表達(dá)豬傳染性胃腸炎病毒s蛋白的重組枯草芽孢桿菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及表達(dá)豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的重組枯草芽孢桿菌，屬于生物技術(shù)基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明成功構(gòu)建了豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白重組枯草芽孢桿菌整合表達(dá)質(zhì)粒pIncotGSR，并成功電擊轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌WB800。經(jīng)Western-blot驗(yàn)證豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白在重組枯草芽孢桿菌內(nèi)可以被成功表達(dá)?？诜庖呖梢源碳ひ辉慢g仔豬機(jī)體產(chǎn)生有效的TGEV特異性免疫應(yīng)答水平。重組枯草芽孢桿菌有望開發(fā)成預(yù)防豬傳染性胃腸炎的基因工程口服疫苗。
【專利說明】
表達(dá)豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的重組枯草芽孢桿菌 一、
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及表達(dá)豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的重組枯草芽孢桿菌，屬于生物技術(shù) 基因工程領(lǐng)域。具體包括：豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白整合表達(dá)性質(zhì)粒plncotGSR的構(gòu)建， 豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的表達(dá)與鑒定以及重組枯草芽孢桿菌可以刺激一月齡仔豬機(jī) 體產(chǎn)生有效的TGEV特異性免疫應(yīng)答水平。 二、
【背景技術(shù)】
[0002] 1.豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV)主要結(jié)構(gòu)蛋白之一-S蛋白（S)
[0003] 豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis of swine，TGE)是由豬傳染 性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis of swine virus，TGEV)引起的一種高度 接觸性腸道傳染病，以引起2周齡以內(nèi)仔豬嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水和高死亡率（可達(dá)100% ) 為主要特征。TGEV屬冠狀病毒科冠狀病毒屬，是一種多形態(tài)有囊膜的病毒。病毒粒子呈圓 形、橢圓形或多邊形，直徑為90~200nm病毒囊膜由雙層脂質(zhì)組成，在脂質(zhì)雙層中穿插有 三種蛋白：纖突蛋白（S蛋白）、膜蛋白（M蛋白）、和小囊膜蛋白（sM蛋白）。S糖蛋白部分 突出于病毒粒子表面，形成典型的花瓣?duì)钔黄穑L20nm，使整個(gè)病毒粒子在電鏡下觀察像皇 冠狀。編碼S糖蛋白的基因長度為4344bp，最初合成的S蛋白前體由1447(Purder株）或 1449 (Miller株）個(gè)氨基酸殘基組成。切除16個(gè)起分泌信號(hào)膚作用的疏水性氨基酸殘基 后，多膚鏈還有1431個(gè)（Miller株為1433個(gè)）氨基酸殘基，分子量約為158kD ;富含甘露糖 的碳水化合物側(cè)鏈經(jīng)修飾后，加到S蛋白的N糖基化位點(diǎn)上（共32-34個(gè)位點(diǎn)）上，形成胞 內(nèi)EZ蛋白，分子量為175kD ;EZ蛋白在胞內(nèi)高爾基復(fù)合體中再一次糖基化，成為成熟蛋白， 分子量為200kD。S糖蛋白可分為以下幾個(gè)區(qū)域：膜外區(qū)、跨膜區(qū)、膜內(nèi)區(qū)。其中膜外功能區(qū) 主要形成S蛋白的冠狀突起的成分，在其羧基端1/5-1/4處形成8nm雙股α螺旋結(jié)構(gòu)。S 蛋白的膜外區(qū)上分布有該蛋白的主要抗原位點(diǎn)，宿主細(xì)胞氨肽酶受體（ΡΑΡΝ)的識(shí)別位點(diǎn)， 以及一段DRTRG序列（為退化的切割位點(diǎn)）。跨膜區(qū)及膜內(nèi)區(qū)位于S蛋白C 一末端，其中有 大約20個(gè)氨基酸殘基的疏水片段使S蛋白固定于脂膜中；由約35個(gè)氨基酸殘基組成的中 間區(qū)域分為兩個(gè)部分：半胱氨酸殘基含量比率高（約50%)的部分可能是酯酰化位點(diǎn)，另 一較小的疏水區(qū)可能嵌入病毒粒子內(nèi)部。S蛋白主要有以下5方面的作用：①攜帶主要的Β 淋巴細(xì)胞抗原決定簇，是唯一能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)蛋白；②含 有宿主細(xì)胞氨肽酶受體（ΡΑΡΝ)的識(shí)別位點(diǎn)，在決定宿主細(xì)胞親嗜性方面起關(guān)鍵作用；③決 定TGEV的致病性；④具有細(xì)胞膜融合作用，使病毒核衣殼進(jìn)入細(xì)胞漿；⑤決定TEGV的血凝 作用。
[0004] 早在1979年研究發(fā)現(xiàn)，S糖蛋白可提供免疫保護(hù)作用。Jimenez等通過放射免疫 分析進(jìn)一步證實(shí)，S糖蛋白攜帶主要的B淋巴細(xì)胞抗原決定簇，是唯一能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗 體和提供免疫保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)蛋白。Gebauer等通過單克隆抗體競爭試驗(yàn)確定了 S糖蛋白 存在3種層次的抗原結(jié)構(gòu)，即抗原位點(diǎn)（sites)、抗原亞位點(diǎn)（subsities)和抗原決定簇 (epitoes)，S蛋白共有11個(gè)抗原決定簇，其中5個(gè)是與中和抗體產(chǎn)生相關(guān)的重要抗原決定 簇。S蛋白的抗原位點(diǎn)包括A、B、C、D四個(gè)位點(diǎn)，A、D位點(diǎn)在誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體中起著主要 作用，在S基因中若編碼A、D位點(diǎn)的序列缺失，則其表達(dá)產(chǎn)物不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。 因此S基因成為TGEV基因工程疫苗研究的首選抗原基因，目前已在多種不同的表達(dá)系統(tǒng)中 對(duì)S蛋白進(jìn)行了表達(dá)并對(duì)其免疫原性進(jìn)行了研究。近年來，國內(nèi)外大量學(xué)者，通過腺病毒、 桿狀病毒、大腸桿菌等成功表達(dá)過TGEV的S蛋白，而且表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性，卻 因?yàn)樘峒兊鞍追椒ㄟ^于繁瑣或者表達(dá)基因的大小受到限制等大大限制了 S蛋白在疫苗中 應(yīng)用。
[0005] 2.枯草芽孢桿菌對(duì)黏膜免疫的影響
