專利名稱：檢測小麥三種銹菌的單克隆抗體、免疫熒光方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)，特別是涉及檢測小麥三種銹菌的單克隆抗體、免疫熒 光方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
小麥銹病包括致病菌包括小麥條銹菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)、 小麥葉繡菌(Puccinia triticina f. sp. tritic)禾口小麥禾干繡菌(Puccicinia graminis f. sp. tritici)，是一類世界性禾谷類作物的重要病害。小麥銹病具有發(fā)生區(qū)域廣、暴發(fā)性 強、流行頻率高、危害損失重等特點，嚴(yán)重威脅著我國小麥的生產(chǎn)安全，而在我國以小麥條 銹病的發(fā)生最為廣泛，是影響我國小麥生產(chǎn)安全的首要病害，主要發(fā)生在西北、西南、長江 中下游和華北等有關(guān)省(市、自治區(qū))，每年發(fā)生面積約6000萬畝，經(jīng)大力防治后仍年均減 產(chǎn)小麥10億公斤左右；其次是小麥葉銹病，在西南和長江流域一帶發(fā)生最重，華北和東北 地區(qū)每年也有較重危害，而小麥葉銹病中，小麥葉銹菌生理小種或致病類型以PHT、THT兩 個小種為主(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，蒲志剛，碩士論文“小麥葉銹菌群體毒性與DNA多態(tài)性關(guān)系分 析及生理小種分子鑒定研究” 2004)；小麥稈銹病過去主要分布在東南沿海、長江流域和福 建、廣東、廣西的冬麥區(qū)及東北、內(nèi)蒙古等春麥區(qū)發(fā)生流行(李振岐和曾士邁，2000)，通過 沿海地區(qū)病菌越冬菌源基地治理和洛夫林系統(tǒng)抗病品種的廣泛種植，近30年來基本控制 了該病害的流行危害，但在西南、淮北和東北等局部地區(qū)每年仍有不同程度的發(fā)生。病害的早期診斷檢測是準(zhǔn)確測報和有效防控的基礎(chǔ)和前提。長期以來，銹病的診 斷主要基于病原菌的生物學(xué)及病害癥狀的特征，其預(yù)測預(yù)報主要基于定期、大規(guī)模的田間 病葉調(diào)查和室內(nèi)病菌小種的活體分離、培養(yǎng)和鑒定。而條銹病和葉銹病的苗期癥狀區(qū)別不 甚明顯，一些基層植保人員常常將二者混淆；在小麥銹病潛育階段，寄主的發(fā)病癥狀不易觀 察，難以界定初侵染的時期和規(guī)模。這些用于銹病診斷及病情測報的傳統(tǒng)方法不僅耗時費 工，且其準(zhǔn)確性和可靠度在很大程度上取決于調(diào)查測報人員的經(jīng)驗積累與技術(shù)水平，難以 滿足病害的快速、高通量診斷檢測實際需求。因此，有必要研發(fā)簡單易行、靈敏準(zhǔn)確的小麥 銹病快速診斷和檢測技術(shù)，其于鑒別病害、提高病害預(yù)測預(yù)報的準(zhǔn)確度均具有重要的理論 意義和實際應(yīng)用價值。目前，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所麥類病害實驗室已經(jīng)針對這一生產(chǎn)中面 臨的實際問題，建立了小麥條銹菌和葉銹菌種的特異性分子診斷檢測技術(shù)(Cao et al., 2007 ；曹麗華等，2007)。然而，該類基于PCR擴增的病菌核酸檢測技術(shù)不但需要配置一些特 殊儀器如PCR儀、凝膠電泳裝置等，且對操作人員的技術(shù)水平要求較高，難以在眾多基層植 ?？萍脊ぷ髡吆图夹g(shù)人員中推廣應(yīng)用。單克隆抗體技術(shù)，是由單細胞系列產(chǎn)生的同一種抗體蛋白，其僅與抗原分子中的 一個抗原決定簇結(jié)合，故與抗原性物質(zhì)反應(yīng)時相對專一，不受其它物質(zhì)干擾，能區(qū)別物種間 的細微差異。利用該方法檢測病原菌具有諸多優(yōu)點，如易于大量生產(chǎn)、可高通量檢測、免用 標(biāo)記物，較易實現(xiàn)病菌的快速、實時、實地檢測(Ward et al. ,2004 ；Werres & Steffens，1994)，促使其迅速在農(nóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。