一種玉米粗縮病種質(zhì)抗性的快速檢測(cè)鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種鑒定周期短、可靠性高的玉米粗 縮病種質(zhì)抗性的快速檢測(cè)鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米（Maize)在當(dāng)今社會(huì)中發(fā)揮的作用越來(lái)越大，它不僅僅是重要的糧食作物， 也是重要的飼料及工業(yè)原料。我國(guó)的玉米總產(chǎn)量?jī)H次于水稻產(chǎn)量，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有越來(lái) 越重要的地位。玉米粗縮病是由水稻黑條矮縮病毒（RBSDV)或玉米粗縮病病毒（MRDV)引起 的一種世界范圍的重要病害。2002年，玉米粗縮病在希臘大面積爆發(fā)，超過(guò)70%的玉米遭 受損失。玉米整個(gè)生育期都可以感病，苗期是玉米粗縮病的敏感期，發(fā)病越早，越易感病，其 中5葉期以前易感病，9葉后抗病性增強(qiáng)。玉米粗縮病的典型癥狀為植株矮小，節(jié)間明顯縮 短，葉面積顯著降低，干物質(zhì)累積顯著減少，病情嚴(yán)重時(shí)無(wú)果穗或有穗不結(jié)實(shí)，造成嚴(yán)重減 產(chǎn)。我國(guó)最早于1954年在甘肅西部和新疆南部首次發(fā)現(xiàn)該病，其后在全國(guó)大部分玉米種植 區(qū)陸續(xù)爆發(fā)，不斷造成玉米主產(chǎn)區(qū)產(chǎn)量下降或者嚴(yán)重減產(chǎn)，成為嚴(yán)重危害玉米生產(chǎn)的重要 病害。近年來(lái)，隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)不斷調(diào)整，暖春天氣逐年增多，連續(xù)出現(xiàn)適宜粗縮病 發(fā)生的氣候條件，造成玉米粗縮病在黃淮海區(qū)域的危害情況逐年加重，各地爆發(fā)情況屢見(jiàn) 報(bào)道，給我國(guó)玉米生產(chǎn)和全國(guó)的糧食安全帶來(lái)非常嚴(yán)重的破壞。因此防治該病成為目前玉 米生產(chǎn)的主要任務(wù)之一。
[0003] 目前所知的能引起玉米粗縮病的病原有三種，分別為水稻黑條矮縮病毒（Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)、馬德里約柯托病毒（Mai de Rio Cuarto virus， MRCV)和玉米粗縮病毒（Maize rough dwarf virus，MRDV)，這三種病毒都屬于呼腸孤病毒 科（Reoviridae)斐濟(jì)病毒屬（Fjivirus)。其中MRDV和MRCV分別能夠引起歐洲和南美洲 玉米粗縮病。引起我國(guó)玉米粗縮病的宄竟是何種病原曾經(jīng)引起過(guò)爭(zhēng)論。我國(guó)玉米粗縮病的 病原物分離及測(cè)序比對(duì)研宄確認(rèn)引起我國(guó)玉米粗縮病的病原物為RBSDV，而非MRDV。
[0004] 玉米粗縮病病毒RBSDV -般不能通過(guò)種子、土壤和接觸傳染，也不能經(jīng)嫁接、汁液 摩擦等傳播，只能由灰飛虱刺吸并以持久性方式間歇傳播。灰飛虱屬溫帶害蟲(chóng)，廣泛分布于 東亞、東南亞、歐洲等地，在國(guó)內(nèi)分布則遍及全國(guó)各地?；绎w虱能夠傳播多種病害，如水稻條 紋葉枯病、水稻黑條矮縮病、玉米矮花葉病，小麥綠矮病等，危害嚴(yán)重。帶毒灰飛虱成蟲(chóng)或若 蟲(chóng)在冬小麥、田頭地邊雜草等場(chǎng)所越冬，第二年3、4月份若蟲(chóng)羽化后成為第一批帶毒灰飛 虱，隨著天氣轉(zhuǎn)暖，于4、5月份開(kāi)始迀飛，5月中旬至6月初平均氣溫20~25°C，適于灰飛 虱活動(dòng)，田間灰飛虱種群數(shù)量達(dá)高峰，并在小麥?zhǔn)斋@前形成迀飛高峰，春、夏播玉米田若在 此時(shí)遭遇大量帶毒灰飛虱則形成大規(guī)模病害，造成嚴(yán)重?fù)p失。
[0005] 玉米粗縮病由于其危害嚴(yán)重，可防不可治，且當(dāng)前生產(chǎn)上推廣的玉米品種大部分 不抗病，因而急需培育和改良出玉米粗縮病抗性品種，才能從根本上減少該病帶來(lái)的損失。 大規(guī)模篩選玉米種質(zhì)資源是培育抗性品種的基礎(chǔ)，對(duì)候選種質(zhì)資源進(jìn)行抗性鑒定則是重要 且必須的措施。
[0006] 目前對(duì)玉米粗縮病進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定主要有田間自然鑒定法和室內(nèi)人工接種鑒 定法兩種。自然鑒定法是長(zhǎng)久以來(lái)長(zhǎng)久應(yīng)用的方法，但因其受到自然條件的制約，不同年 份、不同地點(diǎn)的鑒定結(jié)果差異較大，且自然鑒定法無(wú)法有效控制諸如灰飛虱帶毒率、接蟲(chóng) 量、接種時(shí)間等的一致性，因而使得鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確。如王桂躍等人通過(guò)自然鑒定結(jié)果認(rèn)為 丹340表現(xiàn)出較強(qiáng)的粗縮病抗病性，而路銀貴等人的自然鑒定研宄結(jié)果認(rèn)為丹340屬于高 感自交系。人工接種鑒定法是在借鑒自然鑒定法基礎(chǔ)上建立起來(lái)的接種鑒定方法。對(duì)于玉 米粗縮病而言，包括室內(nèi)灰飛虱飼養(yǎng)和人工接種鑒定兩個(gè)方面。室內(nèi)人工飼養(yǎng)灰飛虱和人 工接種玉米粗縮病病毒的方法能夠保證鑒定使用的灰飛虱帶毒率和接蟲(chóng)數(shù)量的穩(wěn)定性，能 夠保證鑒定結(jié)果重復(fù)性好、可信度高。目前室內(nèi)鑒定均采用苗期接蟲(chóng)，待植株抽雄后通過(guò)觀 察感病癥狀來(lái)確定其抗病性。