[0006] 目前對(duì)黏膜抗原的細(xì)菌遞送載體，尤其是能夠入侵或者定植在黏膜上皮細(xì)胞的細(xì) 菌，已有廣泛研究?；罴?xì)菌載體的種類很多，應(yīng)用比較廣泛的包括兩類：一類為弱毒病原體 能夠誘導(dǎo)強(qiáng)而持久的免疫應(yīng)答，如沙門氏菌和李斯特菌，但這些減毒細(xì)菌做為載體傳遞疫 苗存在潛在的危險(xiǎn)性，甚至是致病性。另一類是目前較為關(guān)注的安全無致病性的共生物種， 如乳球菌、乳桿菌和枯草芽孢桿菌等益生菌。枯草芽孢桿菌作為一種安全的無致病性活細(xì) 菌載體，是廣泛存在于土壤和植物中的優(yōu)勢生物種群，隸屬于芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬，其 細(xì)胞呈直桿狀，大?。?.8~1.2) μ mX (1.5~4.0) μ m，單個(gè)，革蘭氏染色陽性，著色均勻， 無莢膜，能運(yùn)動(dòng)?？莶輻U菌作為抗原的載體具有很多優(yōu)點(diǎn)：①是人類和動(dòng)物安全紀(jì)錄的益生 菌和食品添加劑，②成本低廉、耐熱、抗干燥、便于運(yùn)輸和使用，③其遺傳性狀和細(xì)菌學(xué)水平 都很容易操縱。因此，枯草芽孢桿菌非常適宜作為安全的口服疫苗和其他病原體的抗原遞 送載體。同時(shí)枯草芽孢桿菌作為抗原遞送載體可以誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答和全身免疫應(yīng)答，這 引起了研究者們極大的興趣。這對(duì)于開發(fā)新型口服疫苗，提供了廣闊的空間。
[0007] 3. 口服黏膜免疫研究進(jìn)展
[0008] 口服黏膜免疫方法簡便、安全，不僅在黏膜局部和其他黏膜組織產(chǎn)生免疫應(yīng)答，還 可引起全身性體液免疫應(yīng)答，多年來受到國內(nèi)外免疫學(xué)家的密切關(guān)注。目前兒童廣泛口服 的脊髓灰質(zhì)炎糖丸就是一個(gè)消化道黏膜免疫成功的例子。脊髓灰質(zhì)炎口服疫苗的應(yīng)用，使 全球小兒麻痹發(fā)病得到有效控制，為口服疫苗的研制與應(yīng)用起到了指導(dǎo)作用。但是在實(shí)踐 中，口服疫苗經(jīng)過消化道時(shí)常受到消化液的降解，疫苗很容易被破壞，影響免疫力的效果， 使消化道黏膜免疫方法的應(yīng)用和推廣受到限制。近年來疫苗遞送系統(tǒng)成為研究傳染病防御 領(lǐng)域新技術(shù)的熱點(diǎn)之一。尤其是細(xì)菌活載體疫苗因具有培養(yǎng)方便，外源基因容量大，刺激細(xì) 胞免疫力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)具有巨大的應(yīng)用潛力。細(xì)菌載體疫苗是新興現(xiàn)代疫苗的重要發(fā)展方向， 所謂細(xì)菌載體疫苗是將所需的編碼病原菌特異性抗原的DNA片段插入減毒的病原菌或者 共生菌中，讓其表達(dá)所編碼的抗原，以期達(dá)到預(yù)防一種或多種疾病的目的。通過活菌載體遞 送疫苗抗原不僅可刺激腸道局部免疫應(yīng)答，又可針對(duì)特異性抗原產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，使 機(jī)體可以獲得全面的保護(hù)力。
[0009] 以前的研究表明一些減毒細(xì)菌可作為疫苗抗原的載體，如沙門氏菌、弱毒李斯特 菌等。國外學(xué)者以減毒沙門氏菌為載體在真核細(xì)胞中成功表達(dá)了 lacZ基因、綠色熒光蛋 白（GFP)基因、HIV-gpl40基因、李斯特菌溶血素基因等。沙門氏菌為載體傳遞DNA疫苗還 能存在潛在危險(xiǎn)性。首先，減毒細(xì)菌可能存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)；其次，質(zhì)粒DNA可能會(huì)整合 到宿主細(xì)胞基因組，從而引起調(diào)控細(xì)胞生長的基因紊亂、原癌基因和抑癌基因的表達(dá)失控、 體細(xì)胞癌變、細(xì)胞轉(zhuǎn)型等一系列問題。此外，減毒細(xì)菌對(duì)一些老弱病殘個(gè)體可能有潛在致病 性。因此，選擇理想的疫苗抗原載體是建立生物學(xué)新技術(shù)的關(guān)鍵。理想的輸送抗原的載體 應(yīng)該是能夠在體內(nèi)較長時(shí)間存在，本身對(duì)機(jī)體既安全又能產(chǎn)生持續(xù)免疫力的一些微生物。
[0010] 隨著以益生菌為活載體傳遞抗原，刺激腸道黏膜免疫這一技術(shù)路線的提出，本發(fā) 明試圖在益生菌枯草芽孢桿菌中表達(dá)TGEV的S蛋白進(jìn)行活菌的口服免疫。對(duì)研制豬傳染性 胃腸炎口服疫苗，為預(yù)防豬傳染性胃腸炎開辟一條全新的黏膜免疫途徑具有重要的意義。 三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 技術(shù)問題
[0012] 本發(fā)明成功構(gòu)建了豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白重組型枯草芽孢桿菌整合表達(dá)質(zhì) 粒plncotGSR，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入枯草芽孢桿菌WB800。豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白在重組枯草 芽孢桿菌WB800內(nèi)可以被成功表達(dá)，并通過口服免疫可以刺激一月齡仔豬機(jī)體產(chǎn)生有效的 TGEV特異性免疫應(yīng)答水平。重組枯草芽孢桿菌WB800有望開發(fā)成預(yù)防豬傳染性胃腸炎的基 因工程口服疫苗。
[0013] 技術(shù)方案
[0014] 本發(fā)明涉及表達(dá)豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白重組枯草芽孢桿菌，該重組枯草芽孢 桿菌WB800菌株，屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)。檢測一月齡仔豬口服免疫該重 組枯草芽孢桿菌WB800菌株機(jī)體產(chǎn)生有效的TGEV特異性免疫應(yīng)答水平。
[0015] 1其整合表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建方法包括：
[0016] 1. 1枯草芽孢桿菌解淀粉酶E 5端和3端的克隆
[0017] 參照已發(fā)表的枯草芽孢桿菌的amyE序列（GenBank登陸號(hào)：NZ_CM000487. 1)，設(shè)計(jì) 一對(duì)擴(kuò)增amyE5的引物，并在上、下游引物5端分別引入Nhel、Hindlll酶切位點(diǎn)（下劃線 為酶切位點(diǎn)），引物序列如下：
[0018] PI：GCTAGCATTCTCCAGTCTTCACATCGGT
[0019] P2 ：AAGCTTTCTTCATCATCATTGGCATACG
[0020] 設(shè)-Η對(duì)擴(kuò)增amyE 3的引物，并在上、下游引物5端分別引入Kpnl、Xhol酶切位 點(diǎn)（下劃線為酶切位點(diǎn)），引物序列如下：
[0021] P3 ：GGTACCATGATATCCGTTTAGGCTGGGC
[0022] P4 ：CTCGAGCTTTGATGTCTTTTTGTTTGTGAA