同時，該方法涉及的儀器化程 度較低、操作簡便，特別是對樣本前處理要求簡單易于推廣，國際上許多權(quán)威機構(gòu)將其列 為優(yōu)先發(fā)展的分析技術(shù)之一。因而，單克隆抗體技術(shù)是實現(xiàn)田間快速檢測病原菌的好方 法(Danks & Barker，2000 ;Dewey et al. , 1990 ；Ward et al.，2004)。自上世紀(jì) 80 年代 以來，單克隆抗體技術(shù)已廣泛應(yīng)用于一些卵菌病原菌的生物學(xué)、分類學(xué)及致病性方面的研 究，諸如 Phytophthora cinnamomi (Hardham et al. , 1986 ；Gabor et al. , 1993), Pythium aphanidermatum(Estrada-Garcia et al. ,1989), 及 Aphanomyces invadans(Miles et al. , 2003),且成功石if 發(fā)了水生真菌 Salmonella sp. , Escherichia coli、Listeria monocytoenes(Bokken et al. , 2003 ；Fratamico et al. , 1998 ；Kouboves et al. ,2001 ； Leonard et al.，2004)及幾種細菌病原菌單克隆抗體檢測技術(shù)(Ipbal et al.，2000)。丹 麥農(nóng)科院作為我們的合作伙伴，目前已經(jīng)在小麥條銹菌的單克隆抗體研究方面取得了一些 進展(Skottrup et al.，2007)，我們實驗室最近已經(jīng)獲得多株小麥葉銹菌的單克隆抗體。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光 素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測組織或細胞內(nèi)的相應(yīng)抗原 (或抗體)。在組織或細胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡 觀察標(biāo)本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光，可以看見熒光所在的組織細胞， 從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、種類。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種可檢測小麥銹菌的單克隆抗體，并結(jié)合免疫熒光技術(shù)提供能同時 區(qū)分小麥葉銹菌、稈銹菌、條銹菌的檢測方法和試劑盒，具有特異性好、靈敏度高、操作簡便 快速的優(yōu)點。檢測小麥三種銹菌的單克隆抗體，其特征在于由保藏號為CGMCC No. 4414的雜交 瘤細胞分泌。上述單克隆抗體在檢測小麥銹病中的應(yīng)用。檢測小麥三種銹菌的免疫熒光方法，步驟如下(1)制備待測底片在待測植株或組織的水浸泡液中按質(zhì)量體積比0. 02g IOOml 的比例加入多聚賴氨酸，將所得溶液涂于載玻片上，晾干；(2)用PBS洗上述載玻片；(3)在載玻片上加上述單克隆抗體，4°C孵育過夜；(4)常溫復(fù)溫10分鐘后用PBS洗玻片，然后在載玻片加熒光標(biāo)記的二抗進行孵 育；(5)用甘油緩沖液封片，所述甘油緩沖液的配方為0. 05M碳酸鈉鹽緩沖液，pH8. 0， 50% (ff/V)甘油；(6)鏡檢；步驟(4)中，所述熒光標(biāo)記的二抗為PE_Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG，所述孵育的條件 為37°C，90分鐘。檢測小麥三種銹菌的試劑盒，特征在于包括免疫熒光檢測板和熒光標(biāo)記檢測抗 體，所述免疫熒光檢測板上包被保藏號為CGMC No. 3464的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體作為包被抗體，所述熒光標(biāo)記檢測抗體為上述單克隆抗體。所述熒光為PE_Cy3。