[0007] 科學(xué)技術(shù)發(fā)展日新月異，目前用于檢驗(yàn)鑒定植物病毒的方法包括以下幾種：生物 學(xué)方法、血清學(xué)方法、電子顯微鏡法、芯片檢測(cè)法和分子生物學(xué)方法。
[0008] 生物學(xué)方法是通過(guò)病毒在病毒特定寄主上接種病毒后，依據(jù)寄主上表現(xiàn)出來(lái)的局 部或系統(tǒng)癥狀，可以初步確定病毒的種類和歸屬。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于其操作簡(jiǎn)單易行，缺點(diǎn) 是工作量大，耗時(shí)長(zhǎng)，而且受季節(jié)性限制，準(zhǔn)確性不高。目前只有部分實(shí)驗(yàn)室仍在采用此種 方法，應(yīng)用不廣泛。
[0009] 血清學(xué)方法是利用抗體和其對(duì)應(yīng)抗原的體外特異性結(jié)合檢測(cè)植物病毒。免疫學(xué)方 法能夠較大量的檢測(cè)鑒定植物病毒。然而對(duì)于一些分離純化比較困難的病毒，應(yīng)用此方法 檢測(cè)則有一定難度。除了抗體制備的難度大以外，免疫學(xué)方法還受到以下幾個(gè)因素的制約： (1) 免疫學(xué)檢驗(yàn)植物病毒的方法是建立在利用病毒外殼蛋白的抗原性，然而有些植物在某 種情況下不含有外殼蛋白，而且類病毒并沒(méi)有外殼蛋白，這使得該方法的應(yīng)用受到了限制。 (2) 某些植物的生殖生長(zhǎng)周期制約著該方法的應(yīng)用。例如，藜屬的葉、花、果實(shí)中可以檢測(cè)出 CMLV病毒，而在樹(shù)木休眠后的木本部分卻難以用ELISA方法檢測(cè)。
[0010] 電子顯微鏡鑒定法較形態(tài)學(xué)鑒定方法可以準(zhǔn)確直觀地觀察到植物病毒粒體的形 態(tài)、大小、表面微細(xì)結(jié)構(gòu)和存在部位等信息，結(jié)合免疫學(xué)檢測(cè)的電鏡檢測(cè)法則可以更進(jìn)一步 的研宄病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和裝配、判斷血清學(xué)關(guān)系等。
[0011] 芯片技術(shù)是近年國(guó)際上發(fā)展迅速的一項(xiàng)高新技術(shù)，可以分為基因芯片和蛋白質(zhì)芯 片技術(shù)，是植物病毒快速檢測(cè)技術(shù)的重要發(fā)展方向?；蛐酒夹g(shù)是將熒光標(biāo)記技術(shù)與DNA 雜交技術(shù)相結(jié)合的一種基因水平檢測(cè)法，以其靈敏度高和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，在細(xì)菌、病毒等 病原鑒定和檢測(cè)方面發(fā)揮著重要作用。其基本原理是將各種不同病毒樣品的特征基因片段 點(diǎn)樣，制成基因芯片，再使熒光標(biāo)記的待檢樣品核酸與芯片雜交，雜交信號(hào)通過(guò)激光共聚焦 顯微掃描技術(shù)進(jìn)行靈敏、實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確的檢測(cè)，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件分析并進(jìn)行結(jié)果判斷。蛋白質(zhì)芯 片又稱蛋白質(zhì)微陣列，是繼基因芯片之后又發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)具有高靈敏度、高特異性、高質(zhì) 量且微型化的分析蛋白質(zhì)的新技術(shù)。目前，熒光染料標(biāo)記法是蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)中應(yīng)用最廣 的一種方法，其原理簡(jiǎn)單，優(yōu)點(diǎn)是敏感性高、適用安全，并具有良好的分辨率。在蛋白質(zhì)芯片 的基礎(chǔ)上，發(fā)展出了基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間等質(zhì)譜技術(shù)，其基本原理是用生物學(xué) 或化學(xué)的方法將生物制劑或者探針固定在載體上，形成了一個(gè)個(gè)芯馳矩陣。該方法使用范 圍較為廣泛，是一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的快速檢測(cè)生物分子的技術(shù)，在植物病毒的檢測(cè)和 鑒定上有著較好的應(yīng)用前景。
