專利名稱：Ring1蛋白在提高植物對水稻矮縮病毒抗性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及RINGl蛋白在提高植物對水稻矮縮病毒抗性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻矮縮病毒(Rice Dwarf Virus,RDV)是呼腸孤病毒科(Reoviridae)植物呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus)的成員。RDV是引起水稻矮縮病的病原,可以感染水稻,造成水稻嚴(yán)重減產(chǎn)。RDV的傳播需借助于昆蟲介體葉蟬。RDV為雙鏈RNA病毒，其基因組為十二條雙鏈RNA。根據(jù)這十二條雙鏈RNA在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率由慢到快，分別命名為SI到S12。RDV基因組編碼至少七種結(jié)構(gòu)蛋白，包括P1、P2、P3、P5、P7、P8、P9 ;五種非結(jié)構(gòu)蛋白，包括卩1184、？1186、？11810、？11811、？11812。P2是RDV的外殼蛋白，由S2編碼，它能夠與水稻內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶及其類似蛋白相互作用，引起水稻赤霉素含量的降低，是造成水稻矮縮癥狀的原因之一(Zhu etal.，2005.The Rice Dwarf Virus P2Protein interacts with ent—Kaurene Oxidases invivo, leading to reduced biosynthesis of Gibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.)。另外，P2在RDV的昆蟲介體葉蟬細(xì)胞中，能夠引起細(xì)胞膜的融合，說明該蛋白在RDV侵染葉蟬過程中發(fā)揮作用(Zhou et al.,2007, TheP2capsid protein of the nonenveloped rice dwarf phytoreovirus induces membranefusion in insect host cells.Proceedings of the National Academy of Sciences ofUSA.104(49):19547-19552.)。酵母雙雜交是研究蛋白-蛋白相互作用的重要技術(shù)，通過研究蛋白之間的相互作用，可以深入了解蛋白在生物體內(nèi)的功能。泛素是一種廣泛存在于真核生物中的小分子蛋白。它由76個氨基酸殘基組成，在各個物種中是高度保守的。在蛋白的泛素化過程中，泛素C末端的甘氨酸在多種酶的催化作用下與底物中特定氨基酸殘基(大部分情況為賴氨酸殘基)共價相連，通常有多個泛素分子被依次連接在底物蛋白的特定位點上。如果后續(xù)的泛素分子被連接到前一個泛素分子的48位賴氨酸上，那么，被修飾的底物蛋白將被26S蛋白酶體識別并降解，釋放出游離的泛素分子參與新的反應(yīng)。通常情況下，蛋白的泛素化修飾需要三個步驟。首先，泛素與泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme, El)通過硫酯鍵相連,形成活性狀態(tài)。然后,活化的泛素被傳遞給泛素連接酶(ubiquitin-conjugating enzyme,E2),兩者也是通過硫酯鍵相連。最后，由蛋白-泛素連接酶(ubiquitin ligase enzyme,E3)識別并結(jié)合底物蛋白，催化E2上的泛素轉(zhuǎn)移到底物上。該過程重復(fù)發(fā)生，底物蛋白就被加上了多個泛素分子的長鏈。E3是底物特異性的決定因子。生物體內(nèi)E3數(shù)量龐大，可以分為很多不同的類型。以擬南芥為例，根據(jù)E3分子中亞基的組成和其作 用方式的不同，可將其分為以下幾種類型:含有 RING (Really Interesting New Gene) finger 的 E3、含有 HECT (Homology toE6_Associated Carboxy-Terminus) Domain 的 E3、含有 U_box 的 E3、CRLs (Cullin - RINGLigases)。其中 CRLs 又可分為四種不同的類型:SCF (the S phase kinase-associatedproteinl (SKPl) - culI ini (CULl) - F-box complex)、BTB (the bric-a-brac -tramtrack - broad complex)、DDB (the DNA damage-binding Complex) 和 APC (theanaphase-promoting complex)。真核生物大部分的蛋白降解事件都是由泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin_26SProteasome System,以下簡稱為UPS)控制的，UPS介導(dǎo)的蛋白降解對于植物應(yīng)對外界生物和非生物刺激有非常重要的意義，使得植物能在惡劣的環(huán)境下存活下來(Dreher andCallis, 2007)。不僅如此，UPS還能選擇性地清除合成過程中出錯的蛋白，避免這些蛋白對生物體造成危害。
