人參特異性rapd標(biāo)記的dna片段、鑒別人參的scar標(biāo)記特異性引物對及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及中藥及中藥材鑒定領(lǐng)域，具體涉及到一種 利用SCAR技術(shù)鑒定人參的特異性引物對及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人參為五加科Araliaceae人參屬Panax植物人參Panax ginseng C. A. Mey?的 干燥根和根莖，多于秋季采挖，洗凈經(jīng)曬干或烘干。栽培的俗稱"園參"；播種在山林野生 狀態(tài)下自然生長的稱"林下山參"，習(xí)稱"籽海"。主產(chǎn)于我國東北三省和朝鮮，被譽為"百 藥之王"；具有大補元氣、強心固脫、補脾益肺、安神生津的功效；用于體虛欲脫、肢冷脈微、 脾虛食少、肺虛喘咳、津傷口渴等證；五加科人參屬主要藥用植物為：人參Panax ginseng C. A. Mey.、西洋參Panax quinquefolium L.和三七Panax notoginseng(Burkill)F. H. Chen ex C.Chow&W.G. Huang;西洋參主產(chǎn)于美國威斯康辛州和加拿大安大略?。晃覈袌錾系奈?洋參主要有兩種：一種是進口，一種是引進種植。三七主產(chǎn)于云南、廣西。三者都是我國常 用的珍貴藥材，但其價格差異大；所以，市場上經(jīng)常出現(xiàn)用其它根類藥材，如商陸根、櫨蘭 根等充作人參。偽品不僅不具有藥理作用，甚至可能產(chǎn)生毒副作用。
[0003] 傳統(tǒng)的分析鑒別方法，是根據(jù)形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)特征和化學(xué)成分鑒別，而這些傳統(tǒng) 的鑒別方法干擾因素較多，易受環(huán)境和植物本身的影響和限制；隨著科學(xué)的不斷前步，應(yīng)用 DNA分子標(biāo)記技術(shù)鑒定中藥材及其飲片，取得了快速地發(fā)展，在中藥材真?zhèn)舞b別中發(fā)揮了重 要的輔助鑒定作用。
[0004]RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)標(biāo)記技術(shù)是建立在PCR基礎(chǔ)之上，對 整個未知基因組序列進行多態(tài)性分析，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于品種鑒定、遺傳分析等研宄，尤其適 合于尋找不同樣品間的DNA差異。Shaw等首先采用RAH)方法區(qū)分人參屬3種藥材人參、 西洋參、三七。RAH)為10堿基的隨機序列，通過PCR反應(yīng)擴增基因組DNA，由于不同基因組 DNA序列堿基位點具有明顯的差異，在不同區(qū)段上與引物發(fā)生結(jié)合的位點也不相同，因而擴 增條帶的數(shù)量、強弱等特征均不同，產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，獲得較多的條帶信息，從而使 不同的種表現(xiàn)出多態(tài)性；RAPD的優(yōu)點是所需DNA量極少，操作簡單，設(shè)備要求低，但是由于 RAH)引物只有10bp，退火溫度較低，重復(fù)性相對較差。為了避免這一不足，將其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定 的SCAR(sequencecharacterizedamplifiedregions)標(biāo)記。將RAPD轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記 技術(shù)是1993年P(guān)aran和Michelmore提出并應(yīng)用的，已廣泛應(yīng)用于植物、生物等領(lǐng)域；SCAR 標(biāo)記是在RAPD的基礎(chǔ)上，對其特異片段進行回收、克隆和測序，根據(jù)測序序列設(shè)計特異性 引物，并以此引物對基因組DNA進行PCR擴增。具有操作簡單、穩(wěn)定、成本低等優(yōu)點。張銘 采用RAPD技術(shù)獲得了鐵皮石斛基因組DNA的特異性SCAR標(biāo)記，構(gòu)建的特異性SCAR標(biāo)記引 物擴增出特異性SCAR片段，可以用于鑒別鐵皮石斛。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種人參特異性RAPD標(biāo)記的DNA片段、鑒 別人參的SCAR標(biāo)記特異性引物對及方法。
