一種水稻黑條矮縮病抗性的分子鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物和現(xiàn)在農業(yè)高新技術領域，涉及一種水稻黑條矮縮病抗性的分子 鑒定方法，具體地說，涉及一種鑒定周期短、準確度高的水稻黑條矮縮病品種抗性的分子鑒 定方法。
【背景技術】
[0002] 水稻黑條矮縮病毒（Riceblack-streakeddwarfvirus，RBSDV)引起的水稻黑條 矮縮病是一種由灰飛虱striate/A/sFallen)傳播的蟲媒病毒病害，廣泛分 布于中國、朝鮮、韓國和日本等東亞地區(qū)。水稻黑條矮縮病癥狀主要表現(xiàn)為植株矮縮，葉色 濃綠，分蘗增加，葉片短縮、僵硬，葉片背面、葉鞘以及莖桿表面有蠟白色脈腫出現(xiàn)，發(fā)病后 期變?yōu)檠厝~脈縱向黑褐色的瘤狀突起，穗小或不抽穗以及結實不良等癥狀，不同的品種、不 同的部位及生育期發(fā)病的癥狀也會有所不同。該病害1941年在日本有一次暴發(fā)，之后于20 世紀60年代在中國、日本、韓國、朝鮮均成為流行病害，此后30年間一度銷聲匿跡，20世紀 90年代后期水稻黑條矮縮病在江浙滬以及安徽福建北部在內的長江中下游稻區(qū)暴發(fā)流行， 造成了巨大的經濟損失。
[0003] 水稻黑條矮縮病主要以灰飛虱為傳毒媒介進行持久性傳播，介體飛虱一旦染毒， 終身帶毒，并能連續(xù)傳毒，但不經卵傳毒。病毒主要在大麥、小麥病株上越冬，有部分也在灰 飛虱體內越冬。田間病毒通過麥、早稻、晚稻的途徑完成侵染循環(huán)。第一代灰飛虱在病麥上 接毒后傳到早稻、單季稻、晚稻和青玉米上傳毒。稻田中繁殖的2、3代灰飛虱，在水稻病株 上吸毒后，迀入晚稻和秋玉米上傳毒，晚稻上繁殖的灰飛虱成蟲和越冬代若蟲又進行傳毒， 傳給大麥、小麥。灰飛虱在病毒寄主上吸汁獲毒，最短獲毒時間30分鐘，1-2天即可充分獲 毒，病毒在灰飛虱體內循回期為8-35天，接毒時間僅1分鐘，獲毒最低溫度在8°C以下，4~ 5°C介體不能傳毒。
[0004] 近年來，隨著耕作制度和栽培方式的變化、農田生態(tài)多樣、冬季氣候變暖和感病品 種的大面積推廣，水稻黑條矮縮病在江蘇、浙江、湖南等省大規(guī)模發(fā)生，迅速成為華東稻區(qū) 最主要的水稻病害之一，造成了糧食減產、農民減收，給水稻生產造成嚴重損失，同時也嚴 重挫傷了農民的種糧積極性，也對全國的糧食安全構成了極大的威脅。
[0005] 與大部分植物病毒病流行一樣，水稻黑條矮縮病的流行同樣需要其流行生態(tài)系統(tǒng) 中病毒-介體-寄主-環(huán)境4大基本因子的完美結合?，F(xiàn)今對該病害的突發(fā)成災原因還未 有詳細的研宄，對灰飛虱種群數(shù)量以及帶毒率波動、暖冬、品種、栽培模式等條件如何對病 害流行起作用和為什么起作用還有待進一步研宄。利用水稻品種本身抗病性是防治水稻黑 條矮縮病的有效手段，由于現(xiàn)在缺乏高抗品種，挖掘、篩選較好抗病性的種質資源對該病害 的控制有著重要的意義。
[0006] 目前水稻黑條矮縮病的品種抗性鑒定主要有田間自然鑒定法和室內人工接種鑒 定法。田間自然發(fā)病鑒定將待鑒定水稻以小區(qū)種植于大田，傳毒介體灰飛虱自然傳毒，待水 稻顯現(xiàn)病癥后調查各鑒定水稻小區(qū)的穴發(fā)病率來鑒別水稻的抗性水平。田間自然鑒定法 無法排除排趨性的干擾，可能帶來假抗病表現(xiàn)。室內人工接種鑒定是在人工控制條件下定 量接種帶毒灰飛虱一定時間，培養(yǎng)待測水稻至發(fā)病顯癥后，根據(jù)病害發(fā)生的嚴重度來評價 待測水稻對水稻黑條矮縮病的抗性水平，該方法可以克服自然鑒定法中排趨性的干擾，實 現(xiàn)了科學準確的水稻抗病的評價，然而該方法用于品種抗性鑒定需要大量的傳毒介體灰飛 虱，人工篩選無毒灰飛虱人工飼養(yǎng)規(guī)模量小，難以滿足品種抗性鑒定的規(guī)模量的需求，限制 了該方法的推廣應用。同時，無論是田間自然鑒定法和室內人工接種鑒定法，均需要培養(yǎng)至 水稻分蘗盛期顯癥后通過調查發(fā)病率來評價品種抗性水平，鑒定周期很長，為保證準確度 需要大量的實驗處理，費時又費力。