蛋白的泛素化降解途徑在植物對抗病原微生物過程中也發(fā)揮著重要的作用。植物生長過程中不可避免的會遭遇病毒、細(xì)菌、真菌、線蟲、昆蟲等生物的危害，但是植物受到這些有害物種的侵害時并不都會產(chǎn)生病癥，這是因為植物本身具有多種防御系統(tǒng)來對抗這些外來侵害。近些年，越來越多的證據(jù)暗示，UPS在植物應(yīng)對病原物的過程中可能起著重要的作用。但是，蛋白的泛素化降解是特異性的，其特異性由與蛋白相互作用的E3酶決定，相對于生物體中存在的數(shù)量龐大的E3酶，目前已知的E3酶與其底物的對應(yīng)關(guān)系僅有少量報道。有關(guān)RDV的在先研究從未提及該病毒與任何水稻E3酶的相互作用，也沒有報道表明任何水稻E3酶具有抗RDV作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供蛋白RINGl或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體的用途。本發(fā)明提供的蛋白RINGl或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體在調(diào)控植物抗水稻矮縮病中的應(yīng)用；所述蛋白RINGl的氨基酸序列為序列表中的序列I。上述應(yīng)用中，所述水稻矮縮病的病原為水稻矮縮病毒(Rice Dwarf Virus)。上述應(yīng)用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，上述單子葉植物為水稻。上述應(yīng)用中，所述含有所述編碼基因的重組載體為將蛋白RINGl的編碼基因插入表達(dá)載體中得到的重組載體；在本發(fā)明的實施例中，重組載體PCambial301-FlagRINGl制備方法按照實施例2的一的方法進(jìn)行。所述蛋白RINGl的編碼基因的核昔酸序列具體為序列表中的序列2。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:將蛋白RINGl的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的水稻矮縮病抗性高于所述目的植物；所述蛋白RINGl的氨基酸序列為序列表中的序列I。上述方法中，所述蛋白RINGl的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2。上述方法中，所述水稻矮縮病的病原菌為水稻矮縮病毒(Rice Dwarf Virus)。上述方法中，所述蛋白RINGl的編碼基因通過重組載體導(dǎo)入目的植物；所述重組載體為將所述蛋白RINGl的編碼基因插入表達(dá)載體中得到的重組載體。在本發(fā)明的實施例中，重組載體pCambial301-FlagRINGl制備方法按照實施例2的一的方法進(jìn)行。上述方法中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，上述單子葉植物為水稻。所述轉(zhuǎn)基因植物的水稻矮縮病抗性高于所述目的植物具體體現(xiàn)在接RDV后，所述轉(zhuǎn)基因植物的感染的RDV病毒的植株數(shù)目少于所述目的植物；可通過鑒定是否含有RDV病毒的目的基因(S2的部分片段)或者植株的感病特征來確定感染的RDV病毒的植株。本發(fā)明的另一個目的是提供一種重組載體。本發(fā)明提供的重組載體，為將蛋白RINGl的編碼基因插入表達(dá)載體中得到的重組載體；所述蛋白RINGl的氨基酸序列為序列表中的序列I ;所述蛋白RINGl的編碼基因的核昔酸序列具體為序列表中的序列2。在本發(fā)明的實施例中，重組載體pCambial301_FlagRINGl制備方法按照實施例2的一的方法進(jìn)行。上述蛋白RINGl在作為蛋白-泛素連接酶中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍；所述 蛋白RINGl的氨基酸序列為序列表中的序列I。其中植物表達(dá)載體包括但不局限于pCambial300、pCambial301、pCambia3301、P麗101等；水稻品種優(yōu)選為對RDV敏感的品種如中花11、秀水11、日本晴、武3等；水稻組織或細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法可選自農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電擊法、花粉管導(dǎo)入法、脂質(zhì)體融合法以及其他任意可將質(zhì)粒導(dǎo)入的方法。本領(lǐng)域的技術(shù)人員懂得，通過置換、取代、附加或缺失蛋白序列中的一個或多個氨基酸，可對其進(jìn)行修飾而不改變其功能。因此，本發(fā)明應(yīng)該被理解為包括了對RINGl蛋白進(jìn)行的上述修飾。RINGl基因的喊基序列不局限于序列表中序列2所不，還包括具有將RINGl及帶有上述修飾的RINGl蛋白中各氨基酸殘基對應(yīng)的任一密碼子進(jìn)行選擇并組合的DNA序列。該密碼子的選擇可以按照常規(guī)方法，也可以參考宿主的密碼子偏好型。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)RINGl是一種E3蛋白-泛素連接酶，它能夠與RDV外殼蛋白P2相互作用，促使P2被26S蛋白酶體降解；在水稻中過量表達(dá)RINGl蛋白，可以降低P2的累積量，從而抑制病毒的擴增，提高水稻的抗病毒能力。


圖1為P2和RINGl蛋白在酵母中相互作用的結(jié)果圖2為免疫共沉淀實驗驗證P2和RINGl相互作用的結(jié)果圖3為體外實驗證明RINGl具有E3蛋白-泛素連接酶活性的結(jié)果圖4為P2和RINGl在293T細(xì)胞中共表達(dá)的免疫印跡檢測結(jié)果圖5為轉(zhuǎn)RINGl水稻的Western鑒定圖6為轉(zhuǎn)RINGl水稻和野生型水稻在RDV侵染后的RDV病毒相關(guān)基因的RT-PCR檢測圖7為健康和感病(感染RDV)水稻癥狀圖具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下將用實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但這些實施例并非對本發(fā)明的限制。實施例1、RINGl蛋白及其編碼基因的獲得一、RINGl蛋白及其編碼基因的獲得水稻文庫的構(gòu)建所用試劑盒為HybriZAP-2.ITwo-Hybrid Predigested Vector/Gigapack Cloning Kit (Stratagene),文庫構(gòu)建及篩選方法根據(jù)說明書進(jìn)行。所用誘館克隆PGBK-S2與專利號ZL200510114386.X所公布克隆相同。所用酵母菌株為AH109。篩選得到的陽性克隆經(jīng)測序和序列分析，確定其編碼的蛋白片段具有序列表中序列I所示的氨基酸序列的12-308個氨基酸，將該蛋白全長(即序列I對應(yīng)蛋白)命名為RING1，其編碼基因為序列表中序列2所示的核苷酸，將其命名為RINGl。