?/?/?沒 的cDNA上選取沉默的片段，并加上I和斯^ I的酶切位點進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對沉默 片段回收、轉(zhuǎn)化、測序，驗證序列是否與沉默序列一致。驗證無誤后，用I和艙（I酶切 沉默片段和Y載體，完全酶切的Y載體和沉默片段經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收、 連接、轉(zhuǎn)化、PCR檢測陽性克隆、提取陽性克隆的質(zhì)粒、酶切驗證，構(gòu)建獲得的沉 默載體Y :TaPDRABCG。步驟如下： 1.沉默片段的獲得 在的cDNA上選取沉默片段，并設(shè)計帶有Ac I和Afoi I酶切位點 的引物 19V-F:5，一 ATATTAATTAATTCGATGACATCATCCTCCT - 3，和 19V-R :5，一 TATGCGGCCGCGCACCCAGTATTGCTTTTGA - 3，，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。
[0050] 反應(yīng)體系：
反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性5 min;94°C變性30 s，58°C退火30 s，72°C延伸30 s，循環(huán)35 次；72 °C延伸10 min ; KTC保存。
[0051] PCR產(chǎn)物用1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在小于250 bp處有一目的條帶（圖 7)。然后對目的條帶回收、轉(zhuǎn)化、測序，序列結(jié)果如SEQ ID No. 5所示。
[0052] 2.沉默基因與Y載體的雙酶切 提取沉默基因和Y載體的質(zhì)粒，參照SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(生工生 物工程上海有限公司）中的說明書進(jìn)行，然后用I和#〇( I酶切沉默基因和γ載體。
[0053] 酶切體系如下：
37°C，酶切4 h。酶切完成后，將酶切產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外凝膠回 收儀中，用潔凈的刀片分別切下經(jīng)酶切的Y載體和沉默基因的片段，并分別用Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3.0 試劑盒（TaKaRa 公司）回收。
[0054] 3.沉默片段與Y載體的連接、轉(zhuǎn)化、陽性質(zhì)粒的提取和雙酶切驗證 將酶切完全的Y載體和沉默基因的片段以摩爾比1 :4的比例進(jìn)行連接，連接體系如 下：
16°C，連接 12 h。
[0055] 將連接好的產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化、陽性質(zhì)粒的提取，步驟同實施例(一）中的2. 6和2. 7。
[0056] 4.提取陽性克隆及質(zhì)粒雙酶切驗證 質(zhì)粒雙酶切的驗證，同實施例(二)中的2,酶切產(chǎn)物用1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié) 果如圖8所示。將構(gòu)建好的γ =TaPDRABCG進(jìn)行基因功能分析。
[0057] 實施例(三)、7?/?/?說i?功能分析 I. VIGS載體線性化 參照SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(生工生物工程上海有限公司）中的說明書 提取質(zhì)粒α、β、Y :〇〇、Y :PDS及重組病毒質(zhì)粒Y = TaPDRABCG并對其進(jìn)行線性化： 1) α用I酶切，體系如下：
37°C，孵育 4 h。
[0058] 2) β用I酶切，體系如下：
37°C，孵育 4 h。
[0059] 3) γ : 00、γ :PDS及重組病毒質(zhì)粒γ : TaPDRABCG用Is" II酶切，體系如下：
50°C，孵育 4 h。
[0060] 上述線性化產(chǎn)物各3管混合，分別加350 μL DEPC水，然后加入500 μL苯酚：氯 仿（24:1)抽提，12000 rpm 離心 15 min。取 450 μL 上清，加 45 μL NaAc (ρΗ5· 2, 3 Μ)和 I mL冷無水乙醇，混勻-20°C過夜，12000 rpm離心15 min，70%乙醇清洗晾干。加入20 μL DEPC水溶解，取I μL樣品用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖9)，_70°C保存。
[0061] 2.體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 參照 mMESSAGEMmachine High Yield Capped RNA Transcription Kit (Ambion 公司） 說明書，對線性化產(chǎn)物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，體外轉(zhuǎn)錄體系如下：
37°C，I. 5 h，取I PL上述體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍，分別測定濃度，并用1. 0%瓊脂糖凝 膠電泳檢測。剩余體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DNase I消化，電泳檢測（圖10)，-70°C保存。
