x，然后根據(jù)RBSDV增 殖指數(shù)趨勢線公式評(píng)價(jià)待測水稻品種對(duì)水稻黑條矮縮病的抗性水平和抗性等級(jí)。
[0012] 所述步驟1)中的帶毒灰飛虱的獲取步驟為： 1. 1)RBSDV毒源獲?。簭乃竞跅l矮縮病重病區(qū)田間采集表現(xiàn)為水稻黑條矮縮病癥狀 的分蘗盛期水稻病株，-70°C保存； 1. 2)傳毒介體繼代繁殖：大田采集并純化灰飛虱高齡若蟲，用水稻幼苗飼養(yǎng)并傳代； 1. 3)介體飼毒：飼毒時(shí)從_70°C冰箱中取出水稻黑條矮縮病病株，常溫放置3_5h使病 株自然展開，然后用吸水棉布包裹病株根部后用塑料袋緊密包扎，確保水不會(huì)流出，然后將 其移入保鮮盒內(nèi)，將室內(nèi)人工飼養(yǎng)的1. 5-2. 5齡期灰飛虱若蟲轉(zhuǎn)入保鮮盒內(nèi)的RBSDV毒源 水稻上，25°C飼毒48h后移除毒源，將灰飛虱轉(zhuǎn)移到幼嫩水稻秧苗上飼養(yǎng)度過循回期即為 帶毒灰飛虱。
[0013] 所述步驟1)中的高抗鑒定標(biāo)尺為室內(nèi)接毒鑒定中抗病表現(xiàn)在當(dāng)?shù)厮酒贩N資源 中排名為9%-11% ;中抗鑒定標(biāo)尺排名為23%-27% ;感病鑒定標(biāo)尺排名為47%-53%。
[0014] 所述步驟2)中的適宜濃度的IAA溶液濃度為1. 5-2. 5ymol/L;所述的低氧浸種 方法為種子置于液面下5-10cm處培養(yǎng)；所述的適宜濃度的ABA溶液濃度為40-60ymol/L。
[0015] 所述步驟2)中的定量接種帶毒灰飛虱為5-8蟲/個(gè)胚芽鞘的比例。
[0016] 所述步驟3)和步驟4)中的周期取樣時(shí)間點(diǎn)為RBSDV傳毒后4-10天內(nèi)每隔 1. 5-2. 0天均勻分布的3-4個(gè)時(shí)間點(diǎn)；所述步驟3)中的胚芽鞘的特定部位為胚芽鞘長度的 正中間部位。
[0017] 所述步驟3)中的RNA提取方法為：取適量葉片加液氮于研缽中迅速磨碎，按 比例加入TRI-Reagent到1. 5ml離心管中，樣品體積不應(yīng)超過TRI-Reagent體積10%， 4°C12000Xg低溫離心1.5min，然后小心轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中；所述的RNA純化方法 為：a)直接添加一體積（95%_100%)酒精到已經(jīng)溶解于TRI-Reagent的上清液中，漩渦混勻； b)轉(zhuǎn)移到吸附柱中過濾(吸附柱置于收集管中），然后12000Xg離心lmin，之后把吸附柱轉(zhuǎn) 移到新的收集管中；c)加400 yl RNA Wash Buffer到離心柱中，12000Xg離心lmin;d)將80 yl配好的DNAase I cocktail buffer直接加到離心柱中，25_37°C水浴加熱離心柱 15min，12000X g離心30s ;e)添加400 y 1 RNA Prewash到吸附柱中，12000X g離心lmin， 收集過濾的液體，重復(fù)此步驟；f)添加700 yl RNA Wash Buffer到吸附柱中，12000Xg離 心lmin，然后從收集管中小心轉(zhuǎn)移吸附柱到一個(gè)新的RNase-free 1. 5ml離心管中；g)至少 添加25yl DNase/RNase-Free Water到離心管基質(zhì)中，最大速度離心lmin，被洗脫的RNA 可以直接利用或保存于_70°C超低溫冰箱中。
[0018] 所述步驟3)中的熒光定量PCR所采用的引物為RBSDV病毒S9片段引物：RBSDV-F: 5' -GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT-3' 和RBSDV-R:5' _GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3' ；熒光 定量反應(yīng)體系：每 20yL中含 10yL的 2XqPCRmastermix(Promega)、1. 0yL的cDNA模 板、8. 2yL的ddH20以及0. 8yL的10剛引物RBSDV-R和RP;實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增程序 為：95°C預(yù)變性2min，95°C變性15s，60°C退火15s，72°C延伸20s，共進(jìn)行40次循環(huán)，95°C變 性 15s，60°C退火lmin，95°C變性 15s。