[0023] 以枯草芽孢桿菌WB800提取的基因組DNA為模板，用合成的Pl、P2引物PCR擴(kuò)增 amyE 5及P3、P4引物擴(kuò)增amyE 3序列，PCR反應(yīng)體系均為50 μ L，amyE 5PCR反應(yīng)條件： 95。(：預(yù)變性511^11，951€3〇86。，691€3〇86。，72。(：111^11，30。7。168,72。(：1〇11^11，4。(：1〇11^11 ; amyE 3PCR 反應(yīng)條件為 95°C 預(yù)變性 5min;95°C 30sec，69°C 30sec，72°C lmin，30cycles， 72°C 10min，4。°C lOmin，將PCR產(chǎn)物連接到pMDT-19載體上，構(gòu)建的載體分別命名為T-amyE 5和T-amyE 3。測序后獲得具有枯草芽孢桿菌amyE 5端的DNA序列SEQ ID NO. 1和具有 枯草芽孢桿菌amyE 3端的DNA序列SEQ ID NO. 2。
[0024] 1. 2硫酸卡那霉素抗性基因的克隆
[0025] 參照已發(fā)表的硫酸卡那霉素抗性基因序列（GenBank登陸號(hào)：EU549779. 1)設(shè)計(jì)一 對(duì)擴(kuò)增Kaf的引物，并在上游引物5端引入Kpnl、Hindlll酶切位點(diǎn)，下游引物5端引入 ΚρηΙ酶切位點(diǎn)（下劃線為酶切位點(diǎn)），引物序列如下：
[0026] P5 ：GGTACCAAGCTTTTCAACAAACGGGCCAGTTT
[0027] P6 ：GGTACCTCAAAATGGTATGCGTTTTGACA
[0028] 以pMK3質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系為50 μ L，PCR反應(yīng)條件：95°C預(yù) 變性 5min，95°C 30sec，7rC 30sec，72°C IminJOcycles，？〗?。?10min，4°C lOmin ;將 PCR 產(chǎn) 物連接到PMD19-T載體上，構(gòu)建的載體命名為T-Kan%測序后獲得具有完整編碼區(qū)的硫酸卡 那霉素抗性基因序列SEQ ID NO. 3。
[0029] 1. 3枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基因的克隆
[0030] 參照已發(fā)表的枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基因序列（GenBank登陸號(hào)：NZ_ CM000487. 1)設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增被膜蛋白G基因 cotG的引物，并在上游引物5端引入與枯草芽 孢桿菌amyE 5 3'末端15bp的同源臂序列，兩序列之間引入Hindlll酶切位點(diǎn)（下劃線為 酶切位點(diǎn)）；下游引物5端引入與S蛋白基因5'末端10bp的同源臂序列，兩序列之間引入 Nhel酶切位點(diǎn)（下劃線為酶切位點(diǎn)），引物序列如下：
[0031] P7 ：ATGATGATGAAGAGAAGCTTTTTCCCTTTCTAAATCGC
[0032] P8 ：GTTTTTTCATGCTAGCTTTGTATTTCTTTTTGACTACCC
[0033] 以枯草芽孢桿菌提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系為50 μ L， PCR 反應(yīng)條件：95°C 預(yù)變性 5min，95°C 30sec，71°C 30sec，72°C lmin 12sec，30cycles， 72°C 10min，4°C lOmin ;將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，構(gòu)建的載體命名為T-cotG，測 序后獲得具有完整編碼區(qū)的枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基因序列SEQ ID N0. 4。
[0034] 1. 4豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因的克隆
[0035] 參照已發(fā)表的豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因序列（GenBank登陸號(hào)：KP202848) 設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增S蛋白基因 cDNA的引物，在上游引物引入與枯草芽孢桿菌cotG 3'末端12bp 的同源臂序列，兩序列之間引入Nhel酶切位點(diǎn)（下劃線為酶切位點(diǎn)）；在下游引物引入與 紅色熒光蛋白基因 RFP 5'末端12bp的同源臂序列，兩序列之間引入Hindlll酶切位點(diǎn)（下 劃線為酶切位點(diǎn)），引物序列如下：
[0036] P9 ：AAGAAATACAAAGCTAGCATGAAAAAACTATTTGTG
[0037] P10 ：GGTGTTGTCCATAAGCTTATGGACGTGCACTTTTTCA
[0038] 以豬傳染性胃腸炎病毒SHXB毒株（豬傳染性胃腸炎病毒強(qiáng)毒株）提取的總RNA 為模板，經(jīng)MLV-反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系為50 μ L，PCR 反應(yīng)條件：95°C 預(yù)變性 5min，95°C 30sec，67°C 30sec，72°C ^indOcyclesJSt： 10min， 4°C lOmin ;將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，構(gòu)建的載體命名為T-S，測序后獲得具有完 整編碼區(qū)的豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因序列SEQ ID N0. 5。
[0039] 1· 5紅色灰光蛋白基因的克隆
[0040] 參照已發(fā)表的紅色熒光蛋白基因序列（GenBank登陸號(hào)：ΑΒ166761. 1)設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò) 增紅色熒光蛋白基因 RFP的引物，在上游引物引入與S蛋白基因3'末端12bp的同源臂序 列，兩序列之間引入Hindlll酶切位點(diǎn)（下劃線為酶切位點(diǎn)）；在下游引物引入與枯草芽孢 桿菌amyE 35'末端12bp的同源臂序列，兩序列之間引入Hindlll酶切位點(diǎn)（下劃線為酶 切位點(diǎn)），引物序列如下：
[0041] Pll：GTGCACGTCCATAAGCTTATGGACAACACCGAGGAC
[0042] P12 ：GTCGACGGTACCAAGCTTCTACTGGGAGCCGGAGTG
[0043] 以pDsRed-monomer-Nl質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系為50 μ L，PCR反 應(yīng)條件：95。(：預(yù)變性5111丨11，951€3〇86。，721€3〇86。，72 1€48 86。，30。7。168,72。(：1〇11^11， 4°C lOmin ;將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，構(gòu)建的載體命名為T-RFP，測序后獲得具有 完整編碼區(qū)的紅色熒光蛋白基因序列SEQ ID N0. 6。
[0044] 1. 6整合表達(dá)載體骨架plnAmyE的構(gòu)建
