本發(fā)明涉及大口黑鱸虹彩病毒檢測，具體涉及一種pfago蛋白介導(dǎo)的大口黑鱸虹彩病毒核酸檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

1、大口黑鱸是非常有代表性且發(fā)展空間巨大的特色淡水魚之一，隨著大口黑鱸人工繁殖和育苗技術(shù)的成功，大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)得到較快發(fā)展，我國大口黑鱸年養(yǎng)殖產(chǎn)量已突破70萬噸，與此同時病害問題也日益嚴重。大口黑鱸病害主要有病毒病、細菌病和寄生蟲病。其中，病毒病流行快、發(fā)病率高，并且目前尚無有效控制措施，嚴重影響大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。在病毒性疫病中，大口黑鱸虹彩病毒(largemouthbass?ranavirus，lmbv)最重要的病原之一。lmbv是大口黑鱸養(yǎng)成過程中最重要的病毒性病原，是一種胞質(zhì)型雙鏈dna病毒，主要感染仔魚和幼魚，死亡率超過80％。目前對于大口黑鱸虹彩病毒尚缺乏有效的治療方法和防控措施，早期檢測和診斷是預(yù)防該病爆發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，開發(fā)新的病毒檢測技術(shù)具有重要應(yīng)用價值。

2、目前大口黑鱸感染lmbv的主要診斷方法有臨床癥狀診斷、病毒分離培養(yǎng)、電鏡檢測、免疫學(xué)檢測以及核酸檢測。目前核酸檢測主要以rt-qpcr為主，但是面臨著設(shè)計復(fù)雜、操作繁瑣和儀器昂貴的問題。近年來，隨著以crispr/cas9為代表的新型基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)并廣泛應(yīng)用于病原微生物等的檢測，使得傳統(tǒng)分子診斷技術(shù)邁入了低成本、高靈敏性、高特異性的新型分子診斷階段。其中，用于lmbv病毒的新型檢測系統(tǒng)raa-crispr/cas13法也已成功建立，但該方法需要先進行重組酶輔助擴增(raa)擴增，然后再利用crispr/cas13a進行檢測，其檢測靈敏度達到3.1×101copies/ul，這表明基于新型基因編輯酶crispr/cas系統(tǒng)的分子診斷方法在b19病毒檢測過程中具有潛在的應(yīng)用前景。但是，鑒于crispr/cas系統(tǒng)中g(shù)rna的合成費用昂貴、靈敏度仍有待提升的問題，開發(fā)新的分子診斷方法具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的crispr/cas系統(tǒng)中g(shù)rna的合成費用昂貴、靈敏度仍有待提升的問題，提供一種pfago蛋白介導(dǎo)的大口黑鱸虹彩病毒核酸檢測試劑盒及其檢測方法。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供一種大口黑鱸虹彩病毒核酸檢測試劑盒，該試劑盒包含pfago蛋白、擴增引物對、gdna和分子信標(biāo)；

3、其中，所述gdna包含序列如seq?id?no:7所示的g6和序列如seq?id?no:19所示的g6-1；

4、所述擴增引物對為序列如seq?id?no:21～22所示的引物對或seq?id?no:23～24所示的引物對；

5、所述分子信標(biāo)的序列如seq?id?no:66所示。

6、本發(fā)明第二方面提供一種pfago蛋白介導(dǎo)的lmbv病毒核酸檢測方法，該方法包括以下步驟：

7、(1