專利名稱：抗新城疫病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法，特別是涉及 一種抗新城疫病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)移因子是從外來抗原致敏的正常動物白細胞中提取出來的一種淋巴因 子，或從經(jīng)某種抗原刺激后的恢復期動物血細胞中提取出來的一種淋巴因子。 前者稱非特異性轉(zhuǎn)移因子，后者則稱特異性轉(zhuǎn)移因子。這兩種轉(zhuǎn)移因子在體內(nèi) 外最重要的是可傳遞細胞免疫功能，作為過繼免疫治療的一種免疫制劑，在免 疫系統(tǒng)中發(fā)揮多種重要作用。
目前的制備轉(zhuǎn)移因子的方法是將動物新鮮或冷凍的脾臟及淋巴結(jié)在25 'C左右去除脂肪及結(jié)締組織，然后用純化水洗凈；將洗凈的組織切成小塊，加 入適量水，用組織搗碎機破碎細胞，制成勻漿，加適量純化水，混勻，置-20
X:反復凍融5 8次，融化溫度不得超過37'C;將凍融的勻漿離心(離心溫度 4°C)，去沉淀，留上清液備用；上清液裝透析袋，透析24-48小時，半成品過 濾除菌；成品的配置與檢驗。
抗菌肽是經(jīng)誘導，由動物免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的可對抗外源性病原體的防御 性肽類活性物質(zhì)，分子量小、活性強，具有抗細菌、真菌、病毒和原蟲作用， 甚至對癌細胞也具有殺傷作用，應(yīng)用十分廣泛。目前的制備方法是以新鮮雞小 腸為原料，去脂肪、漿膜和內(nèi)容物，稱重后冷凍剪碎，搗碎成漿。勻漿后隔水 煮沸15分鐘，按照l: 1的比例加入5%乙酸，并在4。C條件下攪拌過夜，次 日將混合物在4-C溫度條件下以8000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，取上清，保存在 4'C環(huán)境中。將沉淀物用等體積5%乙酸混合，再置于4'C攪拌浸提過夜，重復 上述離心過程，取上清，合并兩次上清液，調(diào)整pH值，再次離心，棄沉淀， 上清液冷凍干燥品即為抗菌肽。
現(xiàn)有技術(shù)制備轉(zhuǎn)移因子及抗菌肽的主要缺點是針對疾病沒有特異性，治療 效果不穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中制備的抗菌肽及轉(zhuǎn)移因子針對疾病沒有 特異性，治療效果不穩(wěn)定等缺點，提供一種針對治療新城疫病毒疾病、成本低、 效果好的抗新城疫病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案概述如下
一種抗新城疫病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法，由如下步驟組
成
(1) 用新城疫病毒疫苗0. 1-0. 5mL肌肉注射免疫10-60日齡實驗雞，首次免 疫后的第7-20天，再以新城疫病毒疫苗0. 3mL肌肉注射加強免疫；
(2) 密切監(jiān)測實驗雞體內(nèi)新城疫病毒疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達到高 峰值時，無菌采取實驗雞脾臟或抗凝血，用脾臟或抗凝血制備淋巴細胞單層；
(3) 對淋巴細胞單層進行傳代培養(yǎng)；
(4) 當淋巴傳代細胞長成單層后，用植物血凝素誘導培養(yǎng)，即獲得抗新城疫 病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽。
本發(fā)明的優(yōu)點
本發(fā)明以先用新城疫病毒免疫動物，再以較少的雞脾臟或抗凝外周血為原 料，制成淋巴細胞單層，在體外培養(yǎng)，誘導淋巴細胞單層即可生產(chǎn)出大量抗新 城疫病毒特異性轉(zhuǎn)移因子和抗菌肽的混合體，本發(fā)明的方法制備的抗新城疫病 毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽無需進一步的提純，可經(jīng)超聲波及凍融簡單處理后 直接將混合體用在禽類體內(nèi)，即可起到抗新城疫病毒及抗菌的作用，同時提高 禽類的免疫力。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例1
