本發(fā)明屬于生物工程，具體涉及一種基于兩步酶法控制構(gòu)型反轉(zhuǎn)高效制備l-木酮糖的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、l-木酮糖(l-xylulose,cas:527-50-4)又稱l-(+)蘇式-戊酮糖，其在食品、化工和醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要應(yīng)用。如在醫(yī)藥領(lǐng)域中，l-木酮糖不僅作為降血糖藥物的主要成分用于糖尿病的治療，還是抗病毒藥物l-核苷類的重要合成前體，此外，其異構(gòu)化產(chǎn)物l-木糖、l-核糖也可用于抗癌藥物的生產(chǎn)。但是，自然界中的糖基本以d-型為主，l-型的單糖極少，導(dǎo)致通過天然提取獲得l-木酮糖尤為困難。目前l(fā)-木酮糖的合成主要采用化學(xué)合成，但化學(xué)合成存在步驟冗長、能耗大、且伴隨異構(gòu)體污染等問題，致使l-木酮糖最終得率低，市面上供不應(yīng)求，價格也相當(dāng)昂貴。

2、通過生物酶介導(dǎo)的定向催化將天然來源廣泛的d-型糖設(shè)法轉(zhuǎn)化為l-構(gòu)型木酮糖，該過程不僅可以借助酶較強(qiáng)的專一性和高度立體選擇性優(yōu)勢，控制構(gòu)型之間的精確轉(zhuǎn)換以定向、高效合成l-木酮糖，而且符合當(dāng)下綠色合成發(fā)展理念，成為生產(chǎn)手性藥物及中間體頗受青睞的方法。d-木酮糖作為l-木酮糖的對映異構(gòu)體廣泛存在于原核、真核等微生物的戊糖磷酸途徑中，一般經(jīng)由葡萄糖磷酸化后轉(zhuǎn)化而來。但目前關(guān)于如何精確調(diào)控d-木酮糖異構(gòu)化為l-木酮糖還未見報道。因此，需要開發(fā)一種定向催化d-木酮糖轉(zhuǎn)化為l-木酮糖的方法用于專一、高效的合成l-木酮糖。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的一些不足，本發(fā)明提供了一種基于兩步酶法控制構(gòu)型反轉(zhuǎn)高效制備l-木酮糖的方法及其應(yīng)用；本發(fā)明通過體外篩選和催化驗(yàn)證確定了能夠介導(dǎo)d-木酮糖定向轉(zhuǎn)化為l-木酮糖的兩個關(guān)鍵酶2-psxdh和4-paxdh，并且基于兩步酶法構(gòu)建了控制構(gòu)型反轉(zhuǎn)高效制備l-木酮糖的體系，然后利用該體系構(gòu)建了一種基于兩步酶法控制構(gòu)型反轉(zhuǎn)高效制備l-木酮糖的方法，所述方法可以定向調(diào)控構(gòu)型轉(zhuǎn)化來合成l-木酮糖，能有效克服化學(xué)合成中存在的異構(gòu)體污染等問題，極大方便產(chǎn)物后續(xù)分離純化，具有良好的工業(yè)應(yīng)用潛能；本發(fā)明所述l-木酮糖的制備方法簡單，可以用于體外或體內(nèi)催化d-木酮糖轉(zhuǎn)化l-木酮糖，具有很好的實(shí)用性。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)手段：

3、本發(fā)明首先提供了一種基于兩步酶法控制構(gòu)型反轉(zhuǎn)高效制備l-木酮糖的體系，所述體系包括以下任一：

4、(i)木糖醇-2-脫氫酶2-psxdh和木糖醇-4-脫氫酶4-paxdh；

5、(ii)表達(dá)木糖醇-2-脫氫酶2-psxdh的基因工程菌和表達(dá)木糖醇-4-脫氫酶4-paxdh的基因工程菌；

6、(iii)同時表達(dá)木糖醇-2-脫氫酶2-psxdh和木糖醇-4-脫氫酶4-paxdh的基因工程菌。

7、優(yōu)選地，所述體系中，木糖醇-2-脫氫酶2-psxdh來源于pichia?stipitis，編碼木糖醇-2-脫氫酶2-psxdh的核苷酸序列如seq?id?no:1所示；

8、木糖醇-4-脫氫酶4-paxdh來源于pantoea?ananatis，編碼木糖醇-4-脫氫酶4-paxdh的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

9、本發(fā)明還提供了上述體系在轉(zhuǎn)化d-木酮糖制備l-木酮糖中的應(yīng)用。

10、本發(fā)明還提供了一種基于兩步酶法控制構(gòu)型反轉(zhuǎn)高效制備l-木酮糖的方法，所述方法利用上述體系轉(zhuǎn)化d-木酮糖為l-木酮糖。

11、優(yōu)選地，當(dāng)所述體系包括(i)時，所述方法包括：

12、(1)以d-木酮糖為反應(yīng)底物，采用2-psxdh催化d-木酮糖生成木糖醇；

13、(2)以(1)中的木糖醇為反應(yīng)底物，采用4-paxdh催化木糖醇轉(zhuǎn)化為l-木酮糖。

14、優(yōu)選地，步驟(1)中，催化反應(yīng)的體系包括：5mmol/l?nadh、10mmol/l?d-木酮糖、25mmol/l?tris-hcl緩沖液和適量2-psxdh；

