本發(fā)明屬于蛋白分離純化領(lǐng)域，具體涉及一種長(zhǎng)效重組人促卵泡激素的純化方法。

背景技術(shù)：

1、促卵泡激素(fsh)是一種由腦垂體合成并分泌的內(nèi)源性促性腺激素，調(diào)控著人體的發(fā)育、生長(zhǎng)、青春期性成熟、以及生殖相關(guān)的一系列生理過(guò)程。在女性中，fsh作用于卵巢的顆粒細(xì)胞，其表面有特異性的fsh受體，當(dāng)fsh與顆粒細(xì)胞上的fsh受體結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，在女性排卵激素周期的不同階段，可以促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和成熟，同時(shí)顆粒細(xì)胞可生產(chǎn)雌激素和孕激素兩類(lèi)固醇激素。在男性中，fsh則通過(guò)作用于睪丸支持(sertoli)細(xì)胞(sertoli細(xì)胞)表面有特異性的fsh受體，促進(jìn)睪丸曲細(xì)精管的成熟，調(diào)控精子生成。重組人促卵泡激素(rhfsh)通過(guò)基因重組技術(shù)制備，與天然fsh具有相同的生物學(xué)活性，可模擬fsh的體內(nèi)的fsh功能，進(jìn)而可用于輔助生殖周期治療中的超促排卵及男性不育中促進(jìn)精子生成等臨床應(yīng)用。

2、已有的rhfsh產(chǎn)品主要包括短效fsh和長(zhǎng)效fsh(也即rhfsh-ctp)，其由于ctp序列的引入，在體內(nèi)半衰期較rhfsh明顯延長(zhǎng)，注射一針推薦劑量的rhfsh-ctp可以代替連續(xù)7d每天注射rhfsh。無(wú)論是在輔助生殖周期中用于女性超促排卵或是男性特發(fā)性性腺功能減退癥，均能夠顯著降低給藥頻率，提高患者的用藥依從性。

3、與rhfsh類(lèi)似，rhfsh-ctp產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)需在下游純化環(huán)節(jié)中盡量以簡(jiǎn)單便捷、性價(jià)比高的純化工藝除去雜質(zhì)，減少蛋白的解離降解，提高蛋白純度和純化收率，以達(dá)到規(guī)模化生產(chǎn)的質(zhì)量控制和成本控制需求?，F(xiàn)有技術(shù)中，劉曉航報(bào)道了通過(guò)染料親和層析、deae陰離子交換層析以及疏水層析三步層析制備fsh-ctp，所得fsh-ctp樣品純度可達(dá)98％，但收率僅約為20％，且整個(gè)純化工藝繁雜，層析步驟之間需要對(duì)樣品進(jìn)行額外處理(劉曉航,高麗婷.重組人長(zhǎng)效促卵泡激素fsh-ctp的純化工藝研究及鑒定[j].生物技術(shù)進(jìn)展,2016,6(3):219～223)。申請(qǐng)人在前期申請(qǐng)(cn116143901b)中公開(kāi)了通過(guò)親和層析，低ph孵育去病毒后，再進(jìn)行復(fù)合陰離子交換層析進(jìn)行rhfsh-ctp樣品的純化，所得rhfsh-ctp純度可達(dá)99.8％，且收率可達(dá)96％，但該方法依賴(lài)于在親和層析步驟引入專(zhuān)為純化fsh而設(shè)計(jì)的親和層析填料(capture?select?follicle?stimulating?hormone(fsh)affinity?matrix)，該填料是通過(guò)賽默飛公司特有的capture?select技術(shù)，基于專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的能夠特異性結(jié)合fsh分子的羊駝抗體片段(vhh片段)制成，通過(guò)與fsh的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)了純化效率的提高，但該填料價(jià)格十分昂貴13,983.00元/5ml(來(lái)源：賽默飛官網(wǎng))；且耐壓性差，易碎，層析介質(zhì)不耐堿，不利于生產(chǎn)中清潔消毒，這就可能導(dǎo)致純化樣品微生物負(fù)荷和細(xì)菌內(nèi)毒素超標(biāo)，還可能造成批間交叉污染或共線產(chǎn)品間交叉污染，增加了整體工藝的質(zhì)控風(fēng)險(xiǎn)和成本；且該填料柱循環(huán)50次左右就會(huì)出現(xiàn)有大量碎膠，后期層析柱很難裝填合格。此外，純化過(guò)程還需對(duì)該填料脫落配基進(jìn)行持續(xù)檢測(cè)和控制。