二、RINGl全長序列的克隆及含有該片段的重組載體的獲得根據(jù)序列2設(shè)計引物，并在引物兩端加上所需酶切位點，引物序列為RING1-5’EcoR1:5’ -GAATTCATGGATCTGGAGAGGTCG-3’，RING1-3’ Sal1:5’ -GTCGACTTACAAGAATGGCGGCATCC-3，。依照說明書，用Invitrogen公司的TRIzol Reagent提取中花11水稻(Oryzasativa L.japonica cv.ZhonghualI,許昱等《“中花11”水稻谷蛋白Gtl基因克隆及臘質(zhì)基因啟動子引導(dǎo)Gtl基因表達(dá)載體的構(gòu)建》，上海師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2010年4月第39卷第2期,204頁,公眾可從北京大學(xué)獲得)的總RNA,用該公司的SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。逆轉(zhuǎn)錄所用引物為16個核苷酸的Oligod (T)引物。以逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，以上述基因特異性引物RING1-5’ EcoRI和RING1-3’SalI 進(jìn)行 PCR (Polymerase Chain Reaction)反應(yīng)，得到 1287bp 的 PCR 產(chǎn)物，該PCR產(chǎn)物具有序列表中序列2所示的核苷酸?；厥誔CR產(chǎn)物后用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I進(jìn)行酶切，回收1285bp帶有粘性末端的PCR產(chǎn)物；將載體pGADT7 (Clontech公司，產(chǎn)品目錄號:630442)用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I雙酶切，回收7987bp載體骨架；將上述1285bp帶有粘性末端的PCR產(chǎn)物與7987bp載體骨架用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5 α，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒送去測序，該質(zhì)粒為將序列表中序列2所示的基因RINGl插入載體pGADT7的EcoR I和Sal I酶切位點間得到的載體，將該質(zhì)粒命名為pGAD-RINGl，即為重組載體。實施例2、體外證明RINGl蛋白與RDV P2的相互作用一、酵母雙雜交實驗證明RINGl與RDV P2的相互作用將實施例1得到的重組載體pGAD-RINGl與pGBK_S2 (S2為RDV P2蛋白的編碼基因，RDV P2蛋白的編碼基因?qū)雙GBK中得到的。記載該載體的非專利文獻(xiàn)為Zhu etal.，2005.The Rice Dwarf Virus P2Protein interacts with ent—Kaurene Oxidases invivo, leading to reduced biosynthesis of Gibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945 ;公眾可從北京大學(xué)獲得)共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109 (購自Clontech公司，產(chǎn)品目錄號為630444)，酵母轉(zhuǎn)化方法采用公知的PEG/LiAc法；轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞涂布營 養(yǎng)缺陷型平板SD/-Trp-LeU，3(TC條件下培養(yǎng)2天。轉(zhuǎn)化子劃線至SD/-Trp-Leu-His-Ade營養(yǎng)缺陷型平板,30°C培養(yǎng)4天,觀察轉(zhuǎn)化子的生長情況。該實驗同時設(shè)負(fù)對照 pGADT7(產(chǎn)品目錄號為:630442)和 pGBK_S2、pGAD_RINGl 和 pGBK(購自 Clontech公司產(chǎn)品目錄號為630443)。結(jié)果如圖1 所示(A:pGAD-RINGl 和 pGBK_S2 ；B:pGADT7 和 pGBK_S2 ；C:pGAD-RINGl和pGBK)。結(jié)果證明，RINGl全長蛋白與RDV P2能在酵母中相互作用。二、免疫共沉淀實驗證明RINGl與RDV P2的相互作用UpWMlOl-FLAGHPRl 及 pCambial301_HAS2 克隆的構(gòu)建以pGAD-RINGl 質(zhì)粒為模板，以引物 FLAGRING1-5’ KpnI (序列為:5’-GGTACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGATGGATCTGGAGAGGTCG-3’)和 RING1-3’PstI (序列為:5’_CCTGCAGTTACAAGAATGGCGGCATC-3’ )進(jìn)行 PCR 擴增，得到 1314bp 的 PCR 產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物用Kpn I和Pst I雙酶切，回收1312bp的酶切產(chǎn)物；ρ^101質(zhì)粒(參見趙燕等《薺菜CRABS CLAff的克隆與擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化》，《西北植物學(xué)報》2009年第11期第2162頁，公眾可從北京大學(xué)獲得)用Kpn I和Pst I雙酶切，回收9923bp的載體骨架；將1321bp的酶切產(chǎn)物和9923bp的載體骨架用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pWMlOl-FLAGHPRl (含有序列2所示的RINGl和FLAG標(biāo)簽)。