[0019] 所述步驟4)中的根據(jù)RBSDV增殖指數(shù)趨勢線公式評(píng)價(jià)待測水稻品種對(duì)水稻黑條 矮縮病的抗性水平和抗性等級(jí)的劃分方法為： 4. 1)待測品種抗性水平劃分：根據(jù)每個(gè)品種RBSDV增殖指數(shù)趨勢線公式y(tǒng)=Aekx評(píng)價(jià)待 測水稻品種的抗性水平，即公式中k值大的品種比k值小的品種對(duì)RBSDV抗性低； 4. 2)待測品種抗性等級(jí)劃分：根據(jù)待測品種和鑒定標(biāo)尺k值大小來評(píng)價(jià)待測品種的抗 性等級(jí)，即待測品種k值小于等于尚抗標(biāo)尺為尚抗品種；待測品種k值大于尚抗標(biāo)尺且小 于等于中抗標(biāo)尺的為中抗品種；待測品種k值大于中抗標(biāo)尺且小于等于感病標(biāo)尺為感病品 種；待測品種k值大于感病標(biāo)尺為超感品種。
[0020] 所述步驟1. 3)中的灰飛虱飼毒后的循回期為22-28天。
【附圖說明】
[0021] 附圖1為對(duì)實(shí)施例所選擇的鑒定標(biāo)尺胚芽鞘傳毒后周期取材點(diǎn)取材檢測RBSDV濃 度變化所獲得RBSDV增殖指數(shù)趨勢圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合實(shí)施例與附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0023] -種水稻黑條矮縮病抗性的分子鑒定方法，其特征在于：該鑒定方法包括以下步 驟： 1)獲取帶毒灰飛虱和鑒定標(biāo)尺：大田采集灰飛虱高齡若蟲并純化篩選并傳代保存，鑒 定前采用RBSDV毒源飼毒1. 5-2. 5齡期灰飛虱若蟲，獲得帶毒灰飛虱；根據(jù)人工接毒鑒定中 不同品種對(duì)水稻黑條矮縮病抗性表現(xiàn)設(shè)置高抗、中抗、感病三個(gè)鑒定標(biāo)尺，選擇三個(gè)相應(yīng)水 稻品種做為鑒定標(biāo)尺，具體的操作步驟如下： 1. 1)RBSDV毒源獲?。簭乃竞跅l矮縮病重病區(qū)田間采集表現(xiàn)為水稻黑條矮縮病癥狀 的分蘗盛期水稻病株，-70°C保存； 1. 2)傳毒介體繼代繁殖：大田采集并純化灰飛虱高齡若蟲，用水稻幼苗飼養(yǎng)并傳代； 1. 3)介體飼毒：飼毒時(shí)從_70°C冰箱中取出水稻黑條矮縮病病株，常溫放置3_5h使病 株自然展開，然后用吸水棉布包裹病株根部后用塑料袋緊密包扎，確保水不會(huì)流出，然后將 其移入保鮮盒內(nèi)，將室內(nèi)人工飼養(yǎng)的1. 5-2. 5齡期灰飛虱若蟲轉(zhuǎn)入保鮮盒內(nèi)的RBSDV毒源 水稻上，25°C飼毒48h后移除毒源，將灰飛虱轉(zhuǎn)移到幼嫩水稻秧苗上飼養(yǎng)度過22-28天的循 回期即為帶毒灰飛虱； 1. 4)鑒定標(biāo)尺的選擇：根據(jù)人工接毒鑒定中不同品種對(duì)水稻黑條矮縮病抗性表現(xiàn)設(shè)置 高抗、中抗、感病三個(gè)鑒定標(biāo)尺，選擇三個(gè)相應(yīng)水稻品種做為鑒定標(biāo)尺，其中，高抗鑒定標(biāo)尺 為室內(nèi)接毒鑒定中抗病表現(xiàn)在當(dāng)?shù)厮酒贩N資源中排名為9%-11% ;中抗鑒定標(biāo)尺排名為 23%-27% ;感病鑒定標(biāo)尺排名為47%-53% ; 2) 帶毒灰飛虱定量傳毒胚芽鞘：每個(gè)品種取15-20粒種子，用0.6%次氯酸鈉溶液浸泡 15min進(jìn)行滅菌，超純水沖洗干凈，然后放置于25°C條件下濃度為1. 5-2. 5ymol/L的IAA 溶液液面下5-lOcm處浸種培養(yǎng)3天，誘導(dǎo)出胚芽鞘；然后將胚芽鞘用超純水洗凈，放入鋪有 吸水棉的試管中，每個(gè)試管一個(gè)種子，按照5-8蟲/個(gè)胚芽鞘的比例定量接種帶毒灰飛虱， 用透氣紗布封閉試管后平置，傳毒24h;傳毒后胚芽鞘用超純水沖洗，然后放置于25°C條件 下浸潤了濃度為40-60ymol/L的ABA溶液的吸水棉上暗培養(yǎng)； 3) 熒光定量PCR獲得每個(gè)品種周期時(shí)間點(diǎn)的RQ值：RBSDV傳毒后4-10天內(nèi)每隔 1.5-2. 0天選擇均勻分布的3-4個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材上一步驟的胚芽鞘長度的正中間部位，提 取和純化病毒RNA，（RNA提取方法為：取適量葉片加液氮于研缽中迅速磨碎，按比例加入 TRI-Reagent到1. 5ml離心管中，樣品體積不應(yīng)超過TRI-Reagent體積10%，4°C12000Xg 低溫離心1. 5min，然后小心轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中；RNA純化方法為：a)直接添加一體 積（95%-100%)酒精到已經(jīng)溶解于TRI-Reagent的上清液中，漩渦混勻；b)轉(zhuǎn)移到吸附柱 中過濾(吸附柱置于收集管中)，然后12000Xg離心lmin，之后把吸附柱轉(zhuǎn)移到新的收集 管中；c)加 400ylRNAWashBuffer到離心柱中，12000Xg離心lmin;d)將 8