15、加入2-psxdh后于30℃、120rpm條件下反應(yīng)12h。

16、優(yōu)選地，步驟(2)中，催化反應(yīng)的體系包括：5mmol/l?nad+、30mmol/l木糖醇、50mmol/l?gly-naoh緩沖液(ph?10)和適量4-paxdh；

17、加入4-paxdh后于30℃、120rpm條件下反應(yīng)8～12h。

18、優(yōu)選地，當(dāng)體系包括(ii)時，所述表達(dá)木糖醇-2-脫氫酶2-psxdh的基因工程菌的構(gòu)建方法包括：

19、擴(kuò)增木糖醇-2-脫氫酶基因psxdh2并將其與酶切線性化的質(zhì)粒載體pet-30a連接，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pet-psxdh2，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，得到表達(dá)木糖醇-2-脫氫酶2-psxdh的基因工程菌；

20、所述表達(dá)木糖醇-4-脫氫酶4-paxdh的基因工程菌的構(gòu)建方法包括：

21、擴(kuò)增木糖醇-4-脫氫酶基因paxdh4并將其與酶切線性化的質(zhì)粒載體pet-30a連接，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pet-paxdh4，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，得到表達(dá)木糖醇-4-脫氫酶4-psxdh的基因工程菌。

22、優(yōu)選地，當(dāng)體系包括(ii)時，所述l-木酮糖的制備方法包括以下任一：

23、(a)將表達(dá)木糖醇-2-脫氫酶2-psxdh的基因工程菌誘導(dǎo)表達(dá)得到2-psxdh，將表達(dá)木糖醇-4-脫氫酶4-paxdh的基因工程菌誘導(dǎo)表達(dá)得到4-paxdh；利用2-psxdh和4-paxdh體外催化d-木酮糖轉(zhuǎn)化為l-木酮糖；

24、(b)將表達(dá)木糖醇-2-脫氫酶2-psxdh的基因工程菌和表達(dá)木糖醇-4-脫氫酶4-paxdh的基因工程菌經(jīng)活化、蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后收集全細(xì)胞，之后將得到的兩種全細(xì)胞按照不同化學(xué)計量配比添加到以d-木酮糖為底物的反應(yīng)體系中進(jìn)行催化反應(yīng)。

25、優(yōu)選地，(b)中，表達(dá)木糖醇-2-脫氫酶2-psxdh的基因工程菌全細(xì)胞和表達(dá)木糖醇-4-脫氫酶4-paxdh的基因工程菌全細(xì)胞的用量比為1～2：2～1。

26、優(yōu)選地，(b)中，所述以d-木酮糖為底物的反應(yīng)體系包括：5mmol/l?nad+、5mmol/lnadh、10mmol/l?d-木酮糖、25mmol/l磷酸鹽緩沖液(ph?7.0)。

27、優(yōu)選地，(b)中，所述催化反應(yīng)的條件包括：于30℃、180rpm條件下反應(yīng)24-36h。

28、優(yōu)選地，當(dāng)體系包括(iii)時，所述l-木酮糖的制備方法包括：

29、以d-木酮糖為底物，誘導(dǎo)同時表達(dá)木糖醇-2-脫氫酶2-psxdh和木糖醇-4-脫氫酶4-paxdh的基因工程菌發(fā)酵得到所述l-木酮糖。

30、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

31、相比現(xiàn)有技術(shù)中化學(xué)合成生產(chǎn)l-木酮糖的方法存在的環(huán)境污染大、能耗大且伴隨各種異構(gòu)體污染，以及獲得高純度的l-木酮糖比較困難、產(chǎn)率低下等問題，本發(fā)明通過生物酶所具有的專一催化特性，可以定向生產(chǎn)無異構(gòu)體污染的l-木酮糖，且整個過程環(huán)境友好、能耗低、l-木酮糖產(chǎn)率也相對較高。

32、本發(fā)明采用基因工程技術(shù)和酶工程思維，巧妙設(shè)計通過兩步簡單的酶催化反應(yīng)，便可將廣泛存在于原核、真核等微生物細(xì)胞中的d-木酮糖定向且高效轉(zhuǎn)化為l-木酮糖，為l-木酮糖的生產(chǎn)提供了一種新策略。

33、本發(fā)明利用生物酶具有的專一性和立體選擇性優(yōu)勢，定向調(diào)控d-木酮糖異構(gòu)化為l-木酮糖，克服了目前l(fā)-木酮糖生產(chǎn)過程中面臨的異構(gòu)體污染問題，極大方便產(chǎn)物后續(xù)分離純化，具有良好的工業(yè)應(yīng)用潛能。

34、本發(fā)明中提出的通過兩步酶控制的構(gòu)型反轉(zhuǎn)可使d-木酮糖轉(zhuǎn)化為l-木酮糖，該思路有助于進(jìn)一步指導(dǎo)在體內(nèi)構(gòu)建l-木酮糖從頭合成路徑，以期通過可持續(xù)發(fā)酵法來規(guī)?；a(chǎn)l-木酮糖。