pCambial301-HAS2 (記載該載體的非專利文獻(xiàn)為:Zhu et al., 2005.The RiceDwarf Virus P2Protein interacts with ent—Kaurene Oxidases in vivo, leadingto reduced biosynthesis of GibberelI ins and rice dwarf symptoms.PlantPhysiology.139:1935-1945 ;公眾可從北京大學(xué)獲得)，其為將HAS2 (HAP2是在P2蛋白上帶了 HA標(biāo)簽)構(gòu)建入pCambial301。pWMlOl-FLAGRINGl 和 pCambial301_HAS2 分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 EHA105，轉(zhuǎn)化方法為公知的電擊轉(zhuǎn)化方法，得到 EHA105/pWM101-FLAGRINGl 和 EHA105/pCambial301-HAS2。2、HAP2和FLAGRING1在煙草中的表達(dá)分別挑取EHA105/pWM101-FLAGRINGl 和 EHA105/pCambial301-HAS2 單菌落，接A 2ml LB 液體培養(yǎng)基(含有 Kanamycinl00mg/L, Rifampicin50mg/L), 28°C振蕩培養(yǎng) 16hr(hr為小時hour的簡寫)。1:50轉(zhuǎn)接入10ml LB液體培養(yǎng)基(含有Kanamycinl00mg/L,Rifampicin50mg/L),繼續(xù)培養(yǎng)至OD6tltl約為0.8。4000rpm (rpm為每分鐘轉(zhuǎn)速)離心5min(min 為分鐘)收菌。AS buffer (IOmM MES, 150 μ M AS, IOmM MgCl2)重懸，調(diào) OD6tltl 至 1.0。將兩種菌液以1:1 (體積)混合，通過壓力注射方法注射煙草N.benthamiana(記載該煙草的非專利文獻(xiàn)為 Zhu et al., 2005.The Rice Dwarf Virus P2Proteininteracts with ent-Kaurene Oxidases in vivo, leading to reduced biosynthesis ofGibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.公眾可從北京大學(xué)獲得)并分別單獨取兩種菌懸液通過壓力注射方法注射煙草作為負(fù)對照。煙草繼續(xù)生長3天后，將注射的葉片置于液氮中研磨成粉末。3、免疫共沉淀實驗取約500mg上述葉片粉末加入1.5ml離心管中，加入Iml IP Buffer (150mMNaCl,50mM Tris-Cl (pH7.5),0.l%NP_40，5mM DTT，每 50ml 加 I 片蛋白酶抑制劑(ProteaseInhibitor Cocktail Tablets, EDTA-free ;Roche),混勻后 4°C, 12000rpm 離心 IOmin,將上清吸出轉(zhuǎn)移至新的離心管中。 再次以上面條件離心5min，將上清吸出轉(zhuǎn)移至新的離心管中，防止吸到沉淀，得到煙草蛋白提取物。
在上述步驟中得到的煙草蛋白提取物中加入20 μ I protein G beads (GEhealthcare，17-0618-06)，同時加入 0.2μ1 FLAG 抗體(Sigma，F(xiàn)3165)，4°C溫育 1.5hr。4°C, IOOOrpm 離心 lmin,吸掉上清。用 IP Buffer 洗 beads3 次。加入 50 μ 13Xproteinsample buffer (125mM Tris-Cl (pH6.8)，20% 甘油，6%SDS，0.004% 溴酚藍(lán)，30mM DTT), 95°C加熱5min，吸取上清進(jìn)行SDS-PAGE。SDS-PAGE及Western Blot依照公知方法及產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用抗體為ant1-FLAG-HRP (sigma)和 ant1-HA-Peroxidase (Roche)。結(jié)果如圖2所示，表明用FLAG抗體能夠?qū)LAGRING1和HAP2同時沉淀下來，說明這兩種蛋白之間相互作用。三、RINGl具有 E3 蛋白-泛素連接酶(E3Protein_Ubiquitine Ligase)活性1、表達(dá)克隆構(gòu)建及蛋白的表達(dá)以pGAD-RINGl 質(zhì)粒為模板，用 RING1-5’EcoRI (序列為:5’ -GAATTCATGGATCTGGAGAGGTCG-3’ 和 RING1-3’ SalI (序列為:5’ -GTCGACTTACAAGAATGGCGGCATCC-3’ )進(jìn)行PCR擴增，得到1314bp的PCR產(chǎn)物。1314bp的PCR產(chǎn)物以EcoR I和Sal I雙酶切后，凝膠電泳回收1312bp的酶切產(chǎn)物；將 pMAL-p2x 質(zhì)粒(New England Biolabs, E8000S,本身表達(dá) MBP 蛋白)EcoR I 和 SalI雙酶切，凝膠電泳回收6703bp的載體骨架；將1312bp的酶切產(chǎn)物和6703bp的載體骨架以T4DNA連接酶連接，得到重組載體pMAL-p2x-RINGl，經(jīng)過測序，該重組載體為將序列表中序列2所示的DNA分子插入pMAL-p2x的EcoR I和Sal I酶切位點間得到的載體，命名為pMAL-p2x-RINGl0將pMAL_p2x_RINGl和pMAL_p2x質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌株Rosetta (DE3):取0.5μ I質(zhì)粒，加入50 μ I 感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后冰上靜置30min ;42°C熱激90sec，加入Iml新鮮LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)Ihr ；3000rpm離心2min收集菌體，涂布LB平板(含100mg/LAmpicillin)，得到 Rosetta (DE3) /pMAL-p2x-RINGl (EcoR I 和 Sal I 雙酶切鑒定，得到1312bp的酶切產(chǎn)物的為陽性)和Rosetta (DE3) /pMAL_p2x。