[0045] 利用酶切連接技術(shù)，分別將SEQ ID NO. 1序列、SEQ ID N0. 3序列和SEQ ID N0. 2 序列克隆至載體p⑶NA3. 1上，獲得整合表達(dá)骨架載體plnAmyE。采用限制性內(nèi)切酶Nhel、 HindIII、KpnI和Xhol，分別用雙酶切驗(yàn)證。
[0046] 1. 7整合表達(dá)載體plncotGSR的構(gòu)建
[0047] 以SEQ ID N0. 4序列、SEQ ID N0. 5序列和SEQ ID N0. 6序列為模板，用引物P7、 P12進(jìn)行重疊 PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50 μ L，PCR反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性5min，95°C 30sec， 72°C 30sec，72°C 5min，30cycles，72°C 10min，4°C lOmin ;將 PCR 產(chǎn)物回收，并使用 One Step Cloning Kit定點(diǎn)克隆試劑盒克隆至載體骨架plnAmyE上，測序后獲得整合表達(dá)載體 plncotGSR。
[0048] 2電轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB800菌株，屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)。
[0049] 將構(gòu)建的整合表達(dá)質(zhì)粒plncotGSR采用電擊轉(zhuǎn)化的方法，取60 μ L枯草芽孢桿菌 WB800電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞與1 μ L(50ng/ μ L)整合表達(dá)載體plncotGSR質(zhì)?；旌霞尤腚姄舯?中冰浴5min后進(jìn)行電擊，電擊條件：22KV/cm，25 μ F，200 Ω，電擊一次。加入lmL電擊恢復(fù) 液，37°C lOOrprn孵育3h，涂布于硫酸卡那霉素抗性固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基LB平板，14-18h可見陽 性菌落。將重組枯草芽孢桿菌WB800,進(jìn)行PCR和Western-blot驗(yàn)證，并且進(jìn)行共聚焦顯微 鏡觀察。
[0050] 3檢測口服免疫該重組枯草芽孢桿菌WB800菌株機(jī)體產(chǎn)生的TGEV特異性免疫應(yīng)答 水平
[0051] 空枯草芽孢桿菌WB800菌株（基因組中未整合外源基因）和表達(dá)豬傳染性胃 腸炎病毒S蛋白的重組枯草芽孢桿菌WB800菌株分別口服免疫一月齡仔豬，口服劑量為 1 X lO^fu/kg，首免一周后按相同劑量進(jìn)行二免，每周進(jìn)行血清和糞便的采集，飼養(yǎng)周期為 五周。采用間接ELISA的方法進(jìn)行TGEV特異性IgG和特異性SIgA水平變化檢測。檢測方 法為：豬傳染性胃腸炎抗原包被過夜，1% BSA(牛血清白蛋白）37°C封閉2h，洗滌后加待檢 樣品37°C作用lh，洗滌加適當(dāng)稀釋后的辣根過氧化物酶標(biāo)兔抗豬IgG或IgA抗體，37°C lh， 含四甲基聯(lián)苯胺和H202的TMB顯色液顯色后酶標(biāo)儀檢測0D450。
[0052] 有益效果
[0053] 1本試驗(yàn)構(gòu)建的整合表達(dá)質(zhì)粒plncotGSR是目前國內(nèi)外第一個(gè)豬傳染性胃腸炎病 毒S蛋白重組枯草芽孢桿菌表達(dá)質(zhì)粒。
[0054] 2本發(fā)明成功構(gòu)建了豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白重組型枯草芽孢桿菌整合表達(dá)質(zhì) 粒plncotGSR，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入枯草芽孢桿菌WB800。經(jīng)Western-blot驗(yàn)證豬傳染性胃腸炎病 毒S蛋白在重組枯草芽孢桿菌WB800內(nèi)可以被成功表達(dá)。并通過口服免疫可以刺激一月齡 仔豬機(jī)體產(chǎn)生有效的TGEV特異性免疫應(yīng)答水平。重組枯草芽孢桿菌WB800有望開發(fā)成預(yù) 防豬傳染性胃腸炎的基因工程口服疫苗。
[0055] 3本發(fā)明構(gòu)建了枯草芽孢桿菌遞送表達(dá)系統(tǒng)，可插入各種抗原、活性肽和藥物等， 有利于開發(fā)各種重組枯草芽孢桿菌疫苗，為枯草芽孢桿菌在動(dòng)物黏膜免疫以及口服基因工 程活疫苗等方面的研究奠定基礎(chǔ)。下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施技術(shù)對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。 四、
【附圖說明】：
[0056] 圖1 :枯草芽孢桿菌解淀粉酶E 5端基因 amyE 5、枯草芽孢桿菌解淀粉酶E 3端基 因 amyE3和硫酸卡那霉素抗性基因 Kaf的PCR擴(kuò)增結(jié)果凝膠電泳圖
[0057] 圖2 :枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基因 cotG的PCR擴(kuò)增結(jié)果凝膠電泳圖
[0058] 圖3 :豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因 S的PCR擴(kuò)增結(jié)果凝膠電泳圖
[0059] 圖4 :紅色熒光蛋白基因 RFP的PCR擴(kuò)增結(jié)果凝膠電泳圖
[0060] 圖5 :構(gòu)建的整合表達(dá)骨架質(zhì)粒plnAmyE示意圖
[0061] 圖6 :構(gòu)建的整合表達(dá)載體質(zhì)粒plncotGSR示意圖
[0062] 圖7 :整合表達(dá)骨架質(zhì)粒plnAmyE酶切驗(yàn)證電泳圖
[0063] 圖8 :整合表達(dá)載體質(zhì)粒plncotGSR酶切驗(yàn)證電泳圖
[0064] 圖9 :重組枯草芽孢桿菌WB800基因組PCR驗(yàn)證電泳圖
[0065] 圖10 :重組枯草芽孢桿菌WB800表達(dá)產(chǎn)物Western-blot (免疫印跡圖）
[0066] 圖11 :重組枯草芽孢桿菌WB800共聚焦觀察圖
[0067] 圖12 :重組枯草芽孢桿菌WB800對(duì)TGEV特異性IgG水平變化的影響圖
[0068] 圖13 :重組枯草芽孢桿菌WB800對(duì)TGEV特異性SIgA水平變化的影響圖 五、
【具體實(shí)施方式】
[0069] 1整合表達(dá)質(zhì)粒plncotGSR的構(gòu)建
[0070] 下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。具體涉及的材料和試劑 如下：枯草芽孢桿菌WB800菌株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院高學(xué)文惠贈(zèng)，文獻(xiàn)見：Wu， Η·，Wang，S.，Qiao, J.，Liu，J.，Zhan，J.，Gao, X.，2009. Expression of HpaGxooc protein in Bacillus subtilis and its biological functions. Journal of microbiology and biotechnology 19,194-203;
