一種合浦珠母貝表皮生長因子受體基因Pf-EGFR及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及的是一種合浦珠母貝（Pinctada fucata)表皮生長因子受體基因 Pf-EGFR及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 表皮生長因子受體（Epidermal growth factor，EGFR)是一個分子量為170kDa的 多功能跨膜糖蛋白，具有蛋白酪氨酸激酶活性，在與配體結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。目前在多 個物種中發(fā)現(xiàn)EGFR基因，它不僅參與調(diào)節(jié)生物機體的信號通路和生長發(fā)育，同時在促上皮 細胞分裂增殖方面有顯著的促生長作用。
[0003] 合浦珠母貝（Pinctada fucata，簡寫P. fucata)是生產(chǎn)海水珍珠貝的主要育珠 貝，主要分布在我國的廣東、廣西、海南及臺灣沿海地區(qū)。合浦珠母貝的育珠產(chǎn)量占全球海 水珍珠產(chǎn)量90%以上，是重要的海水經(jīng)濟養(yǎng)殖種類。外套膜與珍珠囊在珍珠的形成中起著 重要的作用。目前有關(guān)EGFR的研宄主要集中在哺乳動物中，在海洋無脊椎動物中的研宄非 常有限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種合浦珠母貝表皮生長因子受體基因 Pf-EGFR和由此 推斷的氨基酸序列。
[0005] 本發(fā)明的目的還在于提供上述合浦珠母貝表皮生長因子受體基因 Pf-EGFR在促 進合浦珠母貝貝殼和珍珠形成方面的用途。
[0006] 本發(fā)明的第一個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種合浦珠母貝表皮生長因 子受體基因 Pf-EGFR，該基因 Pf-EGFR的CDNA核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 該基因 Pf-EGFR的cDNA核苷酸序列的154bp~156bp為起始密碼子ATG，1168~ 1170bp為終止密碼子TGA，擁有1017bp開放閱讀框。
[0008] 該合浦珠母貝表皮生長因子受體基因 Pf-EGFR，它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所 不O
[0009] 本發(fā)明以合浦珠母貝的外套膜等為材料，首次克隆了合浦珠母貝Pf-EGFR基因的 cDNA序列與基因組DNA序列，并通過qRT-PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)研宄了 EGFR在合浦珠 母貝的不同組織與不同發(fā)育時期的表達情況。
[0010] 本發(fā)明的第一個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：上述合浦珠母貝表皮生長因 子受體基因 Pf-EGFR在促進合浦珠母貝貝殼和珍珠形成方面的用途。
[0011] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0012] (1)本發(fā)明以合浦珠母貝的外套膜為材料，首次克隆了合浦珠母貝EGFR基因的 cDNA序列和氨基酸序列，通過qRT-PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)研宄了 EGFR在合浦珠母貝的不 同組織與不同發(fā)育時期的表達情況；
[0013] (2)本發(fā)明利用組織原位雜交研宄了 Pf-EGFR在合浦珠母貝外套膜和珍珠囊中的 表達情況，結(jié)果顯示，強烈的雜交信號出現(xiàn)雜在外套膜的外褶的內(nèi)表皮細胞與內(nèi)褶的外表 皮細胞，較淺的信號出現(xiàn)在外套膜的中褶。與此同時，在珍珠囊中，雜交信號貫穿整個珍珠 囊的表皮細胞與結(jié)蹄組織中。這些結(jié)果表明，外套膜和珍珠囊中高表達的EGFR在某種程度 上可以促進合浦珠母貝貝殼和珍珠的形成。
【附圖說明】
[0014] 圖1是合浦珠母貝Pf-EGFR氨基酸序列同源性比對；
[0015] 圖2是不同物種EGFR氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹（NJ法）；
[0016] 圖3是合浦珠母貝Pf-EGFR在不同組織中的表達情況，其中Mt.外套膜，Ms.閉殼 肌，Gi.鰓，He.肝胰腺，Ps.珍珠囊，In.腸，Go.性腺，相同字母表示差異不顯著（P>0. 05)， 不同字母表示差異顯著（P〈〇. 05);
[0017] 圖4是合浦珠母貝Pf-EGFR在不同發(fā)育時期的表達情況，其中T.擔輪期，D. D型 期，U.殼頂期，P.眼點期，M.變態(tài)期，相同字母表示差異不顯著（P>0. 05)，不同字母表示差 異顯著（P〈0. 05);
[0018] 圖5是Pf-EGFR基因在外套膜組織的原位雜交，其中A、C、D、E是陽性對照，C、D、 E是A的放大圖像，B是陰性對照，箭頭所指深紫色（黑白圖中的深色）為陽性雜交信號IF =內(nèi)裙，MF =中裙，OF =外裙，oe =外上皮細胞，ie =內(nèi)上皮細胞；
[0019] 圖6是Pf-EGFR基因珍珠囊組織的原位雜交，圖A、C、D、E、F是陽性對照，圖C、D、 E、F是A的放大圖像，B是陰性對照，箭頭所指深紫色（黑白圖中的深色）為陽性雜交信號。
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0021] 實施例1合浦珠母貝表皮生長因子受體基因 Pf-EGFR的構(gòu)建
[0022] 1.實驗樣品
[0023] 合浦珠母貝取自海南陵水新村熱帶水產(chǎn)研宄開發(fā)中心基地，取健康、活力好的成 貝，解剖后取其外套膜、閉殼肌、鰓、肝胰腺、珍珠囊、腸、性腺7種組織，放在RNA樣品保護液 (TAKARA)中保存；通過人工培育獲取合浦珠母貝擔輪期（受精后8h)、D型期（受精后24h)、 殼頂期（受精后14d)、眼點期（受精后20d)、變態(tài)期（受精后24d)不同發(fā)育時期的樣品， 不同發(fā)育時期樣品收集完分別放到RNA樣品保護液中保存，另取合浦珠母貝肌肉組織用液 氮冷凍用于基因組DNA的提取，樣品取完后迅速用干冰運輸帶回廣州實驗室于-80°C冰箱 保存以備后續(xù)實驗的使用，同時取外套膜與珍珠囊組織樣品于4%不含RNase的多聚甲醛 中固定，迅速帶回廣州實驗室包埋，用于原位雜交。
[0024] 2.引物設(shè)計和RNA提取
[0025] 2.1引物設(shè)計
[0026] 根據(jù)實驗室構(gòu)建的合浦珠母貝轉(zhuǎn)錄組文庫，篩選得到與EGFR相似性較高的 unigene片段，進行拼接，得到合浦珠母貝EGF-Iike基因 EGFR的中間片段，利用引物設(shè)計 軟件Primer Premier 5.0按照引物設(shè)計的原則進行，引物合成由上海生工有限公司合成， EGFR所用引物序列見表1。
[0027] 表1 EGFR基因的引物序列
