專利名稱：一種利用芽孢桿菌制備纖維素酶的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物化學領域，具體為一種纖維素酶的制備方法。
背景技術：
多年來，生物轉化纖維素質成為有用產物一直是生物技術的重要研究領域，但在天然條件下能直接分解利用纖維素作碳源的微生物卻很少，尤其在中性條件下能分解纖維質原料的菌類，更是少有。 目前關于纖維素酶方面研究和生產的報導，大都是關于酸性條件下能分解纖維素質原料的菌類，在中性條件下的幾乎還是一片空白。中性纖維素酶市場遠景非常的好。我國是一個紡織大國，每年需要紡織用纖維素酶5萬余噸，目前中性纖維素酶主要靠進口，亟需開發(fā)成本合理、易于操作的中性纖維素酶制備方法。就生產及應用方面來說，目前國內酸性纖維素酶已經有一部分廠家正在生產，并在紡織用水洗酶上占有很大的市場，但是酸性酶并不是很適合水洗。一是與它的復合酶系組成有關，其中有效酶組分比例太小，二是在酸性條件下水洗時反污染情況相當嚴重，而中性纖維素酶就正好解決了上述的問題。中性酶可在PH值6-8的條件下使用。這個特定的PH值范圍不會損壞織物的強力。表面活性劑在這個pH值范圍是最有效的，從而節(jié)約了紡織品加工過程中的表面活性劑的使用。目前在紡織水洗酶市場上中性纖維素酶非常走俏，價格也很高，酸性水洗酶很難與其競爭，將來的發(fā)展趨勢必是中性酶，現在主要靠從國外進□。近幾年，堿性纖維素酶在洗滌劑工業(yè)上的成功應用，改變了傳統的去污方法，建立了一套新的去污機制，提高了洗滌效果，并有柔軟、增艷等作用，被洗滌劑工業(yè)稱之為一次技術革命；在日本和丹麥它已作為洗滌劑的添加劑而被廣泛使用。堿性纖維素酶可提高洗滌效果，堿性纖維素酶的去污機理人們很早就知道。但國內生產堿性纖維素酶方面仍存在空白。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對現有技術的不足，研究出一種高活性纖維素酶的生產工藝，填補了這方面的空白。本發(fā)明的另一目的是提供用該方法制備所得的纖維素酶。實現本發(fā)明上述目的的技術方案為一種利用芽孢桿菌生產纖維素酶的方法，包括步驟以芽孢桿菌為生產菌株，經過斜面培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)而得，其中發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括質量含量的淀粉0. 5-2%、豆餅粉I 5%、豆餅粉水解液8-12%、麩皮0. 3 0. 8%、無機鹽1-2%、消泡劑0-0. 3%和70-90%的水。所述芽抱桿菌優(yōu)選(BacillusCohn)DM_32。一種芽孢桿菌(Bacillus Cohn) DM-32，保藏編號為CGMCC No. 6211。保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，電話(010)64807355。保藏日期2012年6月8日。所述芽孢桿菌系發(fā)明人從土壤中分離篩選后經誘變得到的。該菌株具有如下特性DM-32菌株既可以在酵母膏、葡萄糖合成培養(yǎng)基上生長，也可以在麩皮、豆餅粉、豆餅粉水解液組成的粗培養(yǎng)基上生長，其主要代謝產物為纖維素酶。生長PH值范圍為5. 5^10. 0，生長溫度范圍為25 42°C。DM-32菌體細胞桿狀，末端方，成短或長鏈。產芽孢，芽孢橢圓形或柱形，中生或近中生。好氧型，革蘭氏陽性。DM-32在細菌培養(yǎng)基平板(牛肉膏5g，蛋白胨IOg,氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，調pH7. 8-8. 2)上的菌落特征是形態(tài)為圓形，表面光滑有光澤，邊緣整齊淺乳白色，扁平，生長迅速，該菌株鑒定為Bacillus sp.，并命名為Bacillus Cohn0其中，所述斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括質量含量的淀粉0. 3-0. 8%、蛋白胨0. 8-1. 2%、酵母粉0. 8-1. 2%、無機鹽I. 5-1. 8%、羧甲基纖維素鈉0. 4-0. 6%和90-95%的水。 其中，所述斜面培養(yǎng)的溫度為35_37°C，培養(yǎng)的時間為3-4天。其中，所述振蕩培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括質量含量的淀粉0. 4-0. 6%、蛋白胨0. 8-1. 2%、酵母粉0. 8-1. 2%、麩皮0. 3-0. 