[0071] 豬傳染性胃腸炎病毒SHXB毒株由江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)所何孔旺惠贈(zèng)，文獻(xiàn) 見：Weiwei，H.，Qinghua，Y.，Liqi，Z.，Haofei，L.，Shanshan，Z.，Qi，G.，Kongwang， H.，Qian，Y. 2014. Complete genomic sequence of the coronavirus transmissible gastroenteritis virus SHXB isolated in China. Archives of virology 159， 2295-2302 ；
[0072] E. coli JM109、質(zhì)粒 pDsRed-monomer-Nl (購自 Takara);質(zhì)粒 pMK3、pCDNA3. 1 (購 自 Life Technologies)；
[0073] 試劑：Q5 高保真酶購自 NEB 公司；pMD19_T 載體，Agarose Gel DNA Purification Kit，限制性內(nèi)切酶，T4連接酶等均購自Takara公司；硫酸卡那霉素，氨芐青霉素，細(xì)菌基因 組提取試劑盒，病毒RNA提取試劑盒等均購自O(shè)MEGA公司；試劑MLV-反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega 公司；One Step Cloning Kit定點(diǎn)克隆試劑盒購自Vazyme公司；辣根過氧化物酶標(biāo)兔抗豬 IgG和IgA抗體購自BETHYL公司；含四甲基聯(lián)苯胺和H202的TMB顯色液購自TIANGEN公司。
[0074] 1. 1枯草芽孢桿菌解淀粉酶E 5端和3端的克隆
[0075] 參照已發(fā)表的枯草芽孢桿菌的amyE序列（GenBank登陸號(hào)：NZ_CM000487. 1)，設(shè)計(jì) 一對(duì)擴(kuò)增amyE 5的引物，并在上、下游引物5端分別引入NheI、HindIII酶切位點(diǎn)（下劃線 為酶切位點(diǎn)），引物序列如下：
[0076] PI：GCTAGCATTCTCCAGTCTTCACATCGGT
[0077] P2 ：AAGCTTTCTTCATCATCATTGGCATACG
[0078] 設(shè)-Η對(duì)擴(kuò)增amyE 3的引物，并在上、下游引物5端分別引入Kpnl、Xhol酶切位 點(diǎn)（下劃線為酶切位點(diǎn)），引物序列如下：
[0079] P3 ：GGTACCATGATATCCGTTTAGGCTGGGC
[0080] P4 ：CTCGAGCTTTGATGTCTTTTTGTTTGTGAA
[0081] 以枯草芽孢桿菌WB800提取的DNA為模板，分別用合成的Pl、P2和P3、P4引物常 規(guī)PCR克隆枯草芽孢桿菌解淀粉酶E 5端和3端。如圖1可知：1為PCR成功克隆llOObp 的amyE 5 ;2為PCR成功克隆1170bp的amyE 3。切取目的條帶，經(jīng)DNA純化試劑盒回收后， 連接到PMD19-T載體上，構(gòu)建的載體分別命名為T-amyE 5和T-amyE 3,經(jīng)菌落PCR及酶切 驗(yàn)證后測序。所獲得的序列經(jīng)BLAST及DNAstar與GenBank上已發(fā)表的序列比對(duì)。所克隆 的枯草芽孢桿菌解淀粉酶E 5端和3端序列與已經(jīng)在GenBank上發(fā)表的序列的同源性為 100%〇
[0082] 1. 2硫酸卡那霉素抗性基因的克隆
[0083] 參照已發(fā)表的硫酸卡那霉素抗性基因序列（GenBank登陸號(hào)：EU549779. 1)設(shè)計(jì)一 對(duì)擴(kuò)增Kaf的引物，并在上游引物5端引入Kpnl、Hindlll酶切位點(diǎn)，下游引物5端引入 ΚρηΙ酶切位點(diǎn)（下劃線為酶切位點(diǎn)），引物序列如下：
[0084] Ρ5 ：GGTACCAAGCTTTTCAACAAACGGGCCAGTTT
[0085] P6 ： GGTACCTCAAAATGGTATGCGTTTTGACA
[0086] 以pMK3質(zhì)粒為模板，用合成的P5、P6引物常規(guī)PCR克隆硫酸卡那霉素抗性基因。 如圖1可知：3為PCR成功克隆193bp的Kaf。切取目的條帶，經(jīng)DNA純化試劑盒回收后， 連接到PMD19-T載體上，構(gòu)建的載體命名為T-Kan%經(jīng)菌落PCR及酶切驗(yàn)證后測序。所獲得 的序列經(jīng)BLAST及DNAstar與GenBank上已發(fā)表的序列比對(duì)。所克隆的硫酸卡那霉素抗性 基因序列與已經(jīng)在GenBank上發(fā)表的序列的同源性為100%。
[0087] 1. 3枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基因的克隆
[0088] 參照已發(fā)表的枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基因序列（GenBank登陸號(hào)：NZ_ CM000487. 1)設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增被膜蛋白G基因 cotG的引物，并在上游引物5端引入與枯草芽 孢桿菌amyE53'末端15bp的同源臂序列，兩序列之間引入Hindlll酶切位點(diǎn)（下劃線為 酶切位點(diǎn)）；下游引物5端引入與S蛋白基因5'末端10bp的同源臂序列，兩序列之間引入 Nhel酶切位點(diǎn)（下劃線為酶切位點(diǎn)），引物序列如下：
[0089] P7 ：ATGATGATGAAGAGAAGCTTTTTCCCTTTCTAAATCGC
[0090] P8 ：GTTTTTTCATGCTAGCTTTGTATTTCTTTTTGACTACCC
[0091] 以枯草芽孢桿菌提取的DNA為模板，用合成的P7、P8引物常規(guī)PCR克隆枯草芽孢 桿菌被膜蛋白G基因。如圖2:可知PCR成功克隆1218bp的cotG。切取目的條帶，經(jīng)DNA 純化試劑盒回收后，連接到PMD19-T載體上，構(gòu)建的載體命名為T-cotG，經(jīng)菌落PCR及酶切 驗(yàn)證后測序。所獲得的序列經(jīng)BLAST及DNAstar與GenBank上已發(fā)表的序列比對(duì)。所克隆 的枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基因序列與已經(jīng)在GenBank上發(fā)表的序列的同源性為100%。
[0092] 1. 4豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因的克隆
[0093] 參照已發(fā)表的豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因序列（GenBank登陸號(hào)：KP202848) 設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增S蛋白基因 cDNA的引物，在上游引物引入與枯草芽孢桿菌cotG 3'末端12bp 的同源臂序列，兩序列之間引入Nhel酶切位點(diǎn)（下劃線為酶切位點(diǎn)）；在下游引物引入與 紅色熒光蛋白基因 RFP 5'末端12bp的同源臂序列，兩序列之間引入Hindlll酶切位點(diǎn)（下 劃線為酶切位點(diǎn)），引物序列如下：
