Pf-EGFR有I個(gè)EGF受體L結(jié)構(gòu)域（EGF rec印tor, L domain) (95_215aa)，l 個(gè)N端類膜島素結(jié)合蛋白（N-terminal insulin-like growth factor binding protei)(236_329aa)，1個(gè)弗林蛋白酶半脫氨酸豐富結(jié)構(gòu)域（Furin-like cysteine-rich domain) (232_328aa)，1 個(gè)弗林蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)（Furin-1 ike repeat) (271_322aa)〇
[0059]
[0061] Pf-EGFR的cDNA序列及其氨基酸序列
[0062] 預(yù)測(cè)的氨基酸序列在cDNA序列上方顯示，起始密碼子和終止密碼子用黑色字體 表示，信號(hào)肽以下劃的間斷線表示，EGF受體L結(jié)構(gòu)域用下劃線表示，蛋白激酶C(PKC)磷酸 化位點(diǎn)用加方框的斜體黑字表示，N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)用方框表示，N端糖基化位點(diǎn)用灰 底黑字表示，酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)用灰底方框黑字表示。
[0063] 3. 2 Pf-EGFR基因序列比對(duì)及進(jìn)化樹構(gòu)建
[0064] Pf-EGFR氨基酸序列與其他物種EGFR基因氨基酸序列的比對(duì)用Clustal W2 和DNAMAN進(jìn)行，比對(duì)結(jié)果顯示Pf-EGFR與其他物種EGFR有22. 78~56. 71 %的相似 性，其中與葡萄牙牡嫩（Crassostrea angulate)的EGFR的相似性最高，占51. 67 % (圖1)。多重比對(duì)的序列來(lái)源有：合浦珠母貝（P. fucata，KP027299)，葡萄牙牡蠣 (C. angulate, ACU33974. 1)，霸王蓮花青螺（Lottia gigantean, ESP04264. 1)，小家鼠 (Mus musculus，AAA17899.1)，人（Homo sapiens, ΝΡ_005219· 2)，班胸草雀（Taeniopygia guttata, ΧΡ_002196468· 2)，熱帶爪蟾（Xenopus tropicalis, ΧΡ_002939960· 2)，斑馬魚 (Danio rerio，NP_919405. 1)，刀劍尾魚（Xiphophorus xiphidium，AAD10500.2)，金小蜂 (Nasonia vitripennis，XP_001602830. 2)，雙斑峨（Gryllus bimaculatus，BAG65666.1)， 果幡（Drosophila melanogaster, AAR85245· 1)，靜水椎實(shí)螺（Lymnaea stagnalis，ABQ10634. 1)，雜色鮑（Haliotis diversicolor，F(xiàn)M78688. 1)。
[0065] 用MEGA5. 0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap置信值為1000,如圖2所示，進(jìn)化 樹以秀麗隱桿線蟲作為外群，脊椎動(dòng)物與無(wú)脊椎動(dòng)物分別聚為一支，對(duì)于脊椎動(dòng)物來(lái) 說(shuō)，哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行類、魚類分別自聚為一支，與它們?cè)谏飳W(xué)上的地位一致；對(duì) 于無(wú)脊椎動(dòng)物，Pf -EGFR與葡萄牙牡嫩（C. angulate) EGFR和靜水椎實(shí)螺（Lymnaea stagnalis)EGFR聚在一起，表明Pf-EGFR與它們進(jìn)化關(guān)系比較近。用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 的物種有：合浦珠母貝（P. fucata，KP027299)，葡萄牙牡蠣（C. angulate, ACU33974. 1)， 霸王蓮花青螺（L.gigantean，SP04264. 1)，小家鼠（M.musculus，AAA17899. 1)，人 類（H.sapiens，NP_005219.2)，班胸草雀（T.guttata，XP_002196468.2)，熱帶爪 蟾（X. tropicalis，XP_002939960. 2)，斑 馬魚（D. rerio, ΝΡ_919405· 1)，刀劍尾 魚（X.xiphidium，AAD10500.2)，金小蜂（N.vitripennis，XP_001602830.2)，雙斑 峨（G.bimaculatus，BAG65666. 1)，果幡（D.melanogaster，AAR85245. 1)，靜水椎實(shí)螺 (L. stagnalis, ABQ10634. 1)，雜色鮑（H. diversicolor, AFM78688. 1)，秀 _ 隱桿線蟲 (Caenorhabditis elegans, P24348. 3)〇
[0066] 實(shí)施例2