[0012] 分子生物學(xué)方法主要是通過(guò)提取病毒的核酸（DNA、RNA)來(lái)檢測(cè)病毒的種類和存 在。目前主要應(yīng)用的定性檢測(cè)分子生物學(xué)方法包括病毒核酸分子雜交技術(shù)、dsRNA電泳技術(shù) 和多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)技術(shù)，定量檢測(cè)主要是指實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。此種方法靈敏 度高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)速度快，操作過(guò)程也比較簡(jiǎn)便、可用于大量樣品檢測(cè)。由于分子生物學(xué) 鑒定方法有無(wú)可替代的優(yōu)點(diǎn)，從而使此方法在植物病毒鑒定中得到迅速而廣泛的應(yīng)用。熒 光定量PCR在植物病毒檢測(cè)與鑒定方面，能夠定量檢測(cè)病毒拷貝數(shù)。應(yīng)用熒光定量PCR檢 測(cè)未知樣本時(shí)，對(duì)模板定量檢測(cè)可以采用兩種方法：相對(duì)定量法和絕對(duì)定量法。相對(duì)定量檢 測(cè)方法用來(lái)比較一個(gè)目標(biāo)基因在不同處理下的不同表達(dá)水平，指的是在目標(biāo)基因之間做比 較，這些基因具有不同的表達(dá)水平，分別來(lái)自經(jīng)過(guò)各自處理的樣品中。它們分別與非調(diào)控的 參考基因相比。然后根據(jù)AACt方法計(jì)算出其表達(dá)水平。
[0013] 絕對(duì)定量檢測(cè)方法是應(yīng)用符合要求的標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)檢測(cè)未知樣品的 Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的核酸拷貝數(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法相比其他定量方 法和普通PCR方法特異性更強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、靈敏度高、線性關(guān)系廣（熒光信號(hào)的產(chǎn)生與產(chǎn)物 擴(kuò)增呈一一對(duì)應(yīng)關(guān)系)、操作簡(jiǎn)單安全，樣品的污染較底(樣品的擴(kuò)增和檢測(cè)在同一管內(nèi)進(jìn) 行)，且不需要后期處理。由于熒光定量PCR法對(duì)檢測(cè)未知樣品含量的優(yōu)越性，已經(jīng)在諸多 領(lǐng)域如植物病理機(jī)制研宄，轉(zhuǎn)基因研宄中的目標(biāo)基因表達(dá)水平和醫(yī)學(xué)臨床檢測(cè)方面得到了 廣泛和成熟的應(yīng)用。
[0014] 研宄證明對(duì)玉米植株接種RBSDV，不管是抗病還是感病玉米植株體內(nèi)，均檢測(cè)到 RBSDV病毒，以上各種方法只能檢測(cè)病毒的有無(wú)，無(wú)法對(duì)其繁殖動(dòng)態(tài)進(jìn)行定量觀察。另外 玉米植株苗期感染RBSDV病毒之后，癥狀不凸顯，不能確定其抗病性，需要等到植株抽雄才 能確定其抗病性。因此本申請(qǐng)利用熒光定量RT-PCR技術(shù)對(duì)接種病毒后的玉米幼苗體內(nèi)的 RBSDV積累情況進(jìn)行定量檢測(cè)，通過(guò)觀察其繁殖動(dòng)態(tài)曲線，從而快速確定玉米的抗感性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有玉米粗縮病室內(nèi)鑒定周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，提供一種鑒定周期 短、可靠性高的玉米粗縮病種質(zhì)抗性的快速檢測(cè)鑒定方法。
[0016] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案解決的： 一種玉米粗縮病種質(zhì)抗性的快速檢測(cè)鑒定方法，其特征在于：該快速檢測(cè)鑒定方法包 括以下步驟： 1) 熒光定量PCR反應(yīng)獲取RBSDV病毒含量標(biāo)準(zhǔn)曲線：利用RBSDV病毒S7片段的重組 質(zhì)粒DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)10倍稀釋后對(duì)獲得的梯度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，以各 梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品的模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)值、以各梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的Ct值為 縱坐標(biāo)值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線； 2) 玉米樣品RNA獲?。涸谟衩酌缙谥芷跁r(shí)間點(diǎn)采集