ll efficacy and prolonged effect in hemophilic mice models, 〃121(Il)BLOOD 2108-16(2013)。美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)20130137638 (Bolt)公開了 PEG與具有截短的B-結(jié) 構(gòu)域的FVIII變體連接。FVIII分子通過截短的B-結(jié)構(gòu)域中的0-連接寡糖與親水性聚合 物共價(jià)綴合。美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)20120322738(Behrens)公開了將聚合物與FVIII綴合 的方法，包括通過B-結(jié)構(gòu)域中的0-連接多糖將PEG與FVIII共價(jià)綴合。如在本申請(qǐng)中所 使用的，PEG化的FVIII包括通過任意方法PEG化，包括上文中討論的本領(lǐng)域公知的不同方 法。
[0041] 國(guó)際單位，IU:國(guó)際單位或IU是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)的FVIII血液凝 血活性（效能）檢測(cè)結(jié)果的單位。標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定包括根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中描述的一步法測(cè)定。 參見例如，Lee 等，An effect of predilution on potency assays of Factor Vlll concentrates, 30THR0MB0SIS RESEARCH 511-519(1983)。一步法測(cè)定是基于活化的部分凝 血酶原時(shí)間（aPTT)。在存在因子IXa、鈣和磷脂的條件下，F(xiàn)VIII作為因子X酶促轉(zhuǎn)化為因 子Xa的輔因子。在這項(xiàng)測(cè)定中，將經(jīng)過稀釋的待測(cè)樣品在37°C下與缺乏FVIII的血漿底物 和aPTT試劑的混合物孵育。凝塊形成所花費(fèi)的時(shí)間（秒）與FVIII = C濃度的對(duì)數(shù)之間存在 負(fù)相關(guān)。通過對(duì)待測(cè)物不同稀釋物的凝塊時(shí)間與由使用已知活性的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的一系列稀釋 物構(gòu)建的曲線進(jìn)行比較內(nèi)插確定位置樣品的活性水平并以國(guó)際單位每mL(IU/mL)報(bào)告。顯 色測(cè)定也是有用的，其可以市售購(gòu)買，包括在商品名C0ATEST SP FVIII(購(gòu)自Chromogenix AB, Molndal, Sweden)進(jìn)行的測(cè)定。顯色測(cè)定法由兩個(gè)連續(xù)步驟組成，其中顏色的強(qiáng)度與 FVIII活性成正比。在第一步中，在存在最佳量的鈣離子和磷脂的條件下，通過FIXa與其輔 因子FVIIIa將因子X活化成FXa。存在過量的因子X，以使得因子X的活化速率僅依賴于 FVIII的量。在第二步中，因子Xa水解顯色底物以產(chǎn)生發(fā)色團(tuán)并在405nm下用光度計(jì)測(cè)定 顏色強(qiáng)度。計(jì)算未知效能并使用斜率比統(tǒng)計(jì)法確認(rèn)測(cè)定的有效性。以國(guó)際單位每mL(IU/ mL)報(bào)告活性。
[0042] 冷動(dòng)干燥、冷凍、凍干："冷凍-干燥"，除非其出現(xiàn)的上下文另有明示，將用于表示 凍干工藝的一部分，其中藥物配制品的溫度在一次和二次干燥相升高以驅(qū)動(dòng)水脫離該配制 品。凍干工藝的"冷凍"步驟是在一次和二次干燥階段之前出現(xiàn)的那些步驟。除非另有明 示，"凍干"指凍干的整個(gè)工藝，包括冷凍步驟和冷凍干燥步驟。
