轉(zhuǎn)基因后代，應(yīng)用于雞的生產(chǎn)性能的改良，種質(zhì)資源的保存，進(jìn)行抗病育種，建立疾病模型，基因治療和發(fā)育調(diào)控，制造生物反應(yīng)器，生產(chǎn)各種稀有的用其他方法不易得到的有生物活性的各種醫(yī)用蛋白。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明避免了反轉(zhuǎn)錄病毒感染法對(duì)機(jī)體造成致命的危險(xiǎn)，是一種比較安全的方法；2、本發(fā)明無需特殊的儀器要求，只需要進(jìn)行一般的外科手術(shù)，即可完成轉(zhuǎn)染外源基因的過程，簡(jiǎn)便易行；3、轉(zhuǎn)染后的精子可直接用于人工受精，產(chǎn)生受精卵，即可孵化，不需要破壞蛋的結(jié)構(gòu)，從而大大提高了存活率和出雛率，可獲得大量的轉(zhuǎn)基因后代；4、因?yàn)榫杉?xì)胞能代表該雄性個(gè)體在整個(gè)生精過程的遺傳信息，所以在轉(zhuǎn)基因后代中可獲得比較完全的遺傳素材。本發(fā)明所采用的方法同樣適用于其他禽類及哺乳動(dòng)物，可簡(jiǎn)化或取代一些較為繁瑣的轉(zhuǎn)基因操作。本發(fā)明包括以下具體步驟1)制備pEGFP-N1質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，50μg/ml卡那霉素篩選陽(yáng)性菌落，LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，按堿裂解法提取質(zhì)粒，取1μl質(zhì)粒溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，定量，計(jì)算提取液中質(zhì)粒的濃度及總含量，并用試劑盒進(jìn)行純化，沉淀用70％酒精洗滌后烘干，以無菌雙蒸水溶解后，終濃度為1mg/ml，再用ApalI限制性內(nèi)切酶37℃進(jìn)行單酶切，電泳回收純化大小為4700bp的pEGFP-N1質(zhì)粒DNA片段；2)睪丸內(nèi)注射pEGFP-N1質(zhì)粒DNA片段取50μg、100μg、150μg、200μg質(zhì)粒DNA，制備陽(yáng)離子質(zhì)粒/聚合物，室溫孵育15～20min；然后在19周齡公雞的雙側(cè)睪丸注射50～200μg質(zhì)粒DNA，縫合傷口，消炎處理。圖1為轉(zhuǎn)染后曲精細(xì)管圖片。圖2為轉(zhuǎn)染后睪丸細(xì)胞圖片。圖3為轉(zhuǎn)染后精子圖片。圖4為PCR產(chǎn)物瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果圖片。具體實(shí)施例方式步驟1、pEGFP-N1質(zhì)粒制備pEGFP-N1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，卡那霉素(50μg/ml)篩選陽(yáng)性菌落，LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，按照標(biāo)準(zhǔn)堿裂解法提取質(zhì)粒，取1μl質(zhì)粒溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，定量，計(jì)算提取液中質(zhì)粒的濃度及總含量，并用試劑盒進(jìn)行純化，沉淀用70％酒精洗滌后烘干，以無菌雙蒸水溶解，終濃度為1mg/ml。用ApalI限制性內(nèi)切酶37℃進(jìn)行單酶切，電泳回收純化大小為4700bp的片段。步驟2、睪丸內(nèi)注射質(zhì)粒DNA取50μg、100μg、150μg、200μg質(zhì)粒DNA，按照梭華-sofastTM說明書(vivo)制備陽(yáng)離子質(zhì)粒/聚合物，室溫孵育15～20min。選擇健康19周齡青年公雞，以速眠新按1ml/Kg體重劑量麻醉，在右側(cè)肋骨下兩指處切開2～3cm的切口，以注射器隨機(jī)打點(diǎn)注射入雙側(cè)睪丸，每個(gè)睪丸選5個(gè)注射點(diǎn)，縫合傷口。注射蘇醒靈，破傷風(fēng)疫苗及青、鏈霉素。步驟3、檢測(cè)精子中pEGFP-N1的表達(dá)于術(shù)后48hr取注射轉(zhuǎn)染液的睪丸，剝?nèi)グ啄?，在PBS中洗滌4～5次，經(jīng)二酶三步法消化取細(xì)胞及組織進(jìn)行涂片，結(jié)果見圖1，圖2。于術(shù)后20d開始采集精液，制成細(xì)胞涂片，于熒光顯微鏡下觀測(cè)是否有綠熒光表達(dá)，并計(jì)算表達(dá)率。提取精子DNA，進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)及PCR檢測(cè)。(1)各個(gè)時(shí)期精子中綠色熒光蛋白的表達(dá)率見表1表1術(shù)后不同時(shí)期精子中pEGFP-N1表達(dá)率table.5Transfectionrateofspermsatdifferenttimeafteroperation(2)轉(zhuǎn)染后曲精細(xì)管、睪丸細(xì)胞及精子涂片分別見圖1、圖2、圖3(3)PCR產(chǎn)物瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果見圖4圖4中，3為DL2000Marker；1、2、5為精子中DNA的PCR產(chǎn)物電泳條帶，4為質(zhì)粒PCR產(chǎn)物。權(quán)利要求1.一種獲得轉(zhuǎn)基因雞的方法，其特征在于用外源基因pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞，然后，在體內(nèi)繼續(xù)分化，得到攜帶有外源基因的精子。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述獲得轉(zhuǎn)基因雞的方法，其特征在于其步驟包括1)制備pEGFP-N1質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，50μg/ml卡那霉素篩選陽(yáng)性菌落，LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，按堿裂解法提取質(zhì)粒，取1μl質(zhì)粒溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，定量，計(jì)算提取液中質(zhì)粒的濃度及總含量，并用試劑盒進(jìn)行純化，沉淀用70％酒精洗滌后烘干，以無菌雙蒸水溶解后，終濃度為1mg/ml，再用ApalI限制性內(nèi)切酶37℃進(jìn)行單酶切，電泳回收純化大小為4700bp的pEGFP-N1質(zhì)粒DNA片段；2)睪丸內(nèi)注射pEGFP-N1質(zhì)粒DNA片段取50μg、100μg、150μg、200μg質(zhì)粒DNA，制備質(zhì)粒/陽(yáng)離子聚合物，室溫孵育15～20min；然后在19周齡公雞的雙側(cè)睪丸注射50～200μg質(zhì)粒DNA，縫合傷口，消炎處理。全文摘要一種獲得轉(zhuǎn)基因雞的方法，涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明用外源基因pEGFP－N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞，然后，在體內(nèi)繼續(xù)分化，得到攜帶有外源基因的精子。利用這些攜帶有外源基因的精子，可獲得大量轉(zhuǎn)基因后代，應(yīng)用于雞的生產(chǎn)性能的改良，種質(zhì)資源的保存，進(jìn)行抗病育種，建立疾病模型，基因治療和發(fā)育調(diào)控，制造生物反應(yīng)器，生產(chǎn)各種稀有的用其他方法不易得到的有生物活性的各種醫(yī)用蛋白。文檔編號(hào)A01K67/027GK1821416SQ200610038609公開日2006年8月23日申請(qǐng)日期2006年3月2日優(yōu)先權(quán)日2006年3月2日發(fā)明者李碧春,周冠月申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)