多重核酸合成的組合物和方法
【專利說明】多重核酸合成的組合物和方法
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時專利申請第61/792, 245號的權(quán)益 和優(yōu)先權(quán)，其通過引用全文納入本文。
[0003] 關(guān)于序列表
[0004] 本說明書包括所附序列表，其包括創(chuàng)建于2014年3月13日，名為 〃127662-014001_ST25. txt〃、大小為2. 628字節(jié)的文件，其內(nèi)容通過引用全文納入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明的方法和組合物涉及核酸組裝，并且具體地涉及高保真、多重核酸組裝反 應(yīng)。
[0006] 背景
[0007] 重組和合成核酸在研究、工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)學中有許多應(yīng)用?？梢允褂弥亟M和合成核 酸來表達和獲得大量的多肽，包含酶、抗體、生長因子、受體和其它可用于多種醫(yī)學、工業(yè)或 農(nóng)業(yè)目的的多肽。也可以使用重組和合成核酸來產(chǎn)生遺傳修飾的生物體，包含修飾的細菌、 酵母、哺乳動物、植物和其它生物體。遺傳修飾的生物體可以用于研究（例如，疾病的動物 模型、理解生物過程的工具等）、工業(yè)（例如，作為蛋白表達的宿主生物體、用于產(chǎn)生工業(yè)產(chǎn) 物的生物反應(yīng)器、環(huán)境補救的工具、分離或修飾具有工業(yè)應(yīng)用的天然化合物等）、農(nóng)業(yè)（例 如，具有增加的產(chǎn)率或增加的對疾病或環(huán)境壓力的抗性的經(jīng)修飾作物）和用于其它應(yīng)用。 重組和合成核酸也可以用作治療組合物（例如，用于修飾基因表達、用于基因治療等）或用 作診斷工具（例如，病癥的探針等）。
[0008] 已經(jīng)開發(fā)了多種技術(shù)用于修飾存在的核酸（例如，天然存在的核酸）來產(chǎn)生重組 核酸。例如，可以使用核酸擴增、誘變、核酸酶消化、連接、克隆和其它技術(shù)的多種組合來產(chǎn) 生許多不同的重組核酸。經(jīng)常使用化學合成的多核苷酸作為用于核酸擴增、誘變和克隆的 引物或銜接子。
[0009] 也發(fā)展了用于從頭核酸組裝的技術(shù)，其中制備（例如，化學合成）和組裝核酸來 產(chǎn)生較長的感興趣的靶核酸。例如，已經(jīng)開發(fā)了不同的多重組裝技術(shù)用于將寡核苷酸組裝 成能用于研究、工業(yè)、農(nóng)業(yè)和/或醫(yī)學的較大的合成核酸。因此，需要高保真、低成本的合成 多核苷酸的方法。
[0010] 具體地，當前大量申請重點關(guān)注在化學合成多核苷酸，包括來自直接基因組序列 數(shù)據(jù)的合成克隆合成法、大基因庫合成法和全合成基因組合成法。多核苷酸合成領(lǐng)域的主 要目的是快速廉價地合成大量多核苷酸。多核苷酸合成成本的主要部分是進行多核苷酸合 成反應(yīng)的試劑成本。為了降低該成本，反應(yīng)可以小體積進行，例如在微流體中進行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的方面涉及產(chǎn)生至少一種靶核酸的方法。在本發(fā)明的一些方面，所述方法 允許在單一反應(yīng)體積中合成多種不同靶分子。
