一種能夠及時觀察小麥黑胚病癥狀的接種鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于農作物病害檢測技術領域，具體設及一種能夠及時觀察小麥黑胚病癥 狀的接種鑒定方法。
【背景技術】
[0002] 小麥黑胚病是指小麥巧粒表面有不同形狀和程度的黑色、褐色等癥狀，該病不僅 降低小麥巧粒的外觀品質，使小麥在市場上的出售級別降低而影響農民收入，而且降低種 子發(fā)芽率，影響面粉品質，給小麥生產帶來嚴重的危害。
[0003] 小麥黑胚病病因復雜，受致病菌、環(huán)境因素及品種特性的影響，其嚴重程度隨品 種、地點、年份及防治措施等因素的不同而變化，各國報道的發(fā)病率一般在0.3~66.7%之間 變化（參見：l、Li Q Y, Qin Z, Jiang Y M,化en C C, Duan Z B, and Niu J S. Screening wheat genotypes for resistance to black point and the effects of diseased kernels on seed germination. J Plant Dis Protect, 2014, 121 (2): 79-88； 2、Fernandez, M. R., Sissons, M., Conner, R. L., Wang, H., amd Clarke, J. M. 2011. Influence of biotic and abiotic factors on dark discoloration of durum wheat kernels. Crop Sci. 51:1205-1214;3、代君麗，于巧麗，袁虹霞，邢小萍，張 猛，孫炳劍，李洪連.河南省小麥黑胚病菌的分離鑒定及致病性測定.植物病理學報， 2011, 41(3), 225-231.)〇
[0004] 小麥黑胚病是巧粒病害，在巧粒灌漿期發(fā)生發(fā)展，因為巧粒外有穎殼包被，不能及 時觀察黑胚病的癥狀形成情況，如果去掉穎殼又會對巧粒生長造成嚴重傷害甚至造成巧粒 脫落，運給小麥黑胚病抗病機理研究、菌與寄主互作、病害防治等研究工作帶來了一定的困 難。目前，針對小麥黑胚病接菌鑒定方法的報告，都是在小麥穗部直接噴灑接菌，進行或者 不進行保濕處理，成熟后統(tǒng)計發(fā)病率(參見：3、代君麗，于巧麗，袁虹霞等.植物病理學報， 2011，41(3)，225-231;4、康業(yè)斌，劉順通，成玉梅，段愛菊.小麥對黑胚病的抗性及黑胚 對產量損失的影響，植物保護，1999,3:25-27)。因為穎殼的阻隔，運些鑒定方法都無法及時 的直接觀察接菌后巧粒癥狀形成情況，而且由于沒有直接將菌接在巧粒上，降低了致病菌 的侵染效果，從而影響實驗的準確性。因此，非常有必要探索一種小麥黑胚病接菌鑒定的方 法，使致病菌直接侵染小麥巧粒、提高侵染效果確保實驗結果穩(wěn)定真實可靠，又能直接觀察 黑胚病的癥狀形成情況。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術問題是:針對直接噴灑接菌方法不能及時觀察癥狀產生，W 及菌與巧粒由于穎殼阻隔導致鑒定結果準確性降低的不足，本發(fā)明提供一種能夠及時觀察 小麥黑胚病癥狀的接種鑒定方法。本發(fā)明首先在小麥抽穗后、巧粒未發(fā)育前將穎殼剪掉一 部分，待巧粒滿仁后再噴灑接菌套袋保濕鑒定，不僅使噴灑的致病菌抱子可W直接與巧粒 接觸，而且可W及時觀察巧粒上黑胚病癥狀發(fā)生的情況，同時根據(jù)該浸染情況可W及時對 小麥作出合理的防治措施。由此，本發(fā)明首次提供了一種剪殼接菌鑒定小麥黑胚病的方法， 不僅可W及時觀察癥狀的產生情況，而且使鑒定結果更穩(wěn)定可靠;并且根據(jù)浸染情況可W 及時對小麥作出合理防治。
[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明采取的技術方案為： 本發(fā)明提供一種能夠及時觀察小麥黑胚病癥狀的接種鑒定方法，所述接種鑒定方法包 括W下步驟： a、 小麥穗部剪殼處理及雜菌隔離:在小麥抽穗后，用綴子將小麥穗上部及下部的小穗 各去掉3個，用剪刀將剩下小穗的穎殼從上面剪去1/2,并將麥芒剪掉，然后用硫酸紙袋將去 殼的小麥穗罩上W隔離雜菌； b、 小麥黑胚病致病菌的培養(yǎng):將小麥黑胚病致病菌接種于含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中， 在25°C條件下暗培養(yǎng)12天； C、小麥黑胚病致病菌抱子懸浮液的制備:用蒸饋水沖洗步驟b培養(yǎng)得到的致病菌菌落， 然后經(jīng)過濾、離屯、、調整抱子濃度后得到抱子懸浮液，于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?d、 噴灑接菌及套袋保濕:在小麥巧粒滿仁時，將步驟C制備的抱子懸浮液搖勻后均勻噴 灑在步驟a中剪殼處理的穗子上，噴灑后用塑料袋將穗子罩上保濕5天； e、 小麥黑胚病癥狀觀察:接菌后每天觀察步驟d接種處理巧粒上病菌的侵染情況W及 巧粒黑胚病癥狀的形成； f、 鑒定結果記錄:小麥成熟時收獲驚干，將步驟d接種處理的穗子手工脫粒，統(tǒng)計黑胚 病巧粒占巧?？倲?shù)的百分比即為黑胚率，作為小麥黑胚病鑒定的結果。