[0043] 在本發(fā)明的某些方面中，可以采用本領(lǐng)域公知的方法學(xué)將包含rFVIII和 BDD-rFVIII的制劑凍干，其包括包含PEG化的FVIII和BDD-rFVIII的制劑。例如，美國(guó)專 利號(hào)5, 399, 670和5, 763, 401描述了用于生產(chǎn)穩(wěn)定性增加的凍干FVIII制劑的方法學(xué)，可 以使用該方法生產(chǎn)本申請(qǐng)所述的凍干制劑。凍干工藝具有冷凍相、一次干燥相和二次干燥 相。在冷凍相，存在退火步驟。冷凍相在溫度不高于-40°C下進(jìn)行，退火步驟在溫度不高 于-15°C下進(jìn)行，一次干燥在溫度不高于0°C下進(jìn)行和二次干燥在溫度不高于30°C下進(jìn)行。 一旦設(shè)定溫度達(dá)到冷凍溫度、退火溫度、最終冷凍溫度、一次干燥溫度和二次干燥溫度，則 可以將該溫度保持一個(gè)合理的時(shí)間段，此時(shí)間段是本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮所涉及的特定蛋白 樣品易于理解的，如一小時(shí)、兩小時(shí)、三小時(shí)或三小時(shí)以上。
[0044] 退火：術(shù)語(yǔ)"退火"用于指示凍干過程中藥物配制品凍干工藝中先于配制品冷 凍-干燥的一個(gè)步驟，在該步驟中配制品的溫度由較低溫度上升至較高溫度，然后在一段 時(shí)間后再次冷卻。
[0045] 填充劑（bulking agent):對(duì)于在本申請(qǐng)中的目的而言，填充劑向"蛋糕"或藥物配 制品在凍干后殘留的固體物質(zhì)提供結(jié)構(gòu)的那些化學(xué)實(shí)體并保護(hù)其不出現(xiàn)塌陷?？山Y(jié)晶的填 充劑指如本申請(qǐng)所述的能夠在凍干過程中結(jié)晶的填充劑。
[0046] 表面活性劑：如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語(yǔ)"表面活性劑"包括"非離子表面活性 劑"，如聚山梨醇酯包括聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80、泊洛沙姆如泊洛沙姆184或188、 普朗尼克多元醇（以商品名PLUR0NIC銷售，由BASF Wyandotte Corporation生產(chǎn)）以及 其他乙烯/聚乙烯嵌段共聚物。非離子表面活性劑在加工和儲(chǔ)存期間通過減少界面相互作 用和避免蛋白倍吸附穩(wěn)定rFVIII。使用非離子表面活性劑使得制劑暴露于剪切力和表面應(yīng) 力而不會(huì)造成rFVIII變性。本申請(qǐng)公開的制劑包括具有一種或多種非離子表面活性劑的 制劑，本申請(qǐng)中作為示例的是具有聚山梨醇酯的制劑，如聚山梨醇酯20(以商品名吐溫20 銷售）或聚山梨醇酯80(以商品名吐溫80銷售）。
[0047] 滲透壓：如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語(yǔ)"滲透壓"指溶液濃度的測(cè)定，其定義為每 kg溶劑的溶質(zhì)的滲透壓數(shù)量?？梢酝ㄟ^加入一種或多種穩(wěn)定劑如糖或糖醇包括甘露醇、右 旋糖、葡萄糖、海藻糖和/或蔗糖達(dá)到所需的滲透壓水平。對(duì)適宜提供滲透壓的其他穩(wěn)定 劑的描述參見如藥物賦形劑手冊(cè)（handbook of Pharmaceutical Excipients)(第四版， Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, Science&Practice Publishers)或雷 明頓：藥物科學(xué)與實(shí)踐（Remingtons:The Science and Practice of Pharmacy)(第九版， Mack Publishing Company)。本申請(qǐng)中所述的制劑的滲透壓范圍為從約240m0sm/kg至約 450m0sm/kg、或約 750m0sm/kg、或約 1000m0sm/kg，或者從約 270m0sm/kg 至約 425m0sm/kg， 或者從約 300m0sm/kg 至約 410m0sm/kg。