[0012] 在一個方面，提供生成具有預定序列的至少一種靶核酸的方法。所述方法包括（a) 提供具有第一多個突出端的多個雙鏈錨定寡核苷酸；(b)提供具有第二多個突出端的多個 雙鏈構(gòu)建寡核苷酸，其中所述第二多個突出端設(shè)計為與所述第一多個突出端互補；（c)雜 交并連接所述錨定寡核苷酸和所述構(gòu)建寡核苷酸；和d)任選重復步驟（a)-(c)，從而產(chǎn)生 所述至少一種靶核酸。在一些實施方式中，所述第一多個突出端設(shè)計為彼此之間相對相互 正交。所述第二多個突出端也可設(shè)計為彼此之間相對相互正交。在某些實施方式中，所述 錨定寡核苷酸或至少多種錨定寡核苷酸連接至支持物。所述支持物可為固體，例如珠。莖 環(huán)多核苷酸可替代支持物。所述錨定寡核苷酸可固定于相同支持物或各所述錨定寡核苷酸 固定于不同支持物。在一些實施方式中，步驟（a)-(d)在單一反應(yīng)體積中進行。
[0013] 在另一方面，生成具有預定序列的至少一種靶核酸的方法可包括：(a)連接具有 第一多個突出端的第一多個雙鏈寡核苷酸和具有第二多個突出端的第二多個雙鏈寡核苷 酸，其中所述第一多個突出端設(shè)計為與所述第二多個突出端互補，從而生成第一組多核酸； b)連接具有第三多個突出端的第三多個雙鏈寡核苷酸和具有第四多個突出端的第四多個 雙鏈寡核苷酸，其中所述第三多個突出端設(shè)計為與所述第四多個突出端互補，從而生成第 二組多核酸；和（c)連接所述第一組多核酸和所述第二組多核酸，其中所述第一組多核酸 和第二組多核酸設(shè)計為具有互補突出端，從而形成至少一種靶核酸。在一些實施方式中，所 述第一、二、三、四多個突出端各設(shè)計為彼此之間相對相互正交。所述方法還可包括任選重 復步驟（a) - (c)。
[0014] 在其他方面，生成具有預定序列的至少一種靶核酸的方法包括：將第一多個雙鏈 寡核苷酸和第二多個雙鏈寡核苷酸連接于所述第二多個雙鏈寡核苷酸的5'末端，并將第 二多個雙鏈寡核苷酸和第三多個雙鏈寡核苷酸連接于所述第二多個雙鏈寡核苷酸的3'末 端，其中所述第一多個雙鏈寡核苷酸具有第一多個3'突出端，所述第二多個雙鏈寡核苷酸 具有第一多個5'突出端和第二多個3'突出端，且所述第三多個雙鏈寡核苷酸具有第二多 個5'突出端，其中所述第一多個3'突出端設(shè)計為與所述第一多個5'突出端互補，并且所 述第二多個3'突出端設(shè)計為與第二多個5'突出端互補；從而形成至少一種靶核酸。在一 些實施方式中，所述第一和第二多個5'和3'突出端各設(shè)計為彼此之間相對相互正交。所 述方法還可包括任選重復連接步驟。
[0015] 在另一方面，提供生產(chǎn)具有多個突出端的多個雙鏈寡核苷酸的方法。所述方法可 包括：(a)熔解第一多個鈍末端雙鏈寡核苷酸和第二多個鈍末端雙鏈寡核苷酸，形成多個 單鏈寡核苷酸；和（b)使所述多個單鏈寡核苷酸重新退火，形成具有多個突出端的多個雙 鏈寡核苷酸，其中所述多個突出端設(shè)計為彼此基本相互正交。在某些實施方式中，所述第一 和第二多個鈍末端雙鏈寡核苷酸在熔解前進行錯誤校正或錯誤減少。