分別挑Rosetta (DE3)/pMAL_p2x_RINGl 和 Rosetta (DE3)/pMAL_p2x 單菌落接于5ml LB培養(yǎng)基中(含100mg/L Ampicillin)，37°C過夜培養(yǎng)。1:200轉(zhuǎn)接于300ml LB培養(yǎng)基中(含100mg/L Ampicillin)培養(yǎng)至0D600約為0.6。加入IPTG至終濃度ImM，誘導(dǎo)表達(dá) 4hr,得到 Rosetta (DE3) /pMAL-p2x-RINGl 菌液和 Rosetta (DE3) /pMAL-p2x 菌液。2、體外泛素化實驗檢測E3活性分別取IOOml Rosetta (DE3)/pMAL-p2x-RINGl 菌液和 Rosetta (DE3)/pMAL-p2x菌液,5000rpm離心IOmin收集菌體。力口入5ml破菌緩沖液(20mM Tris-Cl pH7.5, IOOmMNaCl，0.1%ΝΡ-40, ImM DTT, 0.0lM PMSF)，超聲破碎。4°C，12000rpm,離心20min取上清液，SP得到 Rosetta (DE3)/pMAL_p2x_RINGl 菌體蛋白(MBP-RING1)和 Rosetta (DE3)/pMAL-p2x菌體蛋白(MBP)。吸取40 μ I Amylose resin (NEB),用 Iml 破菌緩沖液洗,6000rpm,離心 15sec,吸去上清；重復(fù)洗一次。加入500 μ I破菌緩沖液，I μ I Rosetta (DE3) /pMAL-p2x-RINGl菌體蛋白或Rosetta (DE3)/pMAL-p2x菌體蛋白，室溫結(jié)合1.5hr (用靜音混合器)，用20mMTris-Cl (pH7.5)洗漆4次,吸凈液體,得到結(jié)合后Amylose resin。
在結(jié)合后Amylose resin中加入:20 X buffer 1.5 μ IEl (recombinant wheat(Triticum aestivum)El(G1:136632)) 3 μ IE2 (產(chǎn)品名稱:Recombinant Human UBCh5b，出售公司:R&D，貨號:Ε2_622_100)3 μ IHis-Ub (UBQ14, At4g02890) 6 μ I加雙蒸水至總體積為30 μ I。30 °C 950rpm 反應(yīng) 2.5hr。加入15 μ 13Xprotein loading buffer, 10CTC加熱 5min,取上清進(jìn)行 SDS-PAGE。用 ant1-His 抗體(KPL，24-01-01)，依據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行 Western Blot。20 Xbuffer # IMTris-Cl pH7.5,40mM ATP, IOOmM MgCl2,40mM DTT。所用其余均為商品化試劑，可從試劑公司購得，并依照說明書進(jìn)行實驗操作。結(jié)果如圖3所示，與Rosetta (DE3) /pMAL-p2x菌體蛋白(MBP)相比，在RINGl存在時Rosetta (DE3) /pMAL-p2x-RINGl菌體蛋白(MBP-RING1)能夠檢測到蛋白泛素化產(chǎn)生的大分子量蛋白條帶，表明RINGl具有E3蛋白-泛素連接酶活性。四、RINGl與RDV P2在293T細(xì)胞中的共表達(dá)1、表達(dá)載體的構(gòu)建I)重組質(zhì)粒 pRK-FLAGRINGlpGAD-RINGl 為模板，以引物 RKRING1-5’ SalI (序列為:5’ -TATTGTCGACGATGGATCTGGAGAGGTCG-3’)和 RKRING1-3’ XhoI (序列為:5’ -GGCCTCGAGTTACAAGAATGGCGGCATC-3’)進(jìn)行PCR擴增，得到1329bp的PCR產(chǎn)物。將上述PCR產(chǎn)物用Sal I和Xho I雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，與經(jīng)過同樣酶切 pRK-FLAG 質(zhì)粒(參見 Min Lian and Xiaofeng Zheng, HSCARG Regulates NF- κ BActivation by Promoting the Ubiquitination of RelA or COMMDI,J Biol Chem.2009July3 ;284(27): 17998 - 18006.公眾可從北京大學(xué)獲得；)得到的6300bp的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pRK-FLAGRINGl，經(jīng)過測序，重組質(zhì)粒pRK-FLAGRINGl為將序列表中序列2所示的DNA分子插入pRK-FLAG質(zhì)粒的Sal I和Xho I酶切位點間得到的載體。2 )重組質(zhì)粒 pRK-HAS2pGBK_S2 (參見 Zhu et al., 2005.The Rice Dwarf Virus P2Protein interactswith ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced biosynthesis ofGibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945..公眾可從北京大學(xué)獲得；)為模板，以引物RKS2-5’ SalI (序列為:5’ -CACCGTCGACCGCTTATCCTAATGACGTCAG-3’)和 RKS2-3’ Not I (序列為:5’ -ATTGCGGCCGCTCACAATGCATCATAGATAGATTG-3’)進(jìn)行PCR擴增，得到3483bp的PCR產(chǎn)物。將上述PCR產(chǎn)物用Sal I和Not I雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，與經(jīng)過同樣酶切pRK_HA質(zhì)粒(參見 Min Lian and Xiaofeng Zheng, HSCARG Regulates NF- κ B Activation byPromoting the Ubiquitination of RelA or COMMDI, J Biol Chem.2009July3;284(27):17998 - 18006.