[0028]
[0030] 2. 2RNA 提取
[0031] RNA 的提取按照 Macherey-Nagel 公司的 Total RNA isolation NucIcoSpin? RNA II提取總RNA。
[0032] 2. 3cDNA第一條鏈合成
[0033] 以合浦珠母貝總 RNA 為模板，參照 Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H _ )逆 轉(zhuǎn)錄酶說明書（TaKaRa)進行cDNA第一條鏈的合成。具體步驟如下：
[0034] (1)按如下體系配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液1
[0035] 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系1
[0036]
[0037] (2)PCR儀上70°C保溫lOmin，離心數(shù)秒后于冰上急冷2min ;
[0038] (3)按如下體系配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2
[0039] 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系2
[0042] (4)PCR儀上42°C保溫Ih后70°C 15min，反應(yīng)結(jié)束后于迅速冰上冷卻，-20°C保存 備用。
[0043] 2. 4中間片段的擴增
[0044] 以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用表1設(shè)計的引物擴增目的基因的中間片段，反應(yīng)體系 如下：
[0045]
[0046] PCR反應(yīng)程序：
[0047]
[0048] 擴增后的PCR產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測并且拍照保存。
[0049] 2. 5 PCR產(chǎn)物的回收與純化
[0050] 擴大反應(yīng)體系擴增目的片段，瓊脂糖凝膠電泳切下目的條帶，用美基膠回收試劑 盒進行回收純化。
[0051] 2. 6 RACE技術(shù)獲得cDNA序列
[0052] 根據(jù)已經(jīng)擴增得到的cDNA中間片段設(shè)計兩端的引物，RNA的提取同2. 2 -樣，所 提取的總RNA經(jīng)純度和完整性鑒定合格后測定其濃度，RACE技術(shù)按照TAKaRa的RACE試劑 盒進行全長cDNA的擴增。
[0053] 2. 7生物信息學(xué)分析
[0054] 將獲得 cDNA 序列用 ORF Finder(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/ gorf.html)查找開放閱讀框（ORF);用DNAstar軟件和BioeEdit軟件預(yù)測氨基酸序 列；用 ProtParam (http: //web. expasy. org/protparam/)預(yù)測編碼蛋白的理化特性；用 SignalP4. I (http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)預(yù)測信號肽序列；用 TMHMM srever 2. 0 (http://www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/)和 InterProScan 5 (http://www. ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan5/)預(yù)測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；用 NetPhos2.0Server(http:// www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/)預(yù)測蛋白質(zhì)的磷酸化位點；用 WoLF PSORT 工具 (http://wolfpsort. seq. cbrc. jp/)對蛋白質(zhì)進行亞細胞定位；用 SMART(http://smart· embl_heidelberg.de/)分析蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域；利用 Clustal W(http://www.ebi. ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)進行多序列比對，用MEGA5. 1構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，采用臨近法 (Neighbor-joining)，bootstrap 重復(fù)次數(shù)設(shè)定為 1000。
[0055] 基因組 DNA 的結(jié)構(gòu)由 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)和 Spidey (http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/IEB/Research/Ostell/Spidey/)進行分析。
[0056] 3·結(jié)果分析
[0057] 3. I Pf-EGFR基因 cDNA序列及氨基酸序列分析
[0058] 克隆獲得了合浦珠母貝EGFR基因，命名為Pf-EGFR(GeneBank登錄號！KP027299， 專利申請日前未要求公開），該基因 Pf-EGFR的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示， 該基因 cDNA序列2156bp，其中開放閱讀框（0RF)1017bp，編碼338個氨基酸，它的氨基酸 序列如SEQ ID NO. 2所示，分子量為37. 5kDa，理論等電點（PI)為4. 54 ;該基因 Pf-EGFR 的cDNA核苷酸序列的154bp~156bp為起始密碼子ATG，1168~1170bp為終止密碼子 TGA，擁有1017bp開放閱讀框，序列分析顯示Pf-EGFR有一個N端信號肽（l-36aa)和一 個跨膜結(jié)構(gòu)域，總平均疏水性（Grand average of hydropathicity，GRAVY)為-0.045， 說明Pf-EGFR是一個親水蛋白。序列功能分析發(fā)現(xiàn)Pf-EGFR有4個蛋白激酶C (PKC)磷 酸化位點（145-147aa，154-156aa，175-177aa，320-322aa)，4 個 N-肉豆蔻?；稽c (71-76aa，163-168aa，174-179aa，254-259aa)，7 個酪蛋白激酶 II 磷酸化位點（52-55aa， 97-100aa，122-125aa，170-173aa，240-243aa，295-298aa，320-323aa)，1 個 N 端糖基化位點 (113-116aa)，功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示