[0016] 在一些方面，所述方法包括提供包含單鏈5'突出端的至少多個結(jié)合支持物的雙 鏈寡核苷酸。所述多個寡核苷酸可具有預定序列。在一些實施方式中，所述單鏈突出端在其 3'末端包含與第一多個雙鏈構(gòu)建寡核苷酸的3'末端序列區(qū)域互補的序列區(qū)域。在一些實 施方式中，所述方法包括提供包含單鏈5'突出端的至少多個結(jié)合支持物的雙鏈寡核苷酸， 其中所述多個寡核苷酸具有預定序列，其中所述單鏈突出端在其3'末端包含與第一多個雙 鏈構(gòu)建寡核苷酸的3'末端序列區(qū)域互補的序列區(qū)域。在一些實施方式中，所述方法包括生 成含單鏈3'突出端的至少第一多個雙鏈構(gòu)建寡核苷酸，所述單鏈3'突出端與多個結(jié)合支 持物的寡核苷酸互補。在一些實施方式中，所述方法包括使所述至少第一多個構(gòu)建寡核苷 酸雜交至所述多個結(jié)合支持物的寡核苷酸。在一些實施方式中，所述方法連接所述第一多 個構(gòu)建寡核苷酸，并任選重復步驟b-d，從而生成至少靶核酸。在一些實施方式中，所述連接 步驟在連接酶存在下進行。
[0017] 在一些實施方式中，在提供步驟中，所述至少多個結(jié)合支持物的雙鏈寡核苷酸包 含多個不同單鏈5'突出端，各5'突出端與多個不同靶核酸互補。所述突出端可為3-20 核苷酸長。
[0018] 在一些實施方式中，所述多個結(jié)合支持物的雙鏈寡核苷酸固定于單一支持物，例 如珠。在一些實施方式中，所述多個靶核酸可在單一支持物上合成。在其他實施方式中，各 多個結(jié)合支持物的雙鏈寡核苷酸固定于不同支持物，從而可合成多個靶核酸，其中各靶核 酸固定于不同支持物，例如珠。在各種實施方式中，合成步驟在單一反應(yīng)體積中進行。
[0019] 在一些實施方式中，包含單鏈突出端的多個雙鏈構(gòu)建寡核苷酸通過擴增結(jié)合支持 物的模板寡核苷酸來生成，各結(jié)合支持物的模板寡核苷酸具有3'側(cè)接序列和5'側(cè)接序列， 各側(cè)接序列具有引物結(jié)合位點和限制性酶識別位點。所述側(cè)接序列可用IIS型限制性酶切 下。在一些實施方式中，包含單鏈突出端的多個雙鏈構(gòu)建寡核苷酸通過雜交部分互補的寡 核苷酸來生成。在一些實施方式中，所述雙鏈構(gòu)建寡核苷酸可進行改組，并用例如錯配結(jié)合 蛋白來減少錯誤。
[0020] 在一些實施方式中，所述雙鏈構(gòu)建寡核苷酸包含N多種構(gòu)建寡核苷酸，其中所述N 多種構(gòu)建寡核苷酸跨越靶核酸的整個序列且不含缺口。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的一些方面，所述方法涉及生產(chǎn)具有預定序列的至少一種靶核酸，包 括以下步驟：提供含3'突出端的N種多個雙鏈寡核苷酸，其中所述第一多個寡核苷酸在其 3'末端包含與第二寡核苷酸3'末端序列區(qū)域互補的序列區(qū)域，其中多個寡核苷酸N在其 3'末端包含與多個寡核苷酸（N-I)的序列區(qū)域互補的序列區(qū)域。所述多個構(gòu)建寡核苷酸可 通過其獨特突出端成對雜交并組裝。所述構(gòu)建寡核苷酸的組裝對可用例如連接酶連接。所 述步驟可重復以分級組裝所述至少一種靶核酸。在一些實施方式中，所述靶核酸的合成在 單一反應(yīng)體積中進行。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明一些方面，生產(chǎn)具有預定序列的至少一種靶核酸的方法包括提供含3' 單鏈突出端的至少多個莖環(huán)寡核苷酸，其中所述單鏈3'突出端與第一多個雙鏈構(gòu)建寡核 苷酸的3'末端的序列區(qū)域互補。可提供含單鏈3'突出端的第一多個雙鏈構(gòu)建寡核苷酸， 所述單鏈3'突出端與莖環(huán)寡核苷酸互補。所述至少第一多個構(gòu)建寡核苷酸可雜交至莖環(huán) 寡核苷酸并連接。合成步驟可重復，從而生成所述至少一種靶核酸。在一些實施方式中，所 有步驟在單一反應(yīng)體積中進行。在一些實施方式中，所述突出端為3-20核苷酸長。在一些 實施方式中，所述莖環(huán)寡核苷酸至少IOObp長。