8%、無機鹽1-2%和90-95%的水。其中，所述振蕩培養(yǎng)的溫度為35_37°C，培養(yǎng)時間24-48小時，振蕩培養(yǎng)的裝置轉速為 120-200r/min。其中，所述淀粉為玉米淀粉、甘薯淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉中的一種或一種以上。其中，所述無機鹽為氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、硫酸鈉中的一種或一種以上。其中，所述豆餅粉水解液是按照質量比例，將10-18%的豆餅粉與0. 5-1. 5%的氧化鈣或氫氧化鈣、余量的水混合，在溫度110-130°C下處理0. 5-2小時獲得的。其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的接種量為0. 1-15%，培養(yǎng)的溫度為33-37 °C，通風量為0-0. 8vvm (通入空氣體積/發(fā)酵液體積/min)，培養(yǎng)時間為24-120小時，發(fā)酵的壓力為
0.02-0. 07MPa。本發(fā)明提出的方法制得的纖維素酶。本發(fā)明所述的纖維素酶在紡織品加工中的應用。本發(fā)明的有益效果為①本發(fā)明提出的方法得到的是在pH中性及堿性條件下均適用的纖維素酶，而國內現在一般生產的都是酸性條件下適用的纖維素酶，中性及堿性纖維素酶在水洗酶應用方面明顯優(yōu)于酸性纖維素酶。②使用的菌種為芽孢桿菌，和目前國內一般采用木霉菌作為纖維素酶生產菌種不同。該方法所使用的芽孢桿菌是一種易于保存、擴增、繁殖快、適合大規(guī)模生產的菌種，可以縮短生產周期。③采用的產酶培養(yǎng)基和一般常規(guī)的產酶培養(yǎng)基不同。一般產纖維素酶的培養(yǎng)基中都要有纖維類原料碳源作為產酶誘導底物。纖維類原料成本昂貴，而且在投料、物料消毒、大規(guī)模生產等方面使用起來都有諸多不便。而該方法采用淀粉類原料作為碳源，成本低，而且在運輸、投料、消毒等方面都優(yōu)于纖維類原料。
④培養(yǎng)基中添加豆餅粉水解液作為可溶性氮源，成本低、制作及使用方便、氮利用率高。一般生產纖維素酶培養(yǎng)基用蛋白胨或玉米漿作為可溶性氮源，成本很高。⑤該方法所制備的纖維素酶成本低、活力高、對pH適用范圍廣穩(wěn)定性好、生產周期短。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不應用來限制本發(fā)明的范圍。CMC酶活的測定底物使用1%羧甲基纖維素鈉(CMC)，加入適當稀釋倍數的酶液， 在50°C、80r/min、pH4 10下反應30分鐘，測定酶解產生的葡萄糖量。一個CMC酶活力單位定義為標準反應條件下每小時每毫升酶液生成一毫克葡萄糖的酶量，以u/ml表示。實施例中，所用蛋白胨購自天津市大茂化學試劑廠，分析純；消泡劑為泡敵，購自濟南國邦化工有限公司，PPG型工業(yè)級；可溶性淀粉購自天津市天力化學試劑有限公司，分析純。實施例I :三角瓶發(fā)酵制備纖維素酶I、斜面培養(yǎng)在無菌操作條件下，將芽孢桿菌(Bacillus Cohn，保藏編號CGMCCNo. 6211)菌株用接種環(huán)(內徑2. 5mm,取量10微升，下同)挑一環(huán)接入試管斜面培養(yǎng)基中，35°C培養(yǎng)3天；斜面培養(yǎng)基中各成分的質量百分比為可溶性淀粉0. 5%蛋白胨I. 0%酵母粉
I.0%氯化鈉0. 5%磷酸氫二鉀0. 1%，CMC (羧甲基纖維素鈉)0. 5%，碳酸鈉1%，瓊脂2. 0% ;其余為水。2、振蕩培養(yǎng)在無菌條件下，將斜面菌種用接種環(huán)挑兩環(huán)接入三角瓶的種子培養(yǎng)基中，置搖床上振蕩培養(yǎng)36小時，培養(yǎng)溫度36°C，搖床轉速為150r/min。種子培養(yǎng)基中各成分的質量百分比為可溶性淀粉0. 5%蛋白胨I. 0%酵母粉I. 0%麩皮0. 5%氯化鈉0. 5%磷酸氫二鉀0. 1%碳酸鈉1% ;其余為水。3、然后再在裝液量為IOOml的500ml三角瓶中用芽孢桿菌做菌種發(fā)酵生產中性纖維素酶，接種量為0. 1%體積比，發(fā)酵溫度0-72小時為35-37°C，72-120小時為33_35°C，搖床轉速為180-200r/min。其中發(fā)酵培養(yǎng)基中各成分的質量百分比為玉米淀粉1%豆餅粉2%豆餅粉水解液10%麩皮0. 5%氯化鈉0. 5%，磷酸氫二鉀0. 1%碳酸鈉1%，其余為水。