一種特異性診斷卵巢癌的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種特異性診斷卵巢癌的試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 卵巢癌是一種出現(xiàn)在卵巢中的惡性腫瘤，五十歲到七十歲的婦女中發(fā)病率最高。 根據(jù)韓國(guó)2002年的統(tǒng)計(jì)，每年有大約1000-1200名的婦女診斷出罹患卵巢癌，是在韓國(guó)婦科 癌癥發(fā)生中排在子宮頸癌后的第二位。
[0003] 由于其幾乎沒有明顯癥狀，大約60%的卵巢癌病例最初在顯著發(fā)展的階段診斷出 來。因此，推薦婦女在一年的定期時(shí)間進(jìn)行婦科癌癥的體檢。通常，卵巢癌的診斷由婦科醫(yī) 生對(duì)卵巢進(jìn)行是否已增大的體檢開始。必要時(shí)，可用婦科超聲顯像檢查卵巢腫塊。此外，對(duì) 于CA125腫瘤標(biāo)記物可進(jìn)行驗(yàn)血以確定卵巢腫塊是簡(jiǎn)單的囊腫還是惡性腫瘤。
[0004] 由于超聲波掃描術(shù)或驗(yàn)血都不是完美的，這兩種檢查的組合是迄今為止發(fā)現(xiàn)卵巢 癌的最有前途的方法。醫(yī)生在完全考慮了所有的數(shù)據(jù)，包括患者年齡、現(xiàn)在和過去的個(gè)人和 家族病史、超聲顯像和驗(yàn)血結(jié)果以及必要時(shí)觀測(cè)預(yù)定一段時(shí)間后作出決定。當(dāng)懷疑腫塊為 癌癥時(shí)，可在執(zhí)行計(jì)算機(jī)輔助斷層成像(CT)或核磁共振成像(MRI)后進(jìn)行外科手術(shù)。在活組 織檢查后證實(shí)癌癥。
[0005] 硫氧還蛋白（Trx)是一種捐獻(xiàn)氫離子給核糖核苷酸還原酶的輔酶，一種對(duì)于大腸 桿菌中DNA合成必不可少的酶。Trx用作細(xì)胞內(nèi)氧化還原作用控制劑，其特征在于具有-Cys-Gly-Pro-Cys-活性部位，其中兩個(gè)鄰近的半胱氨酸殘基可交換地存在于二硫鍵（S-S) 的氧化形式與二硫醇(-SH-SH)的還原形式之間。Trx是一種12kDa的蛋白質(zhì)并包含有硫氧 還蛋白1 (Trxl)和硫氧還蛋白2 (TrxShTrx具有多種生物學(xué)活性。例如，Trx用作生長(zhǎng)因子 并清除對(duì)細(xì)胞有毒的過氧化氫。此外，Trx對(duì)真核細(xì)胞中廣泛使用的轉(zhuǎn)錄因子NF-kB(核轉(zhuǎn) 錄因子kB)的活性具有影響。在這方面，Trx通過裂解氧化蛋白質(zhì)的二硫鍵將它們轉(zhuǎn)變成其 還原狀態(tài)來參與細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)。由于這些生物學(xué)活性，Trx作為用于預(yù)防細(xì)胞 損傷的抗氧化治療劑以及抗癌劑吸引了廣泛的關(guān)注。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)已知，患有癌癥的疾病的患者具有比正常人低的血漿硫氧還蛋白1水平， 因此，硫氧還蛋白1可以作為活性成分的用于診斷卵巢癌。其診斷比傳統(tǒng)的CA125更加有效。 因此，檢測(cè)硫氧還蛋白1的表達(dá)水平變得尤為重要。
[0007] 核酸適體(Aptamer,又稱適配體，適配子)是能高親和性、高特異性的結(jié)合某種生 物質(zhì)的單鏈寡核酸分子（ssDNA或ssRNA)。核酸適體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù) (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX)從人工合成 的DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠高度特異性結(jié)合靶標(biāo)分子的單鏈DNA/RNA。已報(bào)道核酸適 體的靶標(biāo)包括金屬離子、有機(jī)小分子、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞甚至組織等。核酸適體的分子識(shí)別 功能與抗體類似，具有與抗體分子相當(dāng)甚至更強(qiáng)的靶標(biāo)識(shí)別能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種特異結(jié)合TRX-1的核酸適體及其試劑盒。
[0009] 本發(fā)明提供的核酸適體，是序列表的序列1-16所示的單鏈DNA。
[0010]所述核酸適體與TRX-1蛋白具有較好的親和能力。
[0011] 還可將所述核酸適體進(jìn)行修飾或改造，得到所述核酸適體的衍生物。
[0012] 所述核酸適體的衍生物可為如下任意一種： a) 將所述核酸適體刪除部分或增加部分互補(bǔ)的核苷酸，得到的與所述核酸適體具有相 同功能的核酸適體的衍生物； b) 將所述核酸適體進(jìn)行核苷酸取代或部分修飾，得到的與所述核酸適體具有相同功能 的核酸適體的衍生物； c) 將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有相同功 能的核酸適體的衍生物； d) 將核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生 物； e) 將所述核酸適體連接上熒光、放射性和治療性物質(zhì)后，得到的與所述核酸適體具有 相同功能的核酸適體的衍生物。
[0013] 所述核酸適體可用于制備檢測(cè)TRX-1的試劑盒。
[0014] 利用本發(fā)明的核酸適體，可以捕獲中唾液中的中的TRX-1，從而用于相關(guān)卵巢癌篩 查。利用本發(fā)明的核酸適體，具有高靈敏、成本低、易制備、易保存的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明具有很高 的應(yīng)用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0016]實(shí)施例1 TRX-1蛋白的獲得 根據(jù)"唐文心，硫氧還蛋白-1的生物學(xué)功能研究，《華中科技大學(xué)》2009年"中的方法， 表達(dá)出TRX-1蛋白，并且純化。
