瓜炭疽病菌的熒光pcr檢測(cè)方法及所用引物和探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及瓜炭疽病菌的熒光PCR檢測(cè)方法及所用引物和探針。
【背景技術(shù)】
[0002] 瓜類炭疽病是瓜類作物生產(chǎn)中的重要病害之一，全國(guó)各地均有分布。發(fā)病時(shí)常造 成幼苗猝倒，成株莖、葉枯死，瓜果腐爛，危害嚴(yán)重。西瓜和甜瓜易感病，黃瓜、冬瓜、瓠瓜、苦 瓜次之，南瓜、西萌蘆，絲瓜較抗病。
[0003] 瓜炭疽病菌長(zhǎng)距離傳播主要依靠感病的植株、病殘?bào)w以及受侵染的種子等植物性 材料。目前國(guó)內(nèi)未見報(bào)道有關(guān)檢測(cè)該病菌的熒光PCR特異性引物和探針。目前瓜炭疽病菌 的檢驗(yàn)方法主要是常規(guī)種子帶菌檢驗(yàn)。這種方法經(jīng)驗(yàn)性較強(qiáng)，瓜炭疽病菌和其他近似病原 菌在形態(tài)上較難區(qū)分。因此建立對(duì)瓜炭疽病菌快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法至關(guān)重要。
[0004] 本發(fā)明所設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)具體如下：
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種瓜炭疽病菌的熒光PCR檢測(cè)方法及所用引 物和探針；該方法具有特異性、穩(wěn)定性和靈敏性都非常好的特點(diǎn)。
[0020] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種瓜炭疽病菌的熒光PCR檢測(cè)方法及所用 引物和探針；從GenBank查詢所有瓜炭疽病菌的GAPDH基因和GS基因相關(guān)序列，設(shè)計(jì)瓜炭 疽病的特異性引物和TaqMan探針。
[0021] 具體為如下兩種：
[0022] 一、針對(duì)GAPDH基因：
[0023]引物：
[0024] GAPDH-3 :5' -CCCTTCATTGAGACCAAGT-3'
[0025] GAPDH-4 :5' -GTACTTGAGCATGTAGGCCT-3' ；
[0026] TaqMan探針：
[0027] GAPDH-p :5' FAM-CCGGGATCTCTGGCATTACG-3' TAMRA ;
[0028] 產(chǎn)物大小234bp;
[0029] 二、針對(duì)GS基因：
[0030]引物：
[0031] GS-3 :5' -TTCGTTCTCGAACACGAT-3'
[0032] GS-4 :5, -GAGACATGACGACCTTGTTC-3,；
[0033] TaqMan探針：
[0034] GS-p :5' FAM-TGCACGTCTGGTCCAGTTCTGT-3' TAMRA。
[0035] 產(chǎn)物大小209bp。
[0036] 本發(fā)明還同時(shí)提供了利用上述特異性引物和TaqMan探針進(jìn)行的瓜炭疽病菌的熒 光PCR檢測(cè)方法：包括以下步驟：
[0037] 1)、提取待測(cè)植物材料（包括種子等）的DNA ;
[0038] 2)、PCR :
[0039] 一、GAPDH基因：
[0040] 25 y L反應(yīng)體系：10XBuffer 2. 5 y L，25mmol/L Mg2+3. 5 y 1，2. 5mmol/L dNTP 0? 5yL，5U/yL TaqMan聚合酶0? 2yL，上下游引物（lOymol/L)各0? 5yL，TaqMan探針 (10 y mol/L) 0? 5 y L，模板DNA:0? 5-2 y L，最終用三蒸水補(bǔ)足至25 y L ;
[0041]反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C 3min ;(95°C 15s，57. 9°C lmin，40個(gè)循環(huán)）；反應(yīng)中止；
[0042]二、GS基因：
[0043] 25 y L反應(yīng)體系：10XBuffer 2. 5 y L，25mmol/L Mg2+3 y 1，2. 5mmol/L dNTP 0? 5yL，5U/yL TaqMan聚合酶0? 2yL，上下游引物（lOymol/L)各0? 5yL，TaqMan探針 (10 y mol/L) 0? 5 y L，模板DNA:0? 5-2 y L，最終用三蒸水補(bǔ)足至25 y L ;
[0044]反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C 3min ; (95°C 15s，56°C lmin，40個(gè)循環(huán)）；反應(yīng)中止；
[0045] 備注說明：Mg2+具體為MgCl 2;
[0046]3)、當(dāng)步驟2)的2種PCR均能檢測(cè)到熒光（Ct值小于40)時(shí)，判定為陽(yáng)性，否則判 定為陰性。
[0047] 備注說明：
[0048] 本發(fā)明使用的熒光PCR儀中溫度梯度所用PCR為Eppendorf熒光PCR儀。確定退 火溫度后所用的熒光PCR儀為ABI公司7300。
[0049]rDNA-ITS是介于18SrDNA、5. 8SrDNA、28SrRNA之間的區(qū)域，該區(qū)域進(jìn)化速度較編 碼區(qū)快，被普遍用來進(jìn)行真菌種間或種內(nèi)的遺傳相似性的分子系統(tǒng)研宄。但是在瓜炭疽病 菌的序列比對(duì)中該區(qū)段很難找到突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針，本發(fā)明選擇瓜炭疽病菌甘油醛-3-磷 酸脫氫酶（GAPDH)基因和glutaminesynthase(GS)基因序列設(shè)計(jì)引物探針，通過對(duì)瓜上其 他病害和瓜炭疽病菌的檢測(cè)研宄，結(jié)果表明該方法具有良好的特異性、穩(wěn)定性和靈敏性。