4、其中，豆餅粉水解液為豆餅粉在堿性條件下經高溫蒸煮后獲得，其組分為豆餅粉14%，石灰1%, 7jC 85%，處理條件為120-122。。，I小時。5、酶活力測定測定結果表明，pH6. (T9. 0時，該纖維素酶活力最高，9.0時為459. 2u/ml, pH值6. 0時為382. 5u/ml。pH為5. 0和10. 0時，其活力下降至最高值的80%。PH為4. 0時，活力下降至最高值的50%。實驗結果表明，本發(fā)明制備得到的纖維素酶在中性和堿性條件下均有很高活力。實施例2 IOL發(fā)酵罐制備纖維素酶I、斜面培養(yǎng)在無菌操作條件下，將芽孢桿菌(Bacillus Cohn，保藏編號CGMCCNo. 6211)菌株用接種環(huán)挑一環(huán)接入試管斜面培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3天；斜面培養(yǎng)基中各成分的質量百分比為可溶性淀粉0. 3%、蛋白胨0. 8%、酵母粉0. 8%、氯化鈉0. 4%、磷酸氫二鉀
0.1%、CMC0. 5%、碳酸鈉1%、瓊脂2. 0%，其余為水。2、振蕩培養(yǎng)在無菌條件下，將斜面菌種用接種環(huán)挑兩環(huán)接入三角瓶的種子培養(yǎng)基中，置搖床上振蕩培養(yǎng)36小時，培養(yǎng)溫度36°C，搖床轉速為150r/min。種子培養(yǎng)基中各成分的質量百分比為可溶性淀粉0. 4%、蛋白胨I. 0%、酵母粉0. 8%、麩皮0. 5%、氯化鈉0. 4%、磷酸氫二鉀0. 1%、碳酸鈉0. 6%，其余為水。3、然后在裝料量為6L的IOL不銹鋼標準發(fā)酵罐中用芽孢桿菌做菌種發(fā)酵生產纖維素酶，接種量為I. 5%體積比，發(fā)酵溫度在0-72小時之內為35-37°C，然后在72-120小時為33-35°C，攪拌轉速為200r/min，通風為0. 7vvm,罐壓為0. 05MPa。其中發(fā)酵培養(yǎng)基中各成分的質量百分比為玉米淀粉0. 5%、豆餅粉5%、豆餅粉水解液8%、麩皮0. 3%、氯化鈉0. 5%、磷酸氫二鉀0. 1%、碳酸鈉I. 2%、泡敵0. 01%，其余為水。發(fā)酵每4小時取樣測定各種指標。4、其中，豆餅粉水解液為豆餅粉在堿性條件下經高溫蒸煮后獲得，其組分為豆餅粉14%，石灰1%，水85%，處理條件為120°C，蒸煮I小時。 5、酶活力測定結果表明，pH6. 5時，該纖維素酶活力為402. Iufml0 pH8. 5時，該纖維素酶活力為446. 2u/ml。pH6. 0 9. 0時,該纖維素酶活力最高。實施例3 30m3發(fā)酵罐制備纖維素酶I、斜面培養(yǎng)在無菌操作條件下，將芽孢桿菌(Bacillus Cohn,保藏編號CGMCCNo. 6211)菌株用接種環(huán)挑一環(huán)接入試管斜面培養(yǎng)基中，35-37°C培養(yǎng)3_4天；斜面培養(yǎng)基中各成分的質量百分比為可溶性淀粉0. 8%、蛋白胨I. 2%、酵母粉I. 2%、氯化鈉0. 6%、磷酸氫二鉀0. 2%、CMC0. 6%、碳酸鈉I. 2%、瓊脂2. 0%，其余為水。2、振蕩培養(yǎng)在無菌條件下，將斜面菌種用接種環(huán)挑兩環(huán)接入三角瓶的種子培養(yǎng)基中，置搖床上振蕩培養(yǎng)36小時，培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉速為150r/min。種子培養(yǎng)基中各成分的質量百分比為可溶性淀粉0. 6%、蛋白胨I. 2%、酵母粉I. 2%、麩皮0. 8%、氯化鈉0. 3%、磷酸氫二鉀0. 1%、碳酸鈉0. 6%，其余為水。3、種子罐擴培3m3種子罐，裝液量為I. 8m3,接種量為0. 2%，培養(yǎng)溫度35_37°C，通風量為0. 5vvm，攪拌轉速180r/min，培養(yǎng)周期24小時。培養(yǎng)基中各成分的質量百分比為可溶性淀粉0. 5%蛋白胨I. 0%酵母粉I. 0%麩皮0. 5%氯化鈉0. 5%磷酸二氫鉀0. 1%碳酸鈉1%;其余為水。4、然后在裝液量為ISm3的30m3不銹鋼標準發(fā)酵罐中用芽孢桿菌發(fā)酵生產纖維素酶，接種量為10%體積比，發(fā)酵溫度為0-72小時為36°C，72-120小時為35°C，攪拌轉速為150r/min，通風為0. 8vvm，罐壓為0. 07MPa。其中發(fā)酵培養(yǎng)基中各成分的質量百分比為甘薯淀粉1%、豆餅粉2%、豆餅粉水解液10%、麩皮0. 5%、氯化鈉0. 5%、磷酸氫二鉀0. 1%、碳酸鈉1%、泡敵0.01%，其余為水。發(fā)酵每4小時取樣測定各種指標。發(fā)酵結束后，經過壓濾濃縮得到纖維素酶成品。其中，豆餅粉水解液為豆餅粉在堿性條件下經高溫蒸煮后獲得，其組分為豆餅粉14%，氫氧化鈣1%，水85%，處理條件為122°C，蒸煮I小時。5、酶活力測定結果表明，pH6. 5時，該纖維素酶活力為394. 5u/ml,pH8. 5時，該纖維素酶活力為436. lu/mlo pH6. 0 9. 0時,該纖維素酶活力最高。