[0007] 當前檢驗鑒定植物病毒的技術飛速發(fā)展，除了傳統(tǒng)的生物學方法、血清學方法、電 子顯微鏡法、芯片檢測法，新興起的分子生物學方法給植物病毒的鑒定提供了新思路。目前 主要應用的定性檢測分子生物學方法包括病毒核酸分子雜交技術、dsRNA電泳技術和多聚 酶鏈式反應（PCR)技術，定量檢測主要是指實時熒光定量PCR技術。此種方法靈敏度高，特 異性強，檢測速度快，操作過程也比較簡便、可用于大量樣品檢測。熒光定量PCR在植物病 毒檢測與鑒定方面，能夠定量檢測病毒拷貝數(shù)。應用熒光定量PCR檢測未知樣本時，相比其 他定量方法和普通PCR方法特異性更強、準確性高、靈敏度高、線性關系廣、操作簡單安全， 樣品的污染較底，且不需要后期處理。
[0008] 我們研宄證明對水稻植株接種RBSDV，不管是抗病還是感病水稻植株體內，均檢測 到RBSDV病毒，另外水稻植株苗期感染RBSDV病毒之后，癥狀不凸顯，不能確定其抗病性，需 要等到分蘗盛期才能確定其抗病性。令人振奮的是，我們新近研宄發(fā)現(xiàn)水稻低氧萌發(fā)所產 生的胚芽鞘接種RBSDV病毒后一段時間胚芽鞘內的RBSDV病毒增殖速度與水稻品種抗性直 接相關。胚芽鞘是水稻胚芽外的錐形套狀物，是一個鞘狀結構，胚芽鞘本來是植物葉片的保 護組織，有保護胚芽中更幼小的葉和生長錐的作用。通常水稻植株感染RBSDV病毒都是在 水稻秧苗期通過灰飛虱傳毒的，而種子萌發(fā)產生胚芽鞘的傳毒研宄被忽略，我們研宄發(fā)現(xiàn) 胚芽鞘接種RBSDV病毒后一段時間胚芽鞘內的RBSDV病毒增殖速度與水稻品種抗性直接相 關，我們的研宄發(fā)現(xiàn)給水稻黑條矮縮病抗病性的鑒定提供了新思路。
[0009] 本發(fā)明通過胚芽鞘培養(yǎng)前期激素的低氧誘導和胚芽鞘培養(yǎng)后期激素的抑制培養(yǎng) 來拓展胚芽鞘的生長時間，而在此時間內通過熒光定量RT-PCR技術對接種病毒后胚芽鞘 內的RBSDV含量進行檢測，通過制作RBSDV增殖趨勢圖實現(xiàn)了接毒后胚芽鞘內RBSDV病毒 增殖速度快速而準確地測量，進而通過比較待鑒定水稻和鑒定標尺胚芽鞘內病毒粒子增殖 速度差異快速鑒定水稻品種對黑條矮縮病的抗性水平和抗性等級。這一鑒定方法除了可以 應用于水稻品種資源的發(fā)掘鑒定、品種抗性評價、抗病品種選育外，亦可以應用于抗病基因 定位的表型鑒定和抗性遺傳規(guī)律研宄等眾多領域。

【發(fā)明內容】

[0010] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的水稻黑條矮縮病品種抗性鑒定方法存在有鑒定周期 長、準確度低等缺點，提供了一種鑒定周期短、準確度高的水稻黑條矮縮病品種抗性的分子 鑒定方法。
[0011] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案解決的： 一種水稻黑條矮縮病抗性的分子鑒定方法，其特征在于：該鑒定方法包括以下步驟： 1) 獲取帶毒灰飛虱和鑒定標尺：大田采集灰飛虱高齡若蟲并純化篩選，傳代保存，鑒定 前采用RBSDV毒源飼毒1. 5-2. 5齡期灰飛虱若蟲，獲得帶毒灰飛虱；根據(jù)人工接毒鑒定中不 同品種對水稻黑條矮縮病抗性表現(xiàn)設置高抗、中抗、感病三個鑒定標尺，選擇三個相應水稻 品種做為鑒定標尺； 2) 帶毒灰飛虱定量傳毒胚芽鞘：每個品種取15-20粒種子，用0.6%次氯酸鈉溶液浸泡 15min進行滅菌，超純水沖洗干凈，然后放置于25°C條件下適宜濃度的IAA溶液中低氧浸種 培養(yǎng)3天，誘導出胚芽鞘；將胚芽鞘用超純水洗凈，放入鋪有吸水棉的試管中，每個試管一 個種子，定量接種帶毒灰飛虱，用透氣紗布封閉試管后平置，傳毒24h;傳毒后胚芽鞘用超 純水沖洗，然后放置于25°C條件下浸潤了適宜濃度的ABA溶液的吸水棉上暗培養(yǎng)； 3) 熒光定量PCR獲得每個品種周期時間點的RQ值：按照周期時間點取材上一步驟的 胚芽鞘的特定部位，取材2-3重復，提取并純化病毒RNA，熒光定量PCR擴增RBSDV病毒S7 片段，擴增完畢，進入結果分析界面，以你挪05為內參，與對照組相比，獲得每個品種每個 取樣時間點重復的RBSDV病毒S7與內參基因的相對表達量（RQ值）； 4) 繪制RBSDV增殖指數(shù)趨勢線并進行抗性評價：用多重復的RQ值統(tǒng)計每個待測品種 和鑒定標尺飼毒后每個取樣時間點的RQ值均值，然后以RQ值均值為縱坐標，周期取樣時間 點為橫坐標，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，獲得RBSDV增殖指數(shù)趨勢線y=Aek