本發(fā)明采用小麥葉銹菌生理小種PHT和/或THT的夏孢子作為抗原得到一系列雜 交瘤細胞株，其中保藏號CGMCC No. 4414的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體能夠用于特異地 檢測小麥三種銹菌。如圖1-5所示本發(fā)明基于上述單克隆的特性，結(jié)合免疫熒光檢測技術(shù)，提供了檢測小麥銹菌的 免疫熒光方法，實現(xiàn)在熒光顯微鏡下對三種銹菌的區(qū)分。本發(fā)明為了使小麥銹菌檢測途徑更為便捷，基于上述單克隆抗體及熒光免疫方法 還提供了試劑盒。試劑盒的原理為Elisa反應(yīng)，采用保藏號為CGMCC No. 3464的雜交瘤細 胞株分泌的單克隆抗體作為包被抗體包被在檢測板上，本發(fā)明的單克隆抗體為檢測抗體， 并被熒光標(biāo)記稱熒光標(biāo)記檢測抗體，檢測時，在檢測板上滴加待測菌懸液，然后加入試劑盒 所帶的熒光檢測抗體進行孵育反應(yīng)。只需在熒光顯微鏡下觀察即可得出檢測結(jié)論。非常便 捷、高效、低成本。雜交瘤細胞株LPT-2。分類命名對小麥葉銹菌的單克隆抗體雜交瘤細胞株。保藏號CGMCCNo. 4414。保藏日期2010年12月6日。保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。


圖1，葉銹菌由于被其特異性單克隆抗體所捕獲在載破片上，經(jīng)過PE_Cy3標(biāo)記的 二抗孵育后鏡檢顯示明黃色，400倍放大。圖2-3分別為稈銹菌和條銹菌，由于均未與葉銹菌的單克隆抗體相結(jié)合，與二抗 孵育顯示信號分別為暗黃色及綠色，400倍放大。圖4為三種銹菌的混合檢測，可利用這三種顏色差異可直觀分辨出葉銹菌和其他 銹菌，200倍放大。圖5為檢測靈敏度實驗，該單克隆抗體的檢測靈敏度可達2ng/ml，200倍放大。
具體實施例方式實驗材料小麥葉銹菌小種PHT、THT及其夏孢子，本實驗室有保存，可向公眾發(fā) 放。小麥品種鄭麥5389，本實驗室有保存，可向公眾發(fā)放試劑=PBS:0. 01Μ，ρΗ7· 4(配方:8g NaCl,0. 2g KCl、1. 44g Na2HP04,0. 24g KH2P04, 溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 4，最后加蒸餾水定容至1L)PBS-T (含有 0. O5 % 的吐溫 2O 的 PBS)甘油緩沖液0. 05M碳酸鹽緩沖液pH8. 0,50% (ff/V)甘油實施例1 小麥葉銹菌的擴繁本發(fā)明根據(jù)目前中國小麥銹菌發(fā)生流行狀況，選擇小麥葉銹菌的主要流行小種PHT、THT為實驗材料，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所的高溫室進行鑒定與大量擴繁。具體步驟如下1.種植小麥葉銹菌的感病品種鄭麥5389，等到第2片新葉長出的時候，進行PHT、 THT的接種。2.接種前用裝有清水的小型噴壺把小麥葉片噴濕，操作人員的雙手經(jīng)酒精消毒 后，蘸取清水輕輕抹去葉面的蠟紙層，手蘸葉銹菌夏孢子，涂抹在小麥葉片上，來回多抹幾 次抹勻。3.抹過銹菌后，實驗員的雙手先用70%的酒精沖洗，再用流動的自來水沖洗干 凈。4.然后輕輕的把接種好的小麥苗子放入接種用的預(yù)先沖洗干凈的鋁質(zhì)圓桶里，均 勻的噴上水霧，看見有葉片表面有細霧即可，切忌噴水過多。5.加蓋塑料薄膜，黑暗條件下16°C下培養(yǎng)M小時。6.取出接種的小麥苗，室溫培養(yǎng)(20 25°C)，待接種后的小麥葉銹菌出現(xiàn)褪綠斑 時，要剪去新葉，罩上已經(jīng)高溫滅菌的干凈玻璃罩。7.采集菌種時，把花盆放在臺子上，用手平托玻璃罩，用細的鐵條輕輕敲擊，使夏 孢子落入罩內(nèi)，再敲擊罩子，使孢子粉在罩子內(nèi)呈一條線，傾倒入寫好標(biāo)簽的小試管里。實施例2 小麥葉銹菌免疫小鼠1.收集新鮮擴繁的2種小麥葉銹菌孢子，經(jīng)顯微鏡計數(shù)后，稱量小麥葉銹菌PHT與 THT夏孢子各0. 15mg(5X105個孢子/mg)，加入675 μ 1生理鹽水與675 μ 1弗氏完全佐劑 (美國sigma公司，貨號F5881)，放入注射筒中，將2個注射筒接起來，來回推動混勻得到乳 化抗原。2.