[0062] 3.重組病毒接種小麥 α、β和Y轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，根據(jù)需要各取10 PL混合，共30 μL，加3倍體積（90 PLM^DEPC 水，總體積達(dá)到120 μL，再加1倍體積（120 μυ的GKP Buffer，制得240 PL的接種病毒混 合液。待小麥幼苗第二片葉展開時（14 d)，開始接種。戴剛開封橡膠手套，用處理過的槍頭 取10 μL接種液到食指肚上，一手固定住小麥幼苗尖端，另一手用大拇指和食指輕輕來回摩 擦小麥第二片葉。接種完后，向小麥幼苗噴施DEPC水，保濕24 h，室溫保持在23-25°C之間。 小麥植株轉(zhuǎn)染BSMV重組載體α、β和γ :00的混合物，用于驗證病毒自身是否會影響目的 基因在小麥與葉銹菌互作中的表型變化。轉(zhuǎn)染BSMV重組載體α、β和Y:PDS的植株，用 于VIGS沉默體系成功與否的表型分析。轉(zhuǎn)染BSMV重組載體α、β和 Y:TaPDRABCG的植 株，用于目的基因7?/?/?/?!?沉默后的功能分析。同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染病毒的對小麥葉銹病表 現(xiàn)抗病的材料TcLrl9和對小麥葉銹病表現(xiàn)感病的材料Thatcher做對照。
[0063] 4.接種小麥葉銹菌 小麥接種病毒的第10山分別在轉(zhuǎn)染病毒的BSMV:00、BSMV:roS、BSMV: TaPDRABCG 和未轉(zhuǎn)染病毒的對小麥葉銹病表現(xiàn)抗病的材料TcLrl9和對小麥葉銹病表現(xiàn)感病的材料 Thatcher的第三片葉片及以上葉片接種小麥葉銹菌THTS，并設(shè)置未接種病毒和小麥葉銹 菌的TcLrl9做空白對照。為防止病毒交叉感染，接種不同病毒的植株分別用不同的毛筆接 小麥葉銹菌，接菌后黑暗保濕12-14 h，然后轉(zhuǎn)入23-25°C，光照時間14 h的溫室內(nèi)培養(yǎng)。接 菌后12-14 d觀察并記錄表型變化（圖11)。
【主權(quán)項】
1. 一個小麥抗葉銹病相關(guān)基因在得到這個基因之前進(jìn)行的電子克隆的片 段，具有序列表中SEQIDNo. 1所述的堿基序列。2. 如權(quán)利要求1所述的電子克隆片段的引物：19F:5'-GCCCCTGAAACGTACAACTT- 3，和 19R:5，一ACGGAAGAAGAGCGTCATTG-3，。3. 對小麥抗葉銹病相關(guān)基因進(jìn)行RACE時的3 '端引物 GSPl5 ' -CAAGAGCAAGAGCCATCCAGCAGC- 3 '和 5 'RACE引物GSP2 :5 '- AGCTCCTTTCTTATAGCTCTCCCGGTGT- 3 ^。4. 一個小麥抗葉銹病相關(guān)基因的cDNA具有序列表中SEQIDNo. 2所述的 堿基序列，該基因的DNA序列具有序列表中SEQIDNo. 3所述的堿基序列。5. 如權(quán)利要求4所述的小麥抗葉銹病相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)，具有序列表 中SEQIDNo. 4所述的氨基酸序列。6. 如權(quán)利要求4中所述的擴(kuò)增小麥抗葉銹病相關(guān)基因的cDNA和 DNA的引物 19ABC-F:5 ' -GGGITGGGAITGAAATGCCGACG- 3 '和 19ABC-R:5 '- CATTCGGGTGGTGCAAAATGT- 3'。7. 小麥抗葉銹病相關(guān)基因中要沉默片段，具有SEQIDNo. 5所述的堿基序 列。8. 如權(quán)利要求7所述的擴(kuò)增小麥抗葉銹病相關(guān)基因7?/?/?/?!?中要沉默片段 的引物 19V-F:5，一ATATTAATTAATTCGATGACATCATCCTCCT- 3，和 19V-R:5，一 TATGCGGCCGCGCACCCAGTATTGCTTTTGA- 3'。9. 如權(quán)利要求4所述一個小麥抗葉銹相關(guān)基因在小麥抗葉銹病中的作用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了小麥中與垂直抗病相關(guān)的特異基因TaPDRABCG。本發(fā)明通過電子克隆技術(shù)及RACE技術(shù)克隆了小麥抗葉銹病相關(guān)基因TaPDRABCG，該基因的cDNA序列如SEQIDNo.2所示，DNA序列如SEQIDNo.3所示。小麥抗葉銹病相關(guān)基因TaPDRABCG編碼的蛋白質(zhì)，具有序列表中的SEQIDNo.4所述的氨基酸序列；應(yīng)用病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)將該基因沉默之后，小麥的抗葉銹性明顯減弱，證明了TaPDRABCG參與小麥對葉銹病的防御反應(yīng)。了解TaPDRABCG基因的特性及其在抗葉銹病中的作用，對豐富抗葉銹分子機(jī)制理論具有重要意義，對抗病育種的實踐工作具有指導(dǎo)意義。
【IPC分類】C07K14/415, C12N15/29, C12N15/11
【公開號】CN104911190
【申請?zhí)枴緾N201410082836
【發(fā)明人】楊文香, 胡亞亞, 劉大群
【申請人】河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年9月16日
【申請日】2014年3月10日