[0048] 當(dāng)適用時(shí)，以單數(shù)使用的術(shù)語(yǔ)還將包括復(fù)數(shù)并且反之亦然。除非另有明示或者"一 個(gè)或多個(gè)"的使用明顯不恰當(dāng)，本申請(qǐng)中使用的"一個(gè)"指"一個(gè)或多個(gè)"。除非另有明示， "或"的使用指"和/或"。"包括"、"包含"、"含有"可以互換使用并且并非旨在限制。術(shù)語(yǔ) "如"亦并非旨在限制。例如，術(shù)語(yǔ)"包括"應(yīng)指"包括，但不限于"。而且，當(dāng)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施 方式的描述使用術(shù)語(yǔ)"包含"時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在一些特定情況下，該一個(gè)或多個(gè) 實(shí)施方式可以使用"基本上由……組成"和/或"由……組成"的語(yǔ)言替代性描述。
[0049] 如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語(yǔ)"約"指所提供的單位值的+/-10%。如在本申請(qǐng)中所 使用的，術(shù)語(yǔ)"基本上"指顯示出所關(guān)注的特征或性質(zhì)的整體或大約程度的實(shí)質(zhì)性狀況。生 物領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解生物和化學(xué)現(xiàn)象很少（若有）達(dá)到或避免絕對(duì)結(jié)果，因?yàn)楹?多變量影響生物和化學(xué)組分的檢測(cè)、生產(chǎn)和貯存，還因?yàn)樵谏锖突瘜W(xué)組分和物質(zhì)的檢測(cè)、 生產(chǎn)和貯存中使用的儀器和設(shè)備存在固有誤差。因此在本申請(qǐng)中使用術(shù)語(yǔ)基本上以捕捉在 很多生物和化學(xué)現(xiàn)象中可能固有的完整性缺乏。
[0050] 本申請(qǐng)所述的本發(fā)明的制劑可能以以重量計(jì)的組分濃度的形式描述，如重量百分 率或摩爾濃度。還應(yīng)理解本發(fā)明還包含這些制劑的凍干配制品，當(dāng)其在適宜稀釋劑如生理 鹽水或水中重構(gòu)時(shí)用于施用或以所報(bào)告的濃度貯存。本申請(qǐng)中的范圍包括范圍的端點(diǎn)。
[0051] 除非另有明示，百分率術(shù)語(yǔ)表示重量/體積百分率和溫度以攝氏度表示。
[0052] 組合物組分
[0053] 本發(fā)明的FVIII組合物可以包括穩(wěn)定劑、緩沖劑、氯化鈉、鈣鹽和有利地其他賦形 劑。已對(duì)這些賦形劑進(jìn)行了選擇以便使得FVIII在凍干配制品和/或液體配制品中的穩(wěn)定 性最大化。
[0054] 在本組合物中使用的填充劑優(yōu)選地選自下組：甘露醇、甘氨酸和丙氨酸。甘露醇、 甘氨酸或丙氨酸可以以1-5%、2-3 %和2. 2-2. 6 %的量存在?？梢詫⒏拾彼徇x定為填充劑。 涵蓋不含填充劑的組合物。
[0055] 在本組合物中使用的穩(wěn)定劑選自下組：糖或糖醇，包括不限于蔗糖、甘露醇、右旋 糖、葡萄糖和海藻糖。這些試劑在組合物中以0. 5-10 %、1-8 %、2-7 %、3-6 %、4-5 %、1-5 %、 1-4%、1-3 %或1-2 %的量存在。在含有填充劑的組合物中，蔗糖是優(yōu)選的穩(wěn)定劑，其以 1-3%的量存在。在不含填充劑的組合物中，可以選擇約8%的量的蔗糖或海藻糖作為穩(wěn)定 劑。這些糖或糖醇還具有冷凍保護(hù)劑的功能。
[0056] 此外，在某些本發(fā)明組合物中存在緩沖劑。緩沖劑可能是有用的，例如在進(jìn)行凍干 的FVIII制劑中，因?yàn)閾?jù)信凍干過程中的pH迀移可能會(huì)對(duì)FVIII造成不良影響。緩沖劑可 以是具有作為緩沖物能力的任意生理上可接受的化學(xué)實(shí)體或化學(xué)實(shí)體的組合，包括組氨酸 和MOPS(3-(N-嗎啉基）丙磺酸）?？梢赃x擇約20mM的量的組氨酸作為緩沖劑。
[0057] 為了保持FVIII的活性，本發(fā)明的組合物還可以包括鈣或能夠與FVIII相互作用 并保持其活性的其他二價(jià)陽(yáng)離子，據(jù)推測(cè)其是通過保持FVIII的重鏈與輕鏈的結(jié)合保持其 活性?？梢允褂肐mM和5mM之間的鈣鹽。鈣鹽可以是氯化鈣，但也可以是其他鈣鹽如葡糖醛 酸鈣、葡乳醛酸鈣或葡庚糖酸鈣。本發(fā)明的FVIII組合物還可以包括表面活性劑，特別是選 自下組的非離子表面活性劑：聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80、泊洛沙姆包括泊洛沙姆184 或188、普朗尼克多元醇（以商品名PLUR0NIC銷售，由BASF Wyandotte Corporation生產(chǎn)） 以及其他乙烯/聚乙烯嵌段共聚物。表面活性劑可以是約SOppm的量的聚山梨醇酯80。