一種新城疫病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法，步驟
(1) 免疫
'用新城疫病毒疫苗0.2mL肌肉注射免疫20日齡實驗雞，同步設(shè)立空白對照 組，首次免疫后的第15天后，再以新城疫病毒疫苗0.3mL肌肉注射作為加強 免疫；
(2) 密切監(jiān)測實驗雞體內(nèi)疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達到高峰值時，無 菌采取實驗雞脾臟，用脾臟制備淋巴細胞單層，步驟為A、 處理雞脾臟
取新鮮雞脾臟置于無菌玻璃容器中，加入PBS(pH為7. 2)溶液浸泡半小時 (或浸于質(zhì)量百分濃度為1%的新潔爾滅溶液中)，取出以酒精消毒脾臟表面， 用解剖剪及鑷子去除脾臟脂肪及包膜，用PBS(pH為7.2)液洗滌一次，再將脾 臟剪成小段移入平皿中，最后用眼科剪將脾臟剪成l咖3小塊，再用PBS(pH 為7.2)液洗滌3次，以去除血細胞、色素物質(zhì)及剪碎過程中機械損傷的細胞；
B、 消化及分散組織塊
將上步清洗過的PBS(pH7.2)液吸掉、將剪碎的組織塊移入錐形瓶中，按 組織塊體積的5倍量加入0. 25Q/。胰蛋白酶液(pH為7. 8)，置37。C水浴中消化 40分鐘。每隔10分鐘搖動一次錐形瓶，以便組織塊散開，以利繼續(xù)消化，直 到組織變成松散、表面發(fā)毛時為止，這時從水浴中取出錐形瓶，吸去胰蛋白酶 液，再用PBS(pH為7.2)液洗滌3次，用O. 5%水解乳蛋白——Hanks液洗， 用口徑稍大的細管吹打數(shù)次，用四層紗布濾過；
C、 細胞計數(shù)
采用標有0. lmm字樣的血球計數(shù)板進行計數(shù)，計數(shù)方法與白細胞計數(shù)相 同； '
D、 細胞懸液的分裝和培養(yǎng)
按細胞計數(shù)結(jié)果，將細胞懸液用德DMEM營養(yǎng)液調(diào)整至60萬/毫升細胞懸 液。將細胞懸液分裝入細胞培養(yǎng)瓶(100ml)和細胞轉(zhuǎn)瓶，分裝量為該瓶容量 的1 / 5，蓋上蓋，做好標識，然后將細胞培養(yǎng)瓶和轉(zhuǎn)瓶分別放在二氧化碳培 養(yǎng)箱和轉(zhuǎn)瓶機上培養(yǎng)；
E、 觀察
置于37。C培養(yǎng)的細胞，需逐日進行觀察。若細胞已生長，則要觀察細胞 的形態(tài)特征并判斷其所處的生長階段(游離期、吸附期、繁殖期、維持期和衰 退期)，直至形成淋巴細胞單層。
(3) 對淋巴細胞單層進行傳代培養(yǎng)
在作傳代細胞培養(yǎng)前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下現(xiàn)察，以確定細胞已長 成單層，即可進行細胞的傳代培養(yǎng)。
(4) 當淋巴傳代細胞長成單層后，用植物血凝素誘導培養(yǎng)。 當脾淋巴傳代細胞長成單層后，更換維持液同時加入植物血凝素誘導培養(yǎng)。誘導培養(yǎng)24小時后對產(chǎn)品進行檢驗
將細胞培養(yǎng)物經(jīng)超聲破碎后取樣檢測轉(zhuǎn)移因子和抗菌肽的濃度。 轉(zhuǎn)移因子濃度的測定對轉(zhuǎn)移因子的定量多以多肽含量定量用Folin-
酚法或分光光度法測定多肽含量，以多肽含量lmg為一個轉(zhuǎn)移因子單位。此工 藝生產(chǎn)的轉(zhuǎn)移因子含量是常規(guī)生產(chǎn)的的4 5倍。
抗菌肽濃度測定采用考馬斯亮藍法測定，以牛血清白蛋白為標準溶液，
考馬斯亮藍G250為顯色劑，在分光光度計測定所生產(chǎn)的抗菌肽的濃度。本方 法生產(chǎn)的抗菌肽的濃度是常規(guī)提取量的10倍。 應(yīng)用實例