取4 8周齡雌性Balb/C小鼠，取200 μ 1乳化抗原以皮下多點注射的方式進 行免疫。3周后，夏孢子懸液與弗氏不完全佐劑混合乳化，3周后，以弗氏不完全佐劑(美國 sigma公司，貨號F5506)代替弗氏完全佐劑與菌液混合乳化，按照相同劑量及方式進行免 疫，后續(xù)免疫均按照此方案進行。第3次加強免疫后，每次免疫后的第10天進行小鼠眼下 部位采血，采用間接ELISA法測定血清的效價與特異性。3.測定血清效價時，須預(yù)先準(zhǔn)備預(yù)包被有PHT、THT夏孢子的酶標(biāo)板孔，具體操作 如下(1)將步驟1中的夏孢子懸液，以100μ 1每孔加入酶標(biāo)板孔，放置于37°C恒溫箱 中孵育16h，取出后以PBS-T (含有0. 05%的吐溫20)洗板3次，再向每孔加入200 μ 1含有
的脫脂奶粉的PBS于37°C封閉池后儲存?zhèn)溆谩?2)將梯度稀釋的抗血清100 μ 1加入酶標(biāo)板孔，放置于37°C孵育lh，而后加入用 PBS稀釋1000倍的羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37°C孵育Ih后取出洗板。(3)加入100 μ 1的單組份顯色底物(丹麥Kem-en-tec司，貨號4800H)，37°C孵育 IOmin0(4)以0. 2M的硫酸溶液中止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定450nm吸光度值。表1為其中一 次的測定數(shù)據(jù)。表1血清效價測定結(jié)果示例
權(quán)利要求
1.檢測小麥三種銹菌的單克隆抗體，其特征在于由保藏號為CGMCCNo. 4414的雜交瘤 細胞分泌。
2.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在檢測小麥銹病中的應(yīng)用。
3.檢測小麥三種銹菌的免疫熒光方法，步驟如下(1)制備待測底片在待測植株或組織的水浸泡液中按質(zhì)量體積比為0.02g IOOml 的比例加入多聚賴氨酸，將所得溶液涂于載玻片上，晾干；(2)用PBS洗上述載玻片；(3)在載玻片上加權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，4°C孵育過夜；(4)常溫復(fù)溫10分鐘后用PBS洗玻片，然后在載玻片加熒光標(biāo)記的二抗進行孵育；(5)用甘油緩沖液封片，所述甘油緩沖液的配方為0.05M碳酸鈉鹽緩沖液，pH8. 0,50% (W/V)甘油；(6)鏡檢。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫熒光方法，步驟(4)中，所述熒光標(biāo)記的二抗為PE-Cy3 標(biāo)記的羊抗鼠IgG，所述孵育的條件為37°C，90分鐘。
5.檢測小麥三種銹菌的試劑盒，特征在于包括免疫熒光檢測板和熒光標(biāo)記檢測抗體， 所述免疫熒光檢測板上包被保藏號為CGMC No. 3464的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體作 為包被抗體，所述熒光標(biāo)記檢測抗體為權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，所述熒光為PE-Cy3。
全文摘要
本發(fā)明“檢測小麥三種銹菌的單克隆抗體、免疫熒光方法及試劑盒”，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明主要提供用于檢測小麥三種銹菌的單克隆抗體，該單克隆抗體由保藏號為CGMCC No..4414的雜交瘤細胞株分泌，能夠同時鑒別檢測小麥葉銹菌、稈銹菌、條銹菌。還提供了基于該單克隆抗體與免疫熒光技術(shù)相結(jié)合的檢測方法及試劑盒。具有特異性好、靈敏度高、操作簡便快速的優(yōu)點。
文檔編號C07K16/16GK102101887SQ201010591010
公開日2011年6月22日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者劉博 , 劉太國, 陳萬權(quán), 高利 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所