權利要求
1.一種利用芽孢桿菌生產纖維素酶的方法，包括步驟以芽孢桿菌為生產菌株，經過斜面培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)而得，其中發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括質量含量的淀粉0. 5-2%、豆餅粉I 5%、豆餅粉水解液8-12%、麩皮0. 3 0. 8%、無機鹽1-2%、消泡劑0-0. 01%和70-90%的水。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括質量含量的淀粉0. 3-0. 8%、蛋白胨0. 8-1. 2%、酵母粉0. 8-1. 2%、無機鹽I. 5-1. 8%、羧甲基纖維素鈉0.4-0. 6% 和 90-95% 的水。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述振蕩培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括質量含量的淀粉 0. 4-0. 6%、蛋白胨 0. 8-1. 2%、酵母粉 0. 8-1. 2%、麩皮 0. 3-0. 8%、無機鹽 1-2% 和 90-95% 的水。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述振蕩培養(yǎng)的溫度為35-37°C，培養(yǎng)時間24-48小時，振蕩培養(yǎng)的裝置轉速為120-200r/min。
5.如權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述淀粉為玉米淀粉、甘薯淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉中的一種或一種以上。
6.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述豆餅粉水解液是按照質量比例，將10-18%的豆餅粉與0. 5-1. 5%的氧化鈣或氫氧化鈣、余量的水混合，在溫度110-130°C下處理0. 5-2. 0小時獲得的。
7.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)的接種量為體積比0.1-15%，培養(yǎng)的溫度為33-37 °C，通風量為0-0. 8vvm,培養(yǎng)時間為24-120小時，發(fā)酵的壓力為0.02-0. 07MPa。
8.一種芽孢桿菌，(Bacillus Cohn) DM-32，其保藏編號為 CGMCC No. 6211。
9.權利要求1-7任一所述的方法制得的纖維素酶。
10.權利要求9所述纖維素酶在紡織品加工中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用芽孢桿菌生產纖維素酶的方法，其包括步驟以芽孢桿菌為生產菌株，經過斜面培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)而得，其中發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括質量含量的淀粉0.5-2%、豆餅粉1-5%、豆餅粉水解液8-12%、麩皮0.3-0.8%、無機鹽1-2%、消泡劑0-0.3%。本方法得到的是在pH中性及堿性條件下高活性的纖維素酶，在水洗酶應用方面明顯優(yōu)于酸性纖維素酶，本發(fā)明的方法采用淀粉類原料作為碳源，其在運輸、投料、消毒等方面都優(yōu)于纖維類原料；以豆餅粉水解液作為可溶性氮源，成本低、制作及使用方便。本發(fā)明的方法所制備的纖維素酶成本低、活力高、對pH適用范圍寬穩(wěn)定性好、生產周期短。
文檔編號C12N9/42GK102766615SQ201210256710
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月20日 優(yōu)先權日2012年7月20日
發(fā)明者代淑梅, 李秋園 申請人:唐山市冀東溶劑有限公司