[0094] P9 ：AAGAAATACAAAGCTAGCATGAAAAAACTATTTGTG
[0095] P10 ：GGTGTTGTCCATAAGCTTATGGACGTGCACTTTTTCA
[0096] 以豬傳染性胃腸炎病毒SHXB毒株提取的總RNA為模板，經(jīng)MLV-反轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA第一鏈；以cDNA為模板，用合成的P9、P10引物常規(guī)PCR克隆豬傳染性胃腸炎病毒S 蛋白基因。如圖3:可知PCR成功克隆4344bp的S。切取目的條帶，經(jīng)DNA純化試劑盒回收 后，連接到PMD19-T載體上，構(gòu)建的載體命名為T-S，經(jīng)菌落PCR及酶切驗(yàn)證后測序。所獲得 的序列經(jīng)BLAST及DNAstar與GenBank上已發(fā)表的序列比對(duì)。所克隆的豬傳染性胃腸炎 病毒S蛋白基因序列與已經(jīng)在GenBank上發(fā)表的序列的同源性為100%
[0097] 1. 5紅色灰光蛋白基因的克隆
[0098] 參照已發(fā)表的紅色熒光蛋白基因序列（GenBank登陸號(hào)：AB166761. 1)設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò) 增紅色熒光蛋白基因 RFP的引物，在上游引物引入與S蛋白基因3'末端12bp的同源臂序 列，兩序列之間引入Hindlll酶切位點(diǎn)（下劃線為酶切位點(diǎn)）；在下游引物引入與枯草芽孢 桿菌amyE 35'末端12bp的同源臂序列，兩序列之間引入Hindlll酶切位點(diǎn)（下劃線為酶 切位點(diǎn)），引物序列如下：
[0099] Pll：GTGCACGTCCATAAGCTTATGGACAACACCGAGGAC
[0100] P12 ：GTCGACGGTACCAAGCTTCTACTGGGAGCCGGAGTG
[0101] 以pDsRed-monomer-Nl質(zhì)粒為模板，用合成的Pll、P12引物常規(guī)PCR克隆紅色熒 光蛋白基因。如圖4:可知PCR成功克隆678bp的RFP。切取目的條帶，經(jīng)DNA純化試劑盒 回收后，連接到PMD19-T載體上，構(gòu)建的載體命名為T-RFP，經(jīng)菌落PCR及酶切驗(yàn)證后測序。 所獲得的序列經(jīng)BLAST及DNAstar與GenBank上已發(fā)表的序列比對(duì)。所克隆的紅色熒光蛋 白基因序列與已經(jīng)在GenBank上發(fā)表的序列的同源性為100%。
[0102] 1. 6重組表達(dá)載體骨架plnAmyE的構(gòu)建
[0103] 將枯草芽孢桿菌解淀粉酶E 5端、硫酸卡那霉素抗性基因和枯草芽孢桿菌解淀粉 酶E3端利用酶切連接技術(shù)依次克隆至載體p⑶NA3. 1上，獲得整合表達(dá)載體骨架plnAmyE。
[0104] 1. 7重組表達(dá)載體plncotGSR的構(gòu)建
[0105] 將plnAmyE用限制性核酸內(nèi)切酶Hindlll進(jìn)行單酶切，并回收；枯草芽孢桿菌被 膜蛋白G基因、豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因和紅色熒光蛋白基因進(jìn)行重疊 PCR后，使用 One Step Cloning Kit定點(diǎn)克隆試劑盒克隆至整合表達(dá)載體骨架plnAmyE上，獲得整合表 達(dá)載體 plncotGSR。
[0106] 1. 8整合表達(dá)載體骨架plnAmyE的驗(yàn)證
[0107] 采用限制性核酸內(nèi)切酶NheI、HindIII、KpnI和Xhol，分別用雙酶切驗(yàn)證整合表達(dá) 載體骨架PlnAmyE。如圖7可知：1為整合表達(dá)載體骨架plnAmyE，經(jīng)Nhel和Hindlll雙酶 切得到llOObp上游整合位點(diǎn)amyE 5 ;2為整合表達(dá)載體骨架plnAmyE，經(jīng)Hindlll和ΚρηΙ 雙酶切得到930bp篩選基因 Kan1^為整合表達(dá)載體骨架plnAmyE，經(jīng)ΚρηΙ和Xhol雙酶切 得到1170bp下游整合位點(diǎn)amyE 3。
[0108] 1. 9整合表達(dá)載體plncotGSR的驗(yàn)證
[0109] 采用限制性核酸內(nèi)切酶Hindlll酶切驗(yàn)證整合表達(dá)載體plncotGSR。如圖8可知： 1、2、3為整合表達(dá)載體plncotGSR經(jīng)HindllI酶切得到6252bp枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基 因、豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因和紅色熒光蛋白基因融合片段。
[0110] 2重組豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白枯草芽孢桿菌WB800的驗(yàn)證
[0111] 將構(gòu)建的整合表達(dá)質(zhì)粒PlncotGSR采用電擊轉(zhuǎn)化的方法，取60 μ L枯草芽孢桿菌 WB800電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞與1 μ L(50ng/μ L)整合表達(dá)載體plncotGSR質(zhì)粒混合加入電擊 杯中冰浴5min后進(jìn)行電擊（型號(hào)：BTX ECM630)，電擊條件：22KV/cm，25 μ F，200 Ω，電擊一 次。加入lmL電擊恢復(fù)液，37°C孵育3h，卡那抗性固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基LB平板篩選電擊恢復(fù)液， 14-18h可見陽性菌落，培養(yǎng)陽性菌落并提取基因組，經(jīng)PCR驗(yàn)證，重組豬傳染性胃腸炎病毒 S蛋白枯草芽孢桿菌WB800內(nèi)均含有豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白AD位點(diǎn)基因 （1050bp)。 PCR驗(yàn)證引物如下：
[0112] P13 :TCATTGAACACAACGGGTGGTGTC
[0113] P14 ：TAAGCCACTAAGTAGCGTCCTGTTAG
[0114] 以上引物均由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成；
[0115] 如圖9可知：均為含有豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因的陽性重組豬傳染性胃腸 炎病毒S蛋白枯草芽孢桿菌WB800菌株基因組。
[0116] 3重組豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白枯草芽孢桿菌WB800的Western-blot分析
[0117] 對(duì)重組枯草芽孢桿菌WB800溶菌酶處理，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western-blot分析， 結(jié)果與鼠抗紅色熒光蛋白單抗呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，如圖10可知：2、3、4為重組枯草芽孢桿菌 WB800 (基因組中含cotG、S、RFP)與1為枯草芽孢桿菌WB800 (基因組中未整合外源基因） 相比，在209kD處有一條明顯的蛋白印跡帶，且無非特異性條帶出現(xiàn)，證明豬傳染性胃腸炎 病毒S蛋白在重組枯草芽孢桿菌WB800內(nèi)可以被成功表達(dá)。