4、在此基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)一種兼具質(zhì)量控制需求和成本控制需求的，工藝步驟少且操作簡(jiǎn)便，既能保持高收率又能保證高純度的fsh-ctp純化方法是非常有需求和價(jià)值的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種長(zhǎng)效重組人促卵泡激素(fsh-ctp)的純化方法，具體而言，本發(fā)明涉及一種通過(guò)染料親和層析和疏水層析2步實(shí)現(xiàn)fsh-ctp純化的方法，并在2步層析步驟之間特定搭配去污劑病毒滅活工藝。

2、本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明想要解決的技術(shù)問(wèn)題。

3、本發(fā)明提供了一種長(zhǎng)效重組人促卵泡激素純化方法，所述純化方法包括以下步驟：

4、(1)染料親和層析

5、(2)疏水層析

6、所述步驟(1)染料親和層析和步驟(2)疏水層析之間還包括病毒滅活步驟，所述病毒滅活步驟為利用去污劑進(jìn)行病毒滅活。

7、在某些具體實(shí)施方式中，所述染料親和層析是將細(xì)胞培養(yǎng)液上樣于diamond?blue為填料的層析柱，用含鹽的tris溶液進(jìn)行洗脫。

8、在某些具體實(shí)施方式中，所述染料親和層析中含鹽的tris溶液的中所含鹽為nacl、kcl或mgcl2，優(yōu)選為nacl；所含鹽的濃度為1.0m～3.0m，優(yōu)選為2.0m；所述tris溶液中tris濃度為10mm～50mm，通過(guò)加入酸成分形成ph緩沖體系，所述酸成分選自hac或hcl。

9、在某些具體實(shí)施例中，所述染料親和層析洗脫液還包含異丙醇；所述異丙醇的體積濃度為5％～30％，優(yōu)選為5％～20％，更優(yōu)選為10％。

10、在某些具體實(shí)施例中，所述染料親和層析洗脫液的ph為6～8。

11、在某些具體實(shí)施例中，所述染料親和層析洗脫條件為：使用含nacl的tris-hac溶液進(jìn)行洗脫，所述nacl的濃度為2.0m，所述tris-hac溶液中tris濃度為10mm～50mm；所述染料親和層析洗脫液還包含體積濃度為10％異丙醇；所述染料親和層析洗脫液的ph為7.2±0.2。

12、在某些具體實(shí)施例中，所述病毒滅活使用的去污劑選自吐溫80或triton?x-100。

13、在某些具體實(shí)施例中，所述病毒滅活為使用1％吐溫80進(jìn)行孵育；所述孵育的時(shí)間為4～8h，優(yōu)選為6h。

14、在某些具體實(shí)施例中，所述疏水層析是將病毒滅活液上樣于generik?mc60-hicphenyl為填料的層析柱，用tris溶液進(jìn)行洗脫；所述tris溶液濃度中tris濃度為5mm～20mm，通過(guò)加入酸成分形成ph緩沖體系，所述酸成分選自hac或hcl。

15、在某些具體實(shí)施例中，所述疏水層析洗脫液的ph為6～8。

16、在某些具體實(shí)施例中，所述疏水層析洗脫條件為：使用tris-hac溶液進(jìn)行洗脫，所述tris-hac溶液中tris濃度為5mm～20mm，優(yōu)選為tris濃度為5mm；所述疏水層析洗脫液的ph為7.2±0.2。

17、相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：

18、1、僅通過(guò)兩步層析并配合特定的病毒滅活方式，在簡(jiǎn)化層析步驟的前提下fsh-ctp的收率97％左右，純度達(dá)到99.9％，純化液幾乎不含有解離亞基、工藝雜質(zhì)含量低；

19、2、層析步驟之間不需要進(jìn)行超濾換液、稀釋除鹽等額外的樣品處理步驟，就可以獲得符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的fsh-ctp，使用性價(jià)比更高的染料親和層析填料，同時(shí)還簡(jiǎn)化了純化過(guò)程，節(jié)省成本，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。

20、3、發(fā)明人從蛋白純化常見(jiàn)的純化工藝中，特意選擇染料親和層析和疏水層析組合，并配合去污劑進(jìn)行病毒滅活步驟，在這樣特定組合的純化方式及純化條件內(nèi)，驚喜發(fā)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了fsh-ctp優(yōu)異的純化效果(fsh-ctp的收率97％左右，純度達(dá)到99.9％，純化液幾乎不含有解離亞基、工藝雜質(zhì)含量低)，這樣優(yōu)異的效果是現(xiàn)有技術(shù)中未曾報(bào)道的，也是超出本領(lǐng)域技術(shù)人員的預(yù)期。