200只15日齡肉雞(經(jīng)過健康檢查無菌)分為A、 B、 C、 D、 E共5組， 每組40只，B、 C、 D、 E組經(jīng)過人工感染0. 6ml新城疫病毒強毒攻毒后作實驗。 A組為健康組，不感染病毒，不給藥；B組陰性對照組，感染病毒，不給藥；C 組和D組為本發(fā)明的方法制備的產(chǎn)品，C組為低劑量組，按0. 06 g/雞/天注射; D組為藥物組合物高劑量組，按O. 12 g/雞/天注射；E組為傳統(tǒng)"雙黃連口服 液"治療組，按O. lg/雞/天給藥，用藥用天。結(jié)果表明，釆用本發(fā)明抗禽 流感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法制備的產(chǎn)品對新城疫病毒有著 明顯的免疫作用。 實驗結(jié)果如下
編號組另U死亡率％治愈率％有效率％
A健康組087. 5(35/40)100.0(40/40)
B陰性對照組70.0(28/40)2.5(1/40)25.0(10/40)
C低劑量治療組27.5 (11/40)40.0(16/40)72. 5 (29/40)
D高劑量治療組7.5(3/40)70.0(28/40)92. 5(37/40)
E"雙黃連口服 液"治療組25.0(10/40)45.0(18/40)65.0(26/40)
結(jié)果表明，低劑量治療組、高劑量治療組與陰性對照組差異非常顯著(p
<0.01)，說明本發(fā)明一種抗新城疫病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法 制備的產(chǎn)品對新城疫病毒具有顯著的治療作用；特別是高劑量治療組應(yīng)用明顯 優(yōu)于傳統(tǒng)"雙黃連口服液"治療組療效(P<0.01)。
抗菌肽抑菌實驗
抑菌實驗顯示，本發(fā)明所生產(chǎn)的產(chǎn)物能殺死81%以上的革蘭陽性、革蘭陰性細菌和真菌。它的抗菌譜廣，能抑制葡萄球菌、溶血性鏈球菌、大腸桿菌、 產(chǎn)氣單胞菌、綠膿桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌、放線菌、分枝桿菌等十余種近
130株分離株，且實驗中抑菌圈直徑在21fflm以上的細菌在74%以上。 半成品和成品的檢驗
半成品檢定半成品進行細菌內(nèi)毒素、無菌檢査、pH值等項檢測。
成品檢定成品分別作轉(zhuǎn)移因子和抗菌肽的鑒別試驗、外觀檢測、PH值、
多肽含量、特異活性試驗、蛋白質(zhì)反應(yīng)、無菌檢查、細菌內(nèi)毒素、異常毒性等 項檢驗。
實施例2
一種新城疫病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法，步驟
(1) 免疫
用新城疫病毒疫苗0. lmL肌肉注射免疫15日齡實驗雞，同步設(shè)立空白對 照組，首次免疫后的第7天，再以新城疫病毒疫苗0.3mL肌肉注射作為二次免 疫；二次免疫后的第10天，再以新城疫病毒疫苗0.3mL肌肉注射作為第三次 免疫；
(2) 密切監(jiān)測實驗雞體內(nèi)疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達到高峰值時，無 菌采取抗凝血，用外周血制備淋巴細胞單層，步驟為
無菌靜脈采取動物全血25毫升，加1. 2%肝素溶液0. 2ml抗凝，靜置80 分鐘，用帶膠球吸管吸取紅細胞層以上的所有血槳，特別是緊接紅細胞層上的 白細胞層要盡量吸取，分裝于消毒離心管內(nèi)，用PBS(pH為7. 2)液反復洗滌3 次，離心速度800轉(zhuǎn)/分，然后用含30%犢牛血清水解乳蛋白40毫升進行白 細胞培養(yǎng)，均勻混合后分裝于容量100毫升培養(yǎng)方瓶或磚瓶中，塞緊瓶塞，置 37'C恒溫箱中或磚瓶機中培養(yǎng)，經(jīng)3天，白細胞均勻貼壁，即制成淋巴細胞單 層。
(3) 對淋巴細胞單層進行傳代培養(yǎng)；
在作傳代細胞培養(yǎng)前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下觀察，以確定細胞已長 成單層，即可進行細胞的傳代培養(yǎng)。
(4) 當淋巴傳代細胞長成單層后，用植物血凝素誘導培養(yǎng)。當血淋巴傳代細 胞長成單層后，更換維持液同時加入植物血凝素誘導培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)移因子濃度的測定、抗菌肽抑菌實驗的方法、半成品和成品的檢驗項目 均同實施例l。實施例3