【附圖說明】
[0050] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0051] 圖1為GAPDH引物和探針不同退火溫度Tm值對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系的影響 (Figl、TheinfluenceofdifferenttemperaturemeltontheReal-TimePCRsystem usingGAPDHprimersandprobe)；
[0052] 1 ：55. 2°C；2 ：55. 4°C；3 ：56°C；4 ：56. 8°C；5 ：57. 9°C；6 ：59. 1°C；7 ：60. 4°C；8 ： 61. 4°C;9 :62. 6°C;10 :63. 5°C;11 :64°C;12 :64. 1°C;13 :空白對(duì)照。
[0053] 圖2為GS引物和探針不同退火溫度Tm值對(duì)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系的影響 (Fig2、TheinfluenceofdifferenttemperaturemeltontheReal-TimePCRsystem usingGSprimersandprobe)；
[0054] 1 ：55. 2°C；2 ：55. 4°C；3 ：56°C；4 ：56. 8°C；5 ：57. 9°C；6 ：59. 1°C；7 ：60. 4°C；8 ： 61. 4°C;9 :62. 6°C;10 :63. 5°C;11 :64°C;12 :64. 1°C;13 :空白對(duì)照。
[0055] 圖3為GAPDH引物和探針不同Mg2+濃度對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系的影響（Fig3、 TheinfluenceofdifferentMg2+concentrationontheReal-TimePCRsystemusing GAPDHprimersandprobe)；
[0056] 1 :0y1 ;2 :0? 5y1 ;3 :1y1 ;4 :1. 5y1 ;5 :2y1 ;6 :2. 5y1 ;7 :3y1 ;8 :3. 5y1。
[0057] 圖4為GS引物和探針不同Mg2+濃度對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系的影響（Fig4、The influenceofdifferentMg2+concentrationontheReal-TimePCRsystemusingGS primersandprobe)；
[0058] 1 :0y1 ;2 :0? 5y1 ;3 :1y1 ;4 :1. 5y1 ;5 :2y1 ;6 :2. 5y1 ;7 :3y1 ;8 :3. 5y1。
[0059] 圖5為不同DNA濃度對(duì)GAPDH引物和探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系的影響（Fig5、 TheinfluenceofdifferentDNAconcentrationontheReal-TimePCRsystemusing GAPDHprimersandprobe)；
[0060] 1 :39. 6ng(原液）；2:3. 96叫（10-1) ;3 :396pg(l(T2);4:39. 6pg(l(T3);5 : 3. 96pg(l(T4) ;6 :396fg(l(T5) ;7 :39. 6fg(l(T6) ;8 :3. 96fg(l(T7) ;9 :0。
[0061] 圖6為不同DNA濃度對(duì)GS引物和探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系的影響（Fig6、The influenceofdifferentDNAconcentrationontheReal-TimePCRsystemusingGS primersandprobe)；
[0062] 1 :39. 6ng(原液）；2 :3. 96叫（10-1) ;3 :396pg(l(T2) ;4 :39. 6pg(l(T3) ;5 : 3. 96pg(l(T4) ;6 :396fg(l(T5) ;7 :39. 6fg(l(T6) ;8 :3. 96fg(l(T7) ;9 :0。
[0063] 圖7為GAPDH引物和探針實(shí)時(shí)熒光PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果（Fig7:Agarosegel electrophoresisofRealtimePCR-amplifiedproductsusingGAPDHprimersand probe)；
[0064] 1 :DL2000Marker;2 :39. 6ng(原液）；3 :3. 96ng(10-〇 ;4 :396pg(10-2) ;5 : 39.6pg(10-3) ;6:3.96pg(10-4) ;7:396fg(10-5) ;8:39.6fg(10-6) ;9:3.96fg(10-7) ;10:0。
[0065] 圖8為GS引物和探針實(shí)時(shí)熒光PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果（Fig8Agarosegel electrophoresisofRealtimePCR-amplifiedproductsusingGSprimersand probe)；
[0066] 1 :DL2000Marker;2 :39. 6ng(原液）；3 :3. 96ng(10-〇 ;4 :396pg(10-2) ;5 : 39.6pg(10-3) ;6:3.96pg(10-4) ;7:396fg(10-5) ;8:39.6fg(10-6) ;9:3.96fg(10-7) ;10:0。
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