公眾可從北京大學(xué) 獲得；)得到的6300bp的載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物。取5μ I連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化DH5a，涂布含有100mg/L Ampicillin的LB平板，37°C倒置培養(yǎng)16hr。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，陽性克隆進(jìn)行測序。所得質(zhì)粒為PRK-HAS2，是用于表達(dá)RDV P2的質(zhì)粒。3)共表達(dá)pRK-FLAGRINGl 和 pRK_HAS2 共轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞(參見 Min Lian and XiaofengZheng, HSCARG Regulates NF-κ B Activation by Promoting the Ubiquitination ofRelA or COMMDI, J Biol Chem.2009July3; 284 (27): 17998 - 18006.公眾可從北京大學(xué)獲得；)，單獨用PRK-HAS2轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照。通過胰酶消化收集293T細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基(高糖DMEM，10%胎牛血清)以I X IO5至4X IO5細(xì)胞/cm2的密度平鋪細(xì)胞于組織培養(yǎng)皿上(使細(xì)胞貼壁后所占面積達(dá)到培養(yǎng)皿總面積的40 - 70%)。將細(xì)胞置于含5% CO2的37°C溫箱中孵育8-24hr，當(dāng)細(xì)胞貼壁完全后即可開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2hr換液(用4ml新鮮的完全培養(yǎng)基置換舊的培養(yǎng)基)。制備磷酸鈣一 DNA沉淀(500 μ I反應(yīng)總體積):在滅菌水中加入5 μ g質(zhì)粒DNA，再加入31 μ 12M CaCl2,使三者總體積達(dá)到250 μ I，混勻。將等體積2 X HBS鹽溶液(NaCl 16.3g/L，KC10.74g/L, Na2HPO40.214g/L, Glucose2.4g/L，HEPES10g/L，調(diào) pH 值至7.05)逐滴加入，同時輕彈管壁,使每滴加入后及時混勻。靜置2min后,立即將這500 μ I的磷酸鈣一 DNA懸液逐滴加入上述單層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕搖動平皿混勻。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞置于含5% CO2的37°C溫箱孵育。8hr后吸去培養(yǎng)基與DNA沉淀，加入5ml37°C預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)將細(xì)胞置于溫箱內(nèi)孵育。轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞，培養(yǎng)20小時后用Iml細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞(若需用MG132處理，則在收集細(xì)胞前8hr在培養(yǎng)基中加入MG132至終濃度25 μ Μ)，進(jìn)行 SDS-PAGE 和 Western blot 檢測。結(jié)果如圖4所示，與RINGl共表達(dá)時，P2的累積量明顯降低。當(dāng)用26S蛋白酶體抑制劑MG132對細(xì)胞進(jìn)行處理后，P2的累積量增加，且是否與RINGl共表達(dá)差別不大。說明RINGl能夠促進(jìn)P2的降解，且該過程是通過26S蛋白酶體進(jìn)行的。實施例2、RINGl在提高水稻對RDV的抗性中的應(yīng)用—、表達(dá)載體的 構(gòu)建pRTL2-Flag載體構(gòu)建:在invitrogen公司合成Flag_F(序列為:CATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGG)和 Flag-R (序列為:5’ -TCGACCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTC-3’)兩條序列，按照說明稀釋成100 μ M，各取10 μ I混勻，65°C退火IOmin后降到室溫后形成雙鏈，與用NcoI和SalI酶切過的pRTL2 (參見Zhu et al., 2005.The RiceDwarf Virus P2Protein interacts with ent-Kaurene Oxidases in vivo, leadingto reduced biosynthesis of GibberelI ins and rice dwarf symptoms.PlantPhysiology.139:1935-1945.公眾可從北京大學(xué)獲得)質(zhì)粒的3812bp載體骨架連接，得到pRTL2-Flag 載體。pCambial301-FlagRINGl 載體的構(gòu)建:以 pGAD-RINGl 為模板，以引物RING1-5’ SalI (序列為:5’ -TATTGTCGACGATGGATCTGGAGAGGTCG-3’)和 RING1-3’ KpnI (序列為:5’ -GGCGGTACCTTACAAGAATGGCGGCATC-3’ )進(jìn)行 PCR 擴增，得到 1329bp 的 PCR 產(chǎn)物。將上述PCR產(chǎn)物用Sal I和KpnI雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，與經(jīng)過同樣酶切PRTL2-FLAG質(zhì)粒的3836bp的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pRTL2_FLAGRINGl，經(jīng)過測序，重組質(zhì)粒PRTL2-FLAGRING1為將序列表中序列2所示的DNA分子插入pRTL2_FLAG質(zhì)粒的SalI和Kpn I酶切位點間得到的載體。