[0023] 在各種實施方式中，提供在單一合成反應(yīng)體積中合成多種多核苷酸的方法和組合 物。該方法有時稱為多重多核苷酸合成（MPS)。詳細描述三類MPS:I)系列MPS，II)分級 MPS 和 III)平行 MPS。
【附圖說明】
[0024] 圖1A-1C顯示系列多重多核苷酸合成的非限制性示例方法，顯示具有突出端的寡 核苷酸雙鏈體的系列添加。圖IA顯示含具有獨特3'突出端的結(jié)合支持物或錨定寡核苷酸 雙鏈體的珠支持物。圖IB顯示通過添加補償寡核苷酸雙鏈體合成較長構(gòu)建體。圖IC顯示 通過連續(xù)添加補償雙鏈體或二聚體（i，ii，iii，iv)合成子組件或全長構(gòu)建體。
[0025] 圖2A-2C顯示含突出端的補償雙鏈寡核苷酸制備的非限制性示例方法。圖2A顯 示第一、第二、第三等補償二聚體（offset dimer)的各核酸（如基因）的上方鏈（單撇號 [']標記）的生成。圖2B顯示生成所述補償二聚體的下方鏈（雙撇號["]標記）的相似 反應(yīng)組。圖2C顯示來自反應(yīng)孔的上方鏈和下方鏈的配對組合，對應(yīng)于各基因第一、第二、第 三等補償二聚體（所述第一補償二聚體的上方鏈和下方鏈孔混合入第一補償二聚體孔，所 述第二補償二聚體的上方鏈和下方鏈孔混合入第二補償二聚體孔，等）。
[0026] 圖3顯示系列多重多核苷酸合成的非限制性示例方法，顯示支持物（珠）上的具 突出端的寡核苷酸雙鏈體的第一系列添加，每個支持物具有多種錨定類型。
[0027] 圖4顯示系列多重多核苷酸合成的非限制性示例方法，顯示支持物（珠）上的具 突出端的寡核苷酸雙鏈體的第二系列添加，每個支持物具有多種錨定類型。
[0028] 圖5顯示系列多重多核苷酸合成的非限制性示例方法，顯示使用通用錨的支持物 (珠）上的具突出端的寡核苷酸雙鏈體的第一系列添加。
[0029] 圖6顯示系列多重多核苷酸合成的非限制性示例方法，顯示使用通用錨的支持物 (珠）上的具突出端的寡核苷酸雙鏈體的第二系列添加。
[0030] 圖7A-7C顯示使用莖環(huán)多核苷酸替代珠支持物的系列多重多核苷酸合成的非限 制性方法。圖7A顯示具有獨特3'突出端的莖環(huán)多核苷酸。圖7B顯示通過向所述莖環(huán)多 核苷酸添加補償寡核苷酸雙鏈體來合成較長構(gòu)建體。圖7C顯示通過連續(xù)添加補償雙鏈體 或二聚體（i, ii, iii, iv)合成子組件或全長構(gòu)建體。
[0031] 圖8顯示系列多重多核苷酸合成的非限制性示例方法，顯示具突出端的寡核苷酸 雙鏈體的第一添加，每珠具有一種多核苷酸錨定方式。
[0032] 圖9顯示分級多重多核苷酸合成的非限制性示例方法，顯示具突出端的寡核苷酸 雙鏈體的第二添加，每珠具有一種多核苷酸錨定方式。
[0033] 圖IOA顯示就多重多核苷酸合成而言形成補償二聚體的非限制性示例方法。
[0034] 圖IOB顯示就多重多核苷酸合成而言補償二聚體的非限制性示例序列。
[0035] 圖11顯示分級多重多核苷酸合成的非限制性示例方法。
[0036] 圖12顯示平行多重多核苷酸合成的非限制性示例方法。
[0037] 圖13A-13B顯示平行多重多核苷酸合成內(nèi)終止反應(yīng)的非限制性示例方法。圖13A 是3個補償二聚體A、B和C的示意圖，具有豐富的補償二聚體B，其設(shè)計為雜交并連接至最 終產(chǎn)物ABC。圖13B是3個補償二聚體A、B和C的示意圖，若補償二聚體B豐富，終止反應(yīng) 產(chǎn)生AB和BC。