[0006] 為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0007] 所述人參特異性RAH)標(biāo)記的DNA片段序列如SEQIDNO. 1所示。該DNA片段可 用于制備鑒別人參的試劑。
[0008] 所述鑒別人參的SCAR標(biāo)記特異性引物對包括引物1和引物2,引物1和 引物2是根據(jù)權(quán)利要求1所述DNA片段設(shè)計的引物。優(yōu)選地，所述引物1的序列為 5' -CCCGACTCAAAATCGAAGT-3'（SEQIDN0. 2)，所述引物 2 的序列為 5'-AAGCAAGAAGCAAGGG TAACATA-3'（SEQIDN0. 3)。
[0009] 所述鑒別人參的方法是用上述引物對對待測樣品的DNA進行PCR擴增，若待測樣 品獲得2條特異性SCAR標(biāo)記片段，則表明該待測樣品為人參，所述2條特異性SCAR標(biāo)記片 段中一條長度為280~320bp，優(yōu)選300bp，另一條長度為100~150bp，優(yōu)選130bp。所述PCR 擴增反應(yīng)參數(shù)如下：PCR擴增反應(yīng)體系總體積為25yL，PCR擴增反應(yīng)體系包括：5XPrimer STARBuffer(Mg2+plus) 5yL，dNTPsmixture(2. 5mM) 2.5yL，引物 1(10yM) 0.75yL，弓| 物 2(10yM)0? 75yL，PrimeSTARHSDNAPolymerase(Takara，2. 5U/yL)0?25yL，DNA模 板1UL，無菌雙蒸水補充至25yL;PCR擴增反應(yīng)程序為：95°C預(yù)變性3min，98°C變性10s， 52°C退火15s，72°C延伸lmin，30個循環(huán)后，72°C延伸7min，4°C保存。
[0010] 本發(fā)明構(gòu)建了特異性SCAR標(biāo)記的特異性引物1和2,由于人參、西洋參及三七基因 組高度相似，要尋找其差異DNA片段是一個難點，因此本發(fā)明通過RAH)這個方法，獲得了人 參有別于其它藥材的差異性DNA序列，該序列是通過RAPD技術(shù)篩選獲得的、僅在人參中能 獲的特異性DNA片段，此前并未公開報道。本發(fā)明通過設(shè)計特異性引物通過PCR技術(shù)獲得 了特異性標(biāo)記的片段，結(jié)果可以將人參和其他藥材區(qū)分。由于基因組的復(fù)雜性，該引物對在 人參模板DNA的PCR反應(yīng)體系中還比預(yù)期多獲得了一條擴增片段，本發(fā)明以特異帶型作為 檢出人參的判斷標(biāo)準(zhǔn)。也有人RAH)方法對人參進行多樣性分析，但是只做到了RAH)篩選 這個環(huán)節(jié)，卻都沒有設(shè)計出用于人參鑒別的特異性引物。本發(fā)明申請人經(jīng)過多次的引物設(shè) 計、驗證才獲得這一對可以成功鑒別的引物。下面略舉數(shù)例失敗的引物對：
[0011] 5-CCCGACTCAAAATCGAAG-3(SEQIDNO. 4)
[0012] 5-TGTCATCCCCTTTGTGTTAA-3(SEQIDNO. 5)
[0013] 溫度梯度55°0、57°0、59°0，人參、西洋參、三七各2個樣本，無特異條帶。
[0014] 5-CCCGACTCAAAATCGAAGT-3(SEQIDNO. 6)
[0015] 5-AAGCAAGAAGCAAGGGTAACATA-3(SEQIDNO. 7)
[0016] 溫度梯度55°0、57°0、59°0，人參、西洋參、三七各2個樣本，無特異條帶。
[0017] 5-CCCCCGACTCAAAATCGAAGTAA-3(SEQIDNO. 8)
[0018] 5-GAAGCAAGAAGCAAGGGTAACA-3(SEQIDNO. 9)
[0019] 溫度梯度50°〇、52°〇、54°〇，人參、西洋參、三七各2個樣本，無特異條帶。
[0020] 5-TGTCATCCCCCGACTCAAAAT-3(SEQIDNO. 10)
[0021] 5-TGTGTTAAATTTTGTATTCGT-3(SEQIDNO. 11)
[0022] 溫度梯度55°0、57°0、59°0，人參、西洋參、三七各2個樣本，無特異條帶。
[0023] 而利用本發(fā)明所述的特異性引物，在PCR擴增條件下，所有的人參樣本都獲得 300bp和130bp的2條特異性SCAR標(biāo)記片段，而在西洋參、三七、景天三七、櫨蘭、珠子參、水 田七、姜黃、竹節(jié)參、商陸以及所研宄的58種其他中藥材中則無該特異性帶型，均為陰性擴 增。需要說明的是，特異性引物SEQ-2和SEQ-3在人參均可獲得特異性擴增，但若人參經(jīng)糖 炮制后（為習(xí)稱的紅參或白參），只能在部分樣本有效擴增。所有樣本總計150批，其中： 人參藥材50批（說明R1~R31是人參，R32~R50是經(jīng)糖炮制過的人參，為習(xí)稱的紅參或 白參）；西洋參14批；三