一種抗新城疫病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法，由如下步驟組
成-
(1) 用新城疫病毒疫苗0.5mL肌肉注射免疫10日齡實驗雞，首次免疫后的第 20天，再以新城疫病毒疫苗0.3mL肌肉注射加強免疫；
(2) 密切監(jiān)測實驗雞體內(nèi)新城疫病毒疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達到高 峰值時，無菌采取實驗雞脾臟或抗凝血，用脾臟或抗凝血制備淋巴細胞單層；
(3) 對淋巴細胞單層進行傳代培養(yǎng)；
(4) 當淋巴傳代細胞長成單層后，用植物血凝素誘導培養(yǎng)，即獲得抗新城疫 病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽。
實施例4
一種抗新城疫病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法，由如下步驟組
成
(1) 用新城疫病毒疫苗0.4mL肌肉注射免疫60日齡實驗雞，首次免疫后的第 12天，再以新城疫病毒疫苗.0.3mL肌肉注射加強免疫；
(2) 密切監(jiān)測實驗雞體內(nèi)新城疫病毒疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達到高 峰值時，無菌采取實驗雞脾臟或抗凝血，用脾臟或抗凝血制備淋巴細胞單層；
(3) 對淋巴細胞單層進行傳代培養(yǎng)；
(4) 當淋巴傳代細胞長成單層后，用植物血凝素誘導培養(yǎng)，即獲得抗新城疫 病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽。
權(quán)利要求
1.一種抗新城疫病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法，其特征是由如下步驟組成(1)用新城疫病毒疫苗0.1-0.5mL肌肉注射免疫10-60日齡實驗雞，首次免疫后的第7-20天，再以新城疫病毒疫苗0.3mL肌肉注射加強免疫；(2)密切監(jiān)測實驗雞體內(nèi)新城疫病毒疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達到高峰值時，無菌采取實驗雞脾臟或抗凝血，用脾臟或抗凝血制備淋巴細胞單層；(3)對淋巴細胞單層進行傳代培養(yǎng)；(4)當淋巴傳代細胞長成單層后，用植物血凝素誘導培養(yǎng)，即獲得抗新城疫病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗新城疫病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法，由如下步驟組成(1)用新城疫病毒疫苗免疫實驗雞；(2)密切監(jiān)測實驗雞體內(nèi)新城疫病毒疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達到高峰值時，無菌采取實驗雞脾臟或抗凝血，用脾臟或抗凝血制備淋巴細胞單層；(3)對淋巴細胞單層進行傳代培養(yǎng)；(4)當淋巴傳代細胞長成單層后，用植物血凝素誘導培養(yǎng)，即獲得抗新城疫病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽。本發(fā)明的方法制備的抗新城疫病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽無需進一步的提純，可經(jīng)超聲波及凍融簡單處理后直接將混合體用在禽類體內(nèi)，即可起到抗新城疫病毒及抗菌的作用，同時提高禽類的免疫力。
文檔編號C07K14/435GK101684143SQ20081015176
公開日2010年3月31日 申請日期2008年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月25日
發(fā)明者王連民, 田杏芳 申請人:天津生機集團股份有限公司