[0067] (I)Pf-EGFR基因 mRNA在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)
[0068] 通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)Pf-EGFR在合浦珠母貝外套膜、閉殼肌、鰓、肝胰腺、珍珠囊、腸、 性腺中的表達(dá)，結(jié)果如圖3所示，Pf-EGFR在合浦珠母貝不同組織中均有表達(dá)，然而在珍珠 囊、外套膜、腸中的表達(dá)顯著高于其他組織。
[0069] 通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)Pf-EGFR在合浦珠母貝擔(dān)輪期、D-型期、殼頂期、眼點(diǎn)期、變態(tài) 期的表達(dá)情況，結(jié)果如圖4所示，Pf-EGFR在不同時(shí)期的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，在變態(tài) 期的表達(dá)最高，顯著高于其他時(shí)期。
[0070] ⑵Pf-EGFR原位雜交
[0071] Pf-EGFR基因 mRNA在外套膜中的原位雜交如圖5所示，較強(qiáng)的雜交信號(hào)出現(xiàn)在外 套膜外褶的內(nèi)表皮細(xì)胞與內(nèi)褶的外表皮細(xì)胞上，較淺的信號(hào)出現(xiàn)在中褶的外表皮細(xì)胞，陰 性對(duì)照無(wú)雜交信號(hào)。
[0072] Pf-EGFR基因 mRNA在珍珠囊中的原位雜交如圖6所示，雜交信號(hào)在整個(gè)珍珠囊表 皮細(xì)胞以及結(jié)蹄組織中都有檢測(cè)到，陰性對(duì)照無(wú)雜交信號(hào)。
[0073] EGFR是一個(gè)具有酪氨酸激酶活性（PTK)的受體，EGFR介導(dǎo)的信號(hào)通路參與了生物 體細(xì)胞的應(yīng)答過(guò)程，比如細(xì)胞的增殖、分化、存活、運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞凋亡等。EGFR這些途徑在一些 模式和經(jīng)濟(jì)物種中已經(jīng)得到了研宄，比如斑馬魚（D.rerio)、雜色鮑（H. diversicolor)和 葡萄牙牡蠣（C.angulate)等。在本發(fā)明中，本發(fā)明發(fā)明人從合浦珠母貝中克隆得到了 EGFR 基因 Pf-EGFR，在Pf-EGFR中有4個(gè)蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點(diǎn)，4個(gè)N-肉豆蔻?；?點(diǎn)，7個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)，在仿刺參（A. japonicas)、葡萄牙牡嫩（C. angulate)和 人（H. sapiens)中同樣存在這些位點(diǎn)，此外，Pf-EGFR具有EGF受體L結(jié)構(gòu)域和一個(gè)弗林蛋 白酶樣半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域，是ErbB蛋白家族的特征結(jié)構(gòu)域，表明Pf-EGFR是ErbB蛋白家 族的成員。進(jìn)化樹顯示，Pf-EGFR被歸入軟體動(dòng)物中，這與其在生物學(xué)上的分類是一致的 (圖2)。然而，Pf-EGFR的氨基酸序列比人（H. sapiens)少的多，并且其基因組外顯子與內(nèi) 含子的數(shù)量也比脊椎動(dòng)物少的多，在果幡（D. melanogaster)與合浦珠母貝（P. fucata)中， EGFR分別只有5-6個(gè)外顯子、4-5個(gè)內(nèi)含子，然而在斑馬魚（D. rerio)與人（H. sapiens)中， 分別有25-27個(gè)外顯子，24-25個(gè)內(nèi)含子。所有的這些研宄結(jié)果表明，從低等到高等生物， EGFR結(jié)構(gòu)變的越來(lái)越復(fù)雜，以滿足高等動(dòng)物對(duì)復(fù)雜功能的要求，這表明EGFR在生物進(jìn)化的 過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用?；蚪M結(jié)構(gòu)的變化也表明，越高等的生物對(duì)基因的結(jié)構(gòu)要求越 復(fù)雜，符合進(jìn)化的規(guī)律。
[0074] 用qRT-PCR研宄Pf-EGFR在組織中的表達(dá)，相對(duì)熒光定量表明，Pf-EGFR在所有研 宄的組織中都有表達(dá)，在珍珠囊、外套膜、腸中的表達(dá)比較高，在肌肉和肝胰腺組織中表達(dá) 量較低。EGFR在雜色鮑（H. diversicolor)的外套膜中的表達(dá)量是比較豐富的，這與我們的 研宄結(jié)果類似。在仿刺參（A. japonicas)中，EGFR主要表達(dá)在體腔細(xì)胞和表皮細(xì)胞中，這表 明EGFR在表皮細(xì)胞豐富的組織中表達(dá)量較高。EGFR在不同的組織中起著不同的作用。Tice 和Biscard等人發(fā)現(xiàn)EGFR可以促進(jìn)小鼠纖維細(xì)胞的有絲分裂，從而過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致腫瘤的發(fā) 生，更有研宄表明EGFR為細(xì)胞的迀移和運(yùn)動(dòng)提供能量。