[0007] 根據(jù)上述的能夠及時觀察小麥黑胚病癥狀的接種鑒定方法，步驟b中所述小麥黑 胚病致病菌為小麥根腐平廝蠕抱菌，狗牙根平廝蠕抱菌，幡摔草平廝蠕抱菌和草莖點霉菌 中的至少一種。
[0008] 根據(jù)上述的能夠及時觀察小麥黑胚病癥狀的接種鑒定方法，步驟b中所述將小麥 黑胚病致病菌接種于含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，具體操作過程為:首先將PDA培養(yǎng)基進行 滅菌，然后冷卻至50~55°C時，在無菌條件下加入氨節(jié)青霉素鋼，每IOOmL PDA培養(yǎng)基中氨 節(jié)青霉素鋼用量為10化L，搖勻后倒平板;待培養(yǎng)基凝固冷卻后，用手術刀片將小麥黑胚病 致病菌菌落切成3mm 2的小塊兒，放于平板的中央，1塊/皿。
[0009] 根據(jù)上述的能夠及時觀察小麥黑胚病癥狀的接種鑒定方法，PDA培養(yǎng)基進行滅菌 時的溫度為12rC，滅菌時間為20分鐘;所述氨節(jié)青霉素鋼的濃度為lOOmg/mL。
[0010] 根據(jù)上述的能夠及時觀察小麥黑胚病癥狀的接種鑒定方法，步驟C中小麥黑胚病 致病菌抱子懸浮液的制備過程為： 首先用無菌蒸饋水(每皿中加入25mL無菌蒸饋水）沖洗步驟b中PDA平板上培養(yǎng)得到的 致病菌菌落，然后用紗布過濾至50 mL的離屯、管中，在4°C、4000 r/min的條件下離屯、5min， 去上清液;接著加入10 mL無菌蒸饋水搖勻再離屯、，去上清液;然后再加入5 mL無菌蒸饋水， 用血球計數(shù)板測定抱子濃度，根據(jù)測定的抱子濃度按比例加入無菌蒸饋水，調整至抱子濃 度為3 X IO5個/mL,得到小麥黑胚病致病菌抱子懸浮液。
[0011] 根據(jù)上述的能夠及時觀察小麥黑胚病癥狀的接種鑒定方法，步驟d中所述小麥巧 粒滿仁時，是指小麥巧粒發(fā)育為滿仁，即小麥巧粒有1/3~1/4伸出未剪掉穎殼的時間。
[0012] 根據(jù)上述的能夠及時觀察小麥黑胚病癥狀的接種鑒定方法，步驟e中接菌后每天 觀察步驟d接種處理巧粒上病菌的侵染情況W及巧粒黑胚病癥狀的形成，根據(jù)浸染情況對 小麥作出及時防治。
[0013] 根據(jù)上述的能夠及時觀察小麥黑胚病癥狀的接種鑒定方法，步驟e中所述觀察采 用兩種方法:一種是直接用肉眼觀察;另一種是分時間段取樣，制作切片用光學顯微鏡或掃 描或透射電鏡觀察，W明確黑胚病致病菌的侵染途徑與小麥巧粒組織與菌互作時形態(tài)結構 的變化。
[0014] 本發(fā)明的積極有益效果： 1、本發(fā)明技術方案是在小麥抽穗后，從上部剪掉小穗穎殼的1/2，然后套硫酸紙袋隔離 雜菌，隨著巧粒逐漸發(fā)育，當巧粒的1/3-1/4伸出穎殼時，進行致病菌抱子懸浮液噴灑接菌， 塑料袋保濕5天處理，接菌后可W每天觀察巧粒上菌絲的定殖、生長W及黑胚病的產生情 況。本發(fā)明鑒定方法與直接在穗部噴灑抱子液鑒定相比，可W及時、直接的觀察到巧粒的發(fā) 病情況，而且增強了鑒定的準確性。
[0015] 2、本發(fā)明技術方案中，首先將小麥穗部穎殼剪掉一部分，待巧粒伸出穎殼后再噴 灑接菌，既能保證小麥巧粒正常發(fā)育，又使黑胚病致病菌與巧粒直接接觸，保證了鑒定結果 的準確性，而且巧粒有一部分漏在穎殼外，可W直接觀察巧粒的發(fā)病情況;根據(jù)及時觀察到 的浸染情況，可W對小麥作出及時合理的防治措施。
[0016] 3、小麥黑胚病是小麥生產區(qū)的常發(fā)病害，其病原復雜，嚴重程度還受環(huán)境影響。在 沒有準確鑒定品種抗性的情況下，無法就小麥對不同病原的專化抗病性進行研究。本發(fā)明 所述接菌鑒定方法，首次采用剪掉部分穎殼、可W將抱子液直接噴灑在巧粒表面進行鑒定， 使致病菌與巧粒直接接觸，充分保證了接菌效果，提高了鑒定的準確性與穩(wěn)定性，從而保證 了篩選的抗病材料的真實可靠。
[0017] 4、本發(fā)明方法剪掉一部分穎殼，既保證巧?？蒞正常發(fā)育成熟，又可W使發(fā)育中 的巧粒伸出穎殼外，避免了觀察時穎殼阻隔的影響，可W直接觀察接菌小麥巧粒上致病菌 抱子的生長情況與黑胚病的發(fā)生情況，為小麥抗黑胚病機理研究及菌與寄主植