[0058] 在本組合物中使用的FVIII可以與生物相容性聚合物如PEG共價(jià)結(jié)合。如在本 申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語(yǔ)"聚乙二醇"或"PEG"可以互換使用并且包括任意水溶性聚（環(huán)氧乙 烷）。PEG包括下述結(jié)構(gòu)"_(0CH2CH2)n-"，其中（η)為2至4000。如在本申請(qǐng)中所使用的， 根據(jù)末端的氧是否被取代，PEG還包括"-CH2CH2-0(CH2CH20)n-CH2CH2_"和"-(0CH2CH2) n〇-"。術(shù)語(yǔ)"PEG"包括具有不同末端或"封端"基團(tuán)的結(jié)構(gòu)，例如不限于羥基或C1-20烷氧 基基團(tuán)如甲氧基。術(shù)語(yǔ)"PEG"還指包括大多數(shù)，亦即大于50%的-0CH2CH2-重復(fù)亞單位的 聚合物。對(duì)于特定形式，PEG可以是任意數(shù)量的各種分子量，以及結(jié)構(gòu)或幾何形狀，例如支 鏈、線性、叉型和多功能型。如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語(yǔ)"PEG化"指一種經(jīng)由其將聚乙二 醇（PEG)與分子如蛋白共價(jià)結(jié)合的過程。當(dāng)將官能團(tuán)如生物相容性聚合物描述為被活化 時(shí)，則所述官能團(tuán)可容易地與另一個(gè)分子上的親電子體或親核體反應(yīng)。
[0059] 在本申請(qǐng)的綴合物中使用的生物相容性聚合物可以是本申請(qǐng)中討論的或現(xiàn)有技 術(shù)中已知的任意聚合物。對(duì)生物相容性聚合物進(jìn)行選擇以提供所需的改進(jìn)的藥代動(dòng)力學(xué)。 例如，對(duì)所述聚合物的特性、尺寸和結(jié)構(gòu)進(jìn)行選擇，以改善FVIII的循環(huán)半衰期或者在無不 可接受的活性降低下降低FVIII的抗原性。聚合物可以包括PEG。例如，所述聚合物可以是 末端以封端部分封端的聚乙^醇，如羥基、烷氧基、取代的烷氧基、稀氧基、取代的稀氧基、 炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基和取代的芳氧基。在一些實(shí)施方式中，所述聚合物可以包括 甲氧基聚乙二醇如具有尺寸范圍從3kD至200kD的甲氧基聚乙二醇。
[0060] 所述聚合物可以具有反應(yīng)性部分。例如，所述聚合物可以具有能夠與功能性FVIII 多肽上的游離半胱氨酸反應(yīng)以形成共價(jià)鍵的巰基反應(yīng)性部分。此類巰基反應(yīng)性部分包括硫 醇、三氟甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯、氮丙啶、環(huán)氧乙烷、S-吡啶基或馬來酰亞胺部分。所述聚 合物可以是線性的并在一個(gè)末端包括"封端"，其對(duì)巰基（如甲氧基）和另一個(gè)末端的巰基 反應(yīng)性部分不具有強(qiáng)烈的反應(yīng)性。綴合物可以包括具有尺寸范圍從5kD至64kD的PEG-馬 來酰亞胺?；蛘?，所述聚合物可以具有胺基反應(yīng)性部分如琥珀酰亞胺丙酸酯、琥珀酰亞胺丁 酸酯、苯并三唑碳酸酯、羥基琥珀酰亞胺、醛如丙醛、丁醛、乙縮醛、哌啶酮、甲基酮等（參見 例如美國(guó)專利 7, 199, 223 (Bossard))。
[0061] FVIII可以通過所述聚合物與FVIII的糖類部分的綴合與生物相容性聚合物綴 合。參見美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)20110112028 (Turecek等）。FVIII可以通過水溶性聚合物 與FVIII的氧化的糖類部分綴合與水溶性聚合物綴合。在一些實(shí)施方式中，水溶性聚合物 選自下組：PEG、聚唾液酸（"PSA"）和右旋糖酐。在又一個(gè)方面，活化的水溶性聚合物選自 下組：PEG-酰肼、PSA-肼和醛基-活化的右旋糖酐。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述糖類部分 是通過在含有NaKM的緩沖液中孵育氧化的。