[0118] 4重組豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白枯草芽孢桿菌WB800的共聚焦顯微鏡觀察
[0119] 將重組枯草芽孢桿菌WB800涂片，進(jìn)行共聚焦顯微鏡（型號(hào)：ZISS LSM730)觀察， 如圖11可知：1為正?？莶菅挎邨U菌WB800芽孢；2為重組枯草芽孢桿菌WB800芽孢，呈現(xiàn) 紅色熒光；3為正常枯草芽孢桿菌WB800。
[0120] 5 口服免疫重組枯草芽孢桿菌WB800菌株機(jī)體免疫應(yīng)答水平的檢測
[0121] 空枯草芽孢桿菌WB800菌株（基因組中未整合外源基因）和表達(dá)豬傳染性胃 腸炎病毒S蛋白的重組枯草芽孢桿菌WB800菌株分別口服免疫一月齡仔豬，口服劑量為 1 X lO^fu/kg，首免一周后按相同劑量進(jìn)行二免，每周進(jìn)行血清和糞便的采集，飼養(yǎng)周期為 五周。采用間接ELISA的方法進(jìn)行TGEV特異性IgG和特異性SIgA抗體水平變化檢測。檢 測方法為：豬傳染性胃腸炎抗原包被過夜，1% BSA(牛血清白蛋白）37°C封閉2h，洗滌后加 待檢樣品37°C作用1 h，洗滌加適當(dāng)稀釋后的辣根過氧化物酶標(biāo)兔抗豬IgG或IgA抗體， 37°C lh，含四甲基聯(lián)苯胺和H202的TMB顯色液顯色后酶標(biāo)儀檢測0D450。如圖12可知：口服 重組枯草芽孢桿菌WB800菌株組仔豬血清中TGEV特異性IgG抗體與口服空枯草芽孢桿菌 WB800菌株組相比（首免后第0天除外）均顯著提高（P<0. 01，P<0. 05)。如圖13可知： 口服重組枯草芽孢桿菌WB800菌株組仔豬糞便中TGEV特異性SIgA抗體與口服空枯草芽孢 桿菌WB800菌株組相比在首免后第7天、14天和21天均顯著提高（P < 0. 01，P < 0. 05)。
[0122] 應(yīng)用
[0123] 本發(fā)明涉及表達(dá)豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV)S蛋白的重組枯草芽孢桿菌WB800菌 株，有望成為一種豬傳染性胃腸炎口服枯草芽孢桿菌基因工程疫苗；同時(shí)為開展枯草芽孢 桿菌黏膜免疫遞送活載體的研究提供了技術(shù)方案。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的整合表達(dá)質(zhì)粒plncotGSR，是由以下方法構(gòu)建而 成： I. 1枯草芽孢桿菌解淀粉酶E 5端和3端的克隆 參照已發(fā)表的枯草芽孢桿菌的amyE序列（GenBank登陸號(hào)：NZ_CM000487. 1)，設(shè)計(jì)一對(duì) 擴(kuò)增amyE 5的引物，并在上、下游引物5端分別引入NheI、HindIII酶切位點(diǎn)（下劃線為酶 切位點(diǎn)），引物序列如下： Pl ：GCTAGCATTCTCCAGTCTTCACATCGGT P2 ：AAGCTTTCTTCATCATCATTGGCATACG 設(shè)-Η對(duì)擴(kuò)增amyE 3的引物，并在上、下游引物5端分別引入KpnI、XhoI酶切位點(diǎn)（下 劃線為酶切位點(diǎn)），引物序列如下： P3 ：GGTACCATGATATCCGTTTAGGCTGGGC P4 ：CTCGAGCTTTGATGTCTTTTTGTTTGTGAA 以枯草芽孢桿菌WB800提取的基因組DNA為模板，用合成的PUP2引物PCR擴(kuò)增amyE 5及P3、P4引物擴(kuò)增amyE 3序列，PCR反應(yīng)體系均為50yL，amyE 5PCR反應(yīng)條件：95°C預(yù)變 性 5min，95°C 30sec，69°C 30sec，72°C IminJOcycles，？〗。。10min，4°C IOmin ;amnyE 3PCR 反應(yīng)條件為 95°C預(yù)變性 5min ;95°C 30sec，69°C 30sec，72°C lmin，30cycles，72°C lOmin， 4°C lOmin，將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，構(gòu)建的載體分別命名為T-amyE 5和T-amyE 3。測序后獲得具有枯草芽孢桿菌amyE 5的DNA序列SEQ ID NO. 1和具有枯草芽孢桿菌 amyE 3 的 DNA 序列 SEQ ID NO. 2。 1. 2硫酸卡那霉素抗性基因的克隆 參照已發(fā)表的硫酸卡那霉素抗性基因序列（GenBank登陸號(hào)：EU549779. 1)設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò) 增Kaf的引物，并在上游引物5端引入KpnI、HindIII酶切位點(diǎn)，下游引物5端引入KpnI酶 切位點(diǎn)（下劃線為酶切位點(diǎn)），引物序列如下： P5 ：GGTACCAAGCTTTTCAACAAACGGGCCAGTTT P6 ：GGTACCTCAAAATGGTATGCGTTTTGACA 以pMK3質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系為50 μ L，PCR反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性 5min，95°C 30sec，7rC 30sec，72°C IminjocyclesJScC 10min，4°C IOmin;將 PCR 產(chǎn)物連 接到PMD19-T載體上，構(gòu)建的載體命名為T-Kan%測序后獲得具有完整編碼區(qū)的硫酸卡那霉 素抗性基因序列SEQ ID NO. 3。 1. 3枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基因的克隆 參照已發(fā)表的枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基因序列（GenBank登陸號(hào)：NZ_CM000487. 1) 設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增被膜蛋白G基因 cotG的引物，并在上游引物5端引入與枯草芽孢桿菌amyE 53'末端15bp的同源臂序列，兩序列之間引入HindIII酶切位點(diǎn)（下劃線為酶切位點(diǎn)）；下 游引物5端引入與S蛋白基因5'末端IObp的同源臂序列，兩序列之間引入NheI酶切位點(diǎn) (下劃線為酶切位點(diǎn)），引物序列如下： P7 ：ATGATGATGAAGAGAAGCTTTTTCCCTTTCTAAATCGC P8 ：GTTTTTTCATGCTAGCTTTGTATTTCTTTTTGACTACCC 以枯草芽孢桿菌WB800提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系為50 μ L， ?〇?反應(yīng)條件：95。(：預(yù)變性5111丨11，951€3〇86(3,711€3〇86(3,72。(：1111丨111286(3,3(^7(3168， 72°C 10min，4°C IOmin ;將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，構(gòu)建的載體命名為T-cotG，測 序后獲得具有完整編碼區(qū)的枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基因序列SEQ ID NO. 4。 