[0017] 實(shí)施例2核酸適體的篩選和制備 設(shè)計(jì)兩端包含大約20個(gè)核苷酸、中間包括個(gè)核苷酸的隨機(jī)核酸文庫如下： '-TGCATTGAACCTGACATGTA(N39)TTGACATGCCATTGATGCAGC-3' ；N39代表 39 個(gè)隨機(jī)核苷 酸。
[0018] 將單鏈DNA文庫擴(kuò)增為雙鏈DNA，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以回 收的雙鏈DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA隨機(jī)文庫，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PAGE純化。75 yg RNA文庫 經(jīng)硝酸纖維素膜反篩去除與膜結(jié)合的RNA分子，然后與2ug TRX-1蛋白，37°C孵育30min，反 應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜;然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液(6mol/L尿素，0. 55mol/L醋酸銨，1.5mmol/L EDTA，0. 15% SDS)中煮沸5min，離心，取上清，無水乙醇沉淀 RNA，并重新溶解于20 μL DEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴(kuò)增雙鏈DNA，體外轉(zhuǎn)錄出RNA文 庫用于下一輪篩選;每輪篩選過程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫，以該雙鏈DNA為模板體外轉(zhuǎn) 錄出RNA適配子庫，篩選共進(jìn)行10輪。得到了 16個(gè)適配子，其序列分別為SEQ ID Ν0:1-16所 示。具體序列如下所示：
實(shí)施例3蛋白結(jié)合適配子的性能測(cè)定 將適配子分別取2.0μ g，用牛小腸堿性磷酸酶(CIP) 37°C消化lh，純化回收去磷酸化 的RNA ;通過T4多核苷酸激酶標(biāo)記[γ -32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。lOnmol放射 性標(biāo)記的適配子分別與不同濃度（1-200ηΜ)的TRX-1 37°C孵育30min，各組反應(yīng)液經(jīng)硝酸 纖維素膜濾過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定濾膜上殘留的放射量，同一樣品平行 做兩次測(cè)定。計(jì)算各個(gè)適配子與目的蛋白的解離常數(shù)。結(jié)果如下：

實(shí)施例4所述適配子特異性分析以及穩(wěn)定性分析 分別采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，pgl20蛋白，大腸桿菌外膜蛋白A，COCH蛋白， TRX-1蛋白，與16條適配子進(jìn)行特異性檢測(cè)，經(jīng)過結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些適配子都不與這些蛋 白相結(jié)合，而只與TRX-1蛋白結(jié)合保持較高的特異性。
[0019] 將所述的適配子，取0.2ug，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置三周。通過RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)三周的放置其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒有被降解。
[0020] 實(shí)施例5所述適配子疾病的診斷 取9個(gè)卵巢癌患者和5個(gè)正常人的血液，使用生理鹽水稀釋，獲得目標(biāo)樣本。
[0021 ]將16個(gè)偶聯(lián)有標(biāo)記的適配子分別與9個(gè)患者以及5個(gè)正常人的樣本混合40min，通 過生物素分離，定量分析其中的TRX-1蛋白的含量，通過分析發(fā)現(xiàn)，9個(gè)卵巢癌患者中TRX-1 蛋白的含量顯著增加，超過了規(guī)定的閾值。達(dá)到了卵巢癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)。由此可見，其診斷效 果較好。
[0022]以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人 員來說，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本 發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于卵巢癌檢測(cè)的試劑盒，其含有能與卵巢癌相關(guān)蛋白特異性結(jié)合的核酸適 體。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述核酸適體的序列如SEQ ID No: 1-16任 一所示。3. -種檢測(cè)卵巢癌的方法，其特征在于利用權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的試劑盒。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)卵巢癌的試劑盒。本發(fā)明提供的核酸適體，與人TRX-1蛋白具有較好的親和能力。利用本發(fā)明的核酸適體，可以捕獲血液中的TRX-1蛋白，通過其含量的變化來檢測(cè)卵巢癌，將其制備成為相應(yīng)的試劑盒，將用于卵巢癌的篩查。利用本發(fā)明的試劑盒，具有高靈敏、成本低的好處。
【IPC分類】G01N33/574
【公開號(hào)】CN105606810
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510806995
【發(fā)明人】李靜
【申請(qǐng)人】李靜
【公開日】2016年5月25日
【申請(qǐng)日】2015年11月22日