[0038] 圖14顯示平行多重多核苷酸合成的非限制性示例方法，使用具有突出端的寡核 苷酸雙鏈體的成形濃度概況以減少反應(yīng)終止。
[0039] 圖15顯示平行多重多核苷酸合成的非限制性示例方法，使用系連接酶（tethered ligase)以減少反應(yīng)的終止。
[0040] 圖16顯示平行多重多核苷酸合成的非限制性示例方法，顯示對具有突出端的寡 核苷酸雙鏈體的基于珠的滴定的應(yīng)用，從而減少反應(yīng)的終止。
[0041] 發(fā)明詳述
[0042] 本發(fā)明的方面可用來高效組裝大量的核酸片段，和/或減少產(chǎn)生大核酸產(chǎn)物所需 步驟的數(shù)量，同時降低組裝錯誤率。本發(fā)明的方面可納入核酸組裝過程來提高組裝保真度、 通量和/或效率，降低成本，和/或縮短組裝時間。在一些實施方式中，本發(fā)明的方面可以 自動化和/或在高通量組裝環(huán)境下進行來促進平行產(chǎn)生許多不同的靶核酸產(chǎn)物。
[0043] 本文提供的技術(shù)方面對增加核酸合成和組裝反應(yīng)的精確性、產(chǎn)率、通量、和/或成 本效益有用。本文使用的術(shù)語"核酸"、"多核苷酸"、"寡核苷酸"可互換使用，并且指核苷酸 的天然產(chǎn)生或合成的聚合物形式。本發(fā)明所述寡核苷酸和核酸分子可以從天然產(chǎn)生的核苷 酸形成，例如形成脫氧核糖核酸（DNA)或核糖核酸（RNA)分子?；蛘?，該天然產(chǎn)生的寡核苷 酸可以包含改變其性質(zhì)的結(jié)構(gòu)修飾，例如肽核酸（PNA)或鎖核酸（LNA)。有天然產(chǎn)生堿基 或人工堿基的寡核苷酸和核酸分子的固相合成為本領(lǐng)域熟知。應(yīng)理解這些術(shù)語包含從核苷 酸類似物中生成的RNA或DNA的等同物、類似物和應(yīng)用于要描述的實施方式時的單鏈或雙 鏈多核苷酸。本發(fā)明中可用的核苷酸包含例如天然產(chǎn)生的核苷酸（例如核糖核苷酸或脫氧 核糖核苷酸），或者核苷酸的天然或合成修飾、或者人工堿基。本文使用的術(shù)語單體指小分 子組成員，其是并且能結(jié)合在一起以形成低聚物、聚合物或由兩個或更多成員構(gòu)成的化合 物。聚合物中所述單體的特定順序在本文中稱為聚合物的"序列"。所述單體組包含但不限 于例如常見L-氨基酸組、D-氨基酸組、合成和/或天然氨基酸組、核苷酸組及戊糖和己糖 組。本發(fā)明所述方面主要涉及制備寡核苷酸，也可容易地用于制備其他聚合物例如肽或多 肽、多糖、磷脂、異聚物、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亞胺、聚芳撐硫、聚硅氧烷、聚 酰亞胺、聚乙酸酯或任何其他聚合物。
[0044] 本文使用的術(shù)語"預測定序列"或"預定序列"可互換使用，指在所述聚合物合成 或組裝前已知并選擇的聚合物的序列。具體地，本文所述本發(fā)明的各方面主要涉及核酸分 子的制備，在核酸分子合成或組裝前已知且已選擇核酸的序列。在本文所提供技術(shù)的一些 實施方式中，固定的寡核苷酸或多核苷酸被用作材料來源。在各種實施方式中，本文所述方 法使用寡核苷酸，其序列基于待合成的最終多核苷酸構(gòu)建體的序列確定。在一個實施方式 中，寡核苷酸是短核酸分子。例如，寡核苷酸的長度可以是10至約300個核苷酸、20至約