1. 4豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因的克隆 參照已發(fā)表的豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因序列（GenBank登陸號(hào)：KP202848)設(shè)計(jì) 一對(duì)擴(kuò)增S蛋白基因 cDNA的引物，在上游引物引入與枯草芽孢桿菌cotG 3'末端12bp的 同源臂序列，兩序列之間引入NheI酶切位點(diǎn)（下劃線為酶切位點(diǎn)）；在下游引物引入與紅 色熒光蛋白基因 RFP 5'末端12bp的同源臂序列，兩序列之間引入HindIII酶切位點(diǎn)（下 劃線為酶切位點(diǎn)），引物序列如下： P9 ：AAGAAATACAAAGCTAGCATGAAAAAACTATTTGTG PlO ：GGTGTTGTCCATAAGCTTATGGACGTGCACTTTTTCA 以豬傳染性胃腸炎病毒SHXB毒株（豬傳染性胃腸炎病毒強(qiáng)毒株）提取的總RNA為模 板，經(jīng)MLV-反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系為50 μ L，PCR反應(yīng)條 件：95Γ預(yù)變性 5min，95°C 30sec，67°C 30sec，72°C 4min，30cycles，72Γ lOmin，4Γ IOmin ; 將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，構(gòu)建的載體命名為T-S，測序后獲得具有完整編碼區(qū)的 豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因序列SEQ ID NO. 5。 1. 5紅色熒光蛋白基因的克隆 參照已發(fā)表的紅色熒光蛋白基因序列（GenBank登陸號(hào)：AB166761. 1)設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增紅 色熒光蛋白基因 RFP的引物，在上游引物引入與S蛋白基因3'末端12bp的同源臂序列，兩 序列之間引入HindIII酶切位點(diǎn)（下劃線為酶切位點(diǎn)）；在下游引物引入與枯草芽孢桿菌 amyE 35'末端12bp的同源臂序列，兩序列之間引入HindIII酶切位點(diǎn)（下劃線為酶切位 點(diǎn)），引物序列如下： PU ：GTGCACGTCCATAAGCTTATGGACAACACCGAGGAC PI2 ：GTCGACGGTACCAAGCTTCTACTGGGAGCCGGAGTG 以pDsRed-monomer-Nl質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系為50 μ L，PCR反 應(yīng)條件：95 cC 預(yù)變性 5min，95 cC 30sec，72 cC 30sec，72 cC 48sec，30cycles，72 cC 10min， 4°C IOmin ;將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，構(gòu)建的載體命名為T-RFP，測序后獲得具有 完整編碼區(qū)的紅色熒光蛋白基因序列SEQ ID NO. 6。 1. 6整合表達(dá)載體骨架pInAmyE的構(gòu)建 利用酶切連接技術(shù)，分別將SEQ ID NO. 1序列、SEQ ID NO. 3序列和SEQ ID NO. 2序列克 隆至載體P⑶NA3. 1上，獲得整合表達(dá)骨架載體pInAmyE。采用限制性內(nèi)切酶NheI、HindIII、 KpnI和XhoI，分別用雙酶切驗(yàn)證。 1. 7整合表達(dá)載體plncotGSR的構(gòu)建 以SEQ ID NO. 4序列、SEQ ID NO. 5序列和SEQ ID NO. 6序列為模板，用引物P7、P12 進(jìn)行重疊 PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50yL，PCR反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性5min，95°C 30sec， 72°C 30sec，72°C 5min，30cycles，72°C 10min，4°C IOmin ;將 PCR 產(chǎn)物回收，并使用 One Step Cloning Kit定點(diǎn)克隆試劑盒克隆至載體骨架pInAmyE上，測序后獲得整合表達(dá)載體 plncotGSR。2. -種用權(quán)利要求1所述整合表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化獲得的表達(dá)豬傳染性胃腸炎病毒S蛋 白的重組枯草芽孢桿菌。該重組枯草芽孢桿菌WB800菌株，屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)。是由以下方法轉(zhuǎn)化而成： 取60以1^枯草芽孢桿菌18800電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞與1以1^(50即/^1^)整合表達(dá)載 體plncotGSR質(zhì)?；旌霞尤腚姄舯斜?min后進(jìn)行電擊，電擊條件：22KV/cm，25 μ F， 200 Ω，電擊一次。加入ImL電擊恢復(fù)液，37°C IOOrpm孵育3h，涂布于硫酸卡那霉素抗性固 體基礎(chǔ)培養(yǎng)基LB平板，14-18h可見陽性菌落。3. -種用權(quán)利要求2所述表達(dá)豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的重組枯草芽孢桿菌WB800 菌株口服一月齡仔豬，可以刺激一月齡仔豬機(jī)體產(chǎn)生有效的TGEV特異性免疫應(yīng)答水平的 生物學(xué)應(yīng)用。動(dòng)物試驗(yàn)以及免疫檢測方法如下： 空枯草芽孢桿菌WB800菌株（基因組中未整合外源基因）和表達(dá)豬傳染性胃腸炎病毒 S蛋白的重組枯草芽孢桿菌WB800菌株分別口服免疫一月齡仔豬，口服劑量為IX IO1Yfu/ kg，首免一周后按相同劑量進(jìn)行二免，每周進(jìn)行血清和糞便的采集，飼養(yǎng)周期為五周。采用 間接ELISA的方法進(jìn)行TGEV特異性IgG和特異性SIgA水平變化檢測，檢測方法為：豬傳染 性胃腸炎抗原包被過夜，1 % BSA (牛血清白蛋白）37 °C封閉2h，洗滌后加待檢樣品37 °C作用 lh，洗滌加適當(dāng)稀釋后的辣根過氧化物酶標(biāo)兔抗豬IgG或IgA抗體，37°C lh，含四甲基聯(lián)苯 胺和H2O2的TMB顯色液顯色后酶標(biāo)儀檢測0D450。結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)豬傳染性胃腸炎病毒S蛋 白的重組枯草芽孢桿菌WB800菌株可以刺激一月齡仔豬機(jī)體產(chǎn)生有效的TGEV特異性免疫 應(yīng)答水平。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK105886523SQ201410833720
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年12月25日
【發(fā)明人】楊倩, 牟春曉, 朱立麒, 林 建
【申請(qǐng)人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)