然后將pRTL2-FLAGRINGl用PstI單酶切，得到2398bp的酶切產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物，與用同樣酶酶切的pCambial301質(zhì)粒(參見Zhu et al.，2005.The RiceDwarf Virus P2Protein interacts with ent-Kaurene Oxidases in vivo, leadingto reduced biosynthesis of GibberelI ins and rice dwarf symptoms.PlantPhysiology.139:1935-1945.公眾可從北京大學(xué)獲得)，得到11837bp的載體骨架連接，得到重組載體pCambial301-FlagRINGl (PstI單酶切，得到2398bp的酶切產(chǎn)物為陽性)?？蛰d體對照pCambial301_Flag載體構(gòu)建:將pRTL2_Flag質(zhì)粒用PstI單酶切，跑瓊脂糖凝膠，切膠回收1123bp的片段，與用同樣酶酶切的pCambial301質(zhì)粒11837bp的載體骨架連接，得到載體pCambial301_Flag載體,與pCambial301_FlagRINGl唯一的區(qū)別在于少了目的基因RINGl。二、過量表達(dá)轉(zhuǎn)RINGl水稻的獲得(I)愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)中花11水稻(以下也稱為野生型水稻)種子去殼，先用70%乙醇浸泡lOmin，再用
0.1%升汞浸泡30min ;進(jìn)行表面除菌。用大量無菌水洗去種子表面的溶液，用無菌濾紙吸去種子表面的水分。將種子置于成熟胚愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板上，用Parafilm膜封閉平皿邊緣，于26°C溫箱內(nèi)避光培養(yǎng)。大約15天后，小心取下長出的愈傷組織，轉(zhuǎn)移到成熟胚繼代培養(yǎng)基上，同樣條件繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。每兩周需進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)。用于轉(zhuǎn)化時，需挑選繼代培養(yǎng)5天左右、呈淡黃色的顆粒狀愈傷組織。(2)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)將pCambial301-FLAGRINGl 電轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 EHA105 (參見 Zhu et al., 2005.The Rice Dwarf Virus P2Protein interacts with ent-Kaur ene Oxidases invivo, leading to reduced biosynthesis of Gibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.公眾可從北京大學(xué)獲得)中，得到重組菌EHA105/pCambial301-FLAGRINGl。重組菌EHA105/pCambial301-FLAGRINGl能夠在加了抗生素利福平和卡那霉素的LB 平板上生長，而且以引物 RING1-5’ SalI (序列為:5’ -TATTGTCGACGATGGATCTGGAGAGGTCG-3’)和 RING1-3’ KpnI (序列為:5’ -GGCGGTACCTTACAAGAATGGCGGCATC-3’ )進(jìn)行 PCR 擴增，得到1329bp的PCR產(chǎn)物的為陽性菌。將EHA105/pCambial301-FLAGRINGl 在含有抗生素(50mg/L Kanamycin，50mg/LRifampicin)的LB平板上劃線，28°C培養(yǎng)2天。挑取單菌落接入液體LB培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)至0D_約為0.5，加入乙酰丁香酮至終濃度100禮，得到用于轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織的農(nóng)桿菌懸液。(3)水稻愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)將繼代愈傷組織放入滅過菌的錐形瓶中，倒入農(nóng)桿菌懸液使之浸沒愈傷組織。室溫放置20min，并不時輕輕晃動使愈傷組織與菌液充分接觸。用無菌的鑷子輕輕取出愈傷組織，放于無菌濾紙上吸去多余的菌液，轉(zhuǎn)移到鋪有一層無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基平板上。28°C暗培養(yǎng)3天，得到經(jīng)過共培養(yǎng)的愈傷組織。(4)抗性愈傷組織的篩選與分化將經(jīng)過共培養(yǎng)的愈傷組織用適量無菌水清洗，除去表面殘余的農(nóng)桿菌，放在篩選培養(yǎng)基上，26°C避光培養(yǎng)進(jìn)行篩選，兩周后轉(zhuǎn)移到新的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選兩周。挑選經(jīng)過兩輪篩選后狀態(tài)較好的愈傷組織，將其轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基平板上，先避光培養(yǎng)3天，然后再轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)箱中(15hr/day)進(jìn)行光照培養(yǎng)。一個月后可見分化出的小苗。當(dāng)分化的小苗長至約2cm時，將其轉(zhuǎn)移到錐形瓶中的生根培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)兩周左右。