[0062] 在本發(fā)明中使用的適宜FVIII蛋白與特定的已知氨基酸序列具有同源性。例如， 在本發(fā)明中使用的適宜FVIII變體是與已知的FVIII氨基酸序列例如與全長(zhǎng)FVIII (SEQ ID N0:1)或 BDD-FVIII(SEQ ID N0:3)的氨基酸序列具有至少約 70、71、72、73、74、75、 76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99 % 同源性的變體。本發(fā)明中還使用與已知的FVIII序列有限定的序列差異的基因變體，如 當(dāng)與天然、已知的或?qū)φ招蛄腥缛L(zhǎng)FVIII(SEQ ID N0:1)或BDD-FVIII(SEQ ID N0:3) 的氨基酸序列比較時(shí)，包含在氨基酸序列中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1-10、1-5、2-6 或3-8個(gè)不同的氨基酸序列的FVIII分子。在本發(fā)明中還使用等位基因變體。FVIII 等位基因變體的示例是在美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2010/0256062 (Howard等）；Howard 等，''African-Americans Express Multiple Haplotypic Forms of the Wildtype Factor VIII(FVUl)Protein:A Possible Role for Pharmacogenetics in FVIII Inhibitor Development ? "Blood, Vol. 104, 2004, Abstract 384;和 Vicl，K.R.等，"Inhibitors of Factor VIII in Black Patients with Hemophilia, ^The New England Journal of Medicine, Vol. 360, 2009, pp. 1618-27中公開的那些。等位基因變體包括具有氨基酸取代 的那些如在位置484使用組氨酸取代精氨酸（R484H)、在位置776使用甘氨酸取代精氨酸 (R776G)、在位置1241使用谷氨酸取代天冬氨酸（D1241E)以及在位置2238使用纈氨酸取 代甲硫氨酸（M2238V)。命名氨基酸取代使用的編碼系統(tǒng)基于本申請(qǐng)中的SEQ ID N0:2。
[0063] 用于比較核苷酸和氨基酸序列的比對(duì)方法是本領(lǐng)域所熟知的。本發(fā)明的比 對(duì)可以使用適宜方法檢測(cè)，包括使用Smith和Waterman，Adv. Appl. Math2:482 (1981)， 的局部同源性算法（BESTFIT)，其可以進(jìn)行用于比較的序列最佳比對(duì)；使用Needleman and Wimsch, J. Mol. Biol. 48:443-53 (1970)的同源性比對(duì)算法（GAP);或者使用 Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)的用于相似性方法 (Tfasta和Fasta)的研究?？梢允褂眠@些算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行進(jìn)行這些算法，包括但 不限于：在 Intelligenetics, Mountain View, CaliforniaPC/ 基因程序中的 CLUSTAL， 在 Wisconsin 遺傳學(xué)軟件包，第 8 版（來自 Genetics Computer Group ( GCG? programs (Accelrys, Inc.，San Diego, CA))中的 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA。 CLUSTAL 程序由 Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988) ;Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(19