EGFR可以加快斑馬魚（D. rerio)和 果幡（D. melanogaster)卵母細(xì)胞的發(fā)育。果幡（D. melanogaster) EGFR對(duì)果幡翅脈的形成 有促進(jìn)作用。因此本發(fā)明實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EGFR在合浦珠母貝珍珠囊與外套膜中表達(dá)量較高，其參 與了合浦珠母貝的生物礦化過(guò)程，因?yàn)橥馓啄な切纬韶悮ぃ瑓⑴c生物礦化重要的組織。外套 膜由內(nèi)外表皮、其間的結(jié)蹄組織以及肌肉組織和神經(jīng)組成，大致分為邊緣、緣膜和中心三部 分，邊緣部分頂端有三個(gè)突起，由殼向內(nèi)臟團(tuán)依次為外褶、中褶和內(nèi)褶。已經(jīng)有研宄表明，外 套膜的不同區(qū)域有著不同的作用，珍珠層和棱柱層分別由外套膜中心表皮細(xì)胞與外套膜邊 緣表皮細(xì)胞形成?；谝陨辖M織表達(dá)結(jié)果，本發(fā)明發(fā)明人利用組織原位雜交研宄了 Pf-EGFR 在合浦珠母貝外套膜和珍珠囊中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，強(qiáng)烈的雜交信號(hào)出現(xiàn)雜在外套膜 的外褶的內(nèi)表皮細(xì)胞與內(nèi)褶的外表皮細(xì)胞，較淺的信號(hào)出現(xiàn)在外套膜的中褶。與此同時(shí)，在 珍珠囊中，雜交信號(hào)貫穿整個(gè)珍珠囊的表皮細(xì)胞與結(jié)蹄組織中。這些結(jié)果表明，外套膜和珍 珠囊中高表達(dá)的EGFR在某種程度上可以促進(jìn)合浦珠母貝貝殼和珍珠的形成。
[0075] 雙殼貝類在變態(tài)過(guò)程中很多形態(tài)特征發(fā)生重要的變化，比如面盤的消失，嘴和足 的重新定位以及唇瓣和鰓的生長(zhǎng)。如圖3,從擔(dān)輪期到變態(tài)期，合浦珠母貝Pf-EGFR呈現(xiàn) 逐漸升高的趨勢(shì)，在變態(tài)期的表達(dá)量最高。在葡萄牙牡蠣（C.angulate，）中，EGFR同樣在 變態(tài)期的表達(dá)量最高。Okazaki和Shizuri發(fā)現(xiàn)，EGFR酪氨酸激酶抑制劑能有效抑制藤壺 (Barnacle amphitrite)幼蟲的附著和變態(tài)。這些結(jié)果表明，EGFR在軟體動(dòng)物早期幼蟲的 發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用。
[0076] 綜上所述，本發(fā)明發(fā)明人首次從合浦珠母貝中克隆出來(lái)合浦珠母貝EGFR基因 Pf-EGFR并做了基因的生物信息學(xué)分析，此外，我們分析了 Pf-EGFR在不同組織和不同幼蟲 階段的mRNA表達(dá)模式。更重要的是，我們通過(guò)原位雜交確定Pf-EGFR基因在外套膜和珍珠 囊表達(dá)的精確位置，表明了 Pf-EGFR可以影響貝殼與珍珠的形成。
[0077] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制。其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種合浦珠母貝表皮生長(zhǎng)因子受體基因Pf-EGFR，其特征是：該基因Pf-EGFR的 cDNA核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的合浦珠母貝表皮生長(zhǎng)因子受體基因Pf-EGFR，其特征是：該基 因Pf-EGFR的cDNA核苷酸序列的154bp~156bp為起始密碼子ATG，1168~1170bp為終 止密碼子TGA，擁有1017bp開放閱讀框。3. -種合浦珠母貝表皮生長(zhǎng)因子受體基因Pf-EGFR，其特征是：它的氨基酸序列如SEQ IDNO. 2 所示。4. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的合浦珠母貝表皮生長(zhǎng)因子受體基因Pf-EGFR在促進(jìn)合浦 珠母貝貝殼和珍珠形成方面的用途。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種合浦珠母貝表皮生長(zhǎng)因子受體基因Pf-EGFR，該基因Pf-EGFR的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，本發(fā)明還公開了合浦珠母貝表皮生長(zhǎng)因子受體基因Pf-EGFR在促進(jìn)合浦珠母貝貝殼和珍珠形成方面的用途。
【IPC分類】C07K14/71, C12N15/12
【公開號(hào)】CN104911188
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510207814
【發(fā)明人】喻達(dá)輝, 朱文杰, 張東玲, 黃桂菊, 范嗣剛
【申請(qǐng)人】中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所, 集美大學(xué)
【公開日】2015年9月16日
【申請(qǐng)日】2015年4月28日