選擇長勢較好、根系發(fā)達(dá)的小苗，用自來水洗去根部的培養(yǎng)基后移栽入土壤中，收取種子，得到T1代轉(zhuǎn)RINGl水稻種子，播種得到T1代轉(zhuǎn)RINGl水稻。T1代的水稻種子通過潮霉素初步篩選(pCambial301載體帶有潮霉素抗性篩選基因)，發(fā)芽的種子，表明載體轉(zhuǎn)入水稻。將發(fā)芽的種子種入土中，生長2周后，取0.1g葉片，用液氮磨成粉末，加入蛋白提取緩沖液(0.25M Tris-Hcl, pH6.8，8%SDS，8%P_巰基乙醇，20%甘油)200μ 1，冰上孵育10min，100°C煮沸l(wèi)Omin，4°C，12000rpm離心IOmin后取上清，進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜之后用Western檢測。SDS-PAGE及Western Blot依照公知方法及產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用抗體為ant1-FLAG-HRP (sigma)。如圖5，在46KDa處出現(xiàn)條帶者為陽性，表明基因轉(zhuǎn)入且蛋白表達(dá)，用于之后的抗病分析實驗。采用同樣的方法,將空載體pCambial301_Flag轉(zhuǎn)入野生型水稻中，得到轉(zhuǎn)空載體水稻。用潮霉素水浸泡種子進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化篩選。三、轉(zhuǎn)RINGl水稻對RDV抗性增強1、RT-PCR鑒定RDV P2部分蛋白的表達(dá)用攜帶RDV (參見 Zhu et al., 2005.The Rice Dwarf Virus P2Proteininteracts with en t-Kaurene Oxidases in vivo, leading to reduced biosynthesis ofGibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.公眾可從北京大學(xué)獲得。)的葉蟬(病原菌為水稻矮縮病毒(Rice Dwarf Virus))接種T1代轉(zhuǎn)RINGl水稻、轉(zhuǎn)空載體水稻和野生型水稻中花11，每種水稻接種25株，白天30度，晚上22度，濕度60%培養(yǎng)，每株接5頭葉蟬，咬食三天后將葉蟬捉出，咬食過的水稻在陽光溫室種培養(yǎng)(自然光，溫度。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值)。接毒2周后，提取25株T1代轉(zhuǎn)RINGl水稻、25株轉(zhuǎn)空載體水稻和25株野生型水稻中花11總RNA，之后，按照下表1，用RQlDnase (Promega，貨號:M610A)對RNA中的基因組DNA進(jìn)行消化:
權(quán)利要求
1.蛋白RINGl或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體在調(diào)控植物抗水稻矮縮病中的應(yīng)用； 所述蛋白RINGl的氨基酸序列為序列表中的序列I。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述水稻矮縮病的病原為水稻矮縮病毒(Rice Dwarf Virus)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于: 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
4.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:將蛋白RINGl的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的水稻矮縮病抗性高于所述目的植物； 所述蛋白RINGl的氨基酸序列為序列表中的序列I。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述蛋白RINGl的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述水稻矮縮病的病原為水稻矮縮病毒(Rice Dwarf Virus)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于:所述蛋白RINGl的編碼基因通過重組載體導(dǎo)入目的植物； 所述重組載體為將所述蛋白RINGl的編碼基因插入表達(dá)載體中得到的重組載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于:所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
9.一種重組載體，為將蛋白RINGl的編碼基因插入表達(dá)載體中得到的重組載體； 所述蛋白RINGl的氨基酸序列為序列表中的序列I ; 所述蛋白RINGl的編碼基因的核昔酸序列具體為序列表中的序列2。
10.蛋白RINGl在作為蛋白-泛素連接酶中的應(yīng)用； 所述蛋白RINGl的氨基酸序列為序列表中的序列I。
全文摘要
本發(fā)明公開了RING1蛋白在提高植物對水稻矮縮病毒抗性中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了蛋白RING1或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體在調(diào)控植物抗水稻矮縮病中的應(yīng)用；所述蛋白RING1的氨基酸序列為序列表中的序列1。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)RING1是一種E3蛋白-泛素連接酶，它能夠與RDV外殼蛋白P2相互作用，促使P2被26S蛋白酶體降解，且在水稻中過量表達(dá)RING1蛋白，可以降低P2的累積量，從而抑制病毒的擴增，提高水稻的抗病毒能力。
文檔編號C12N15/52GK103194431SQ20131013379
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月17日
發(fā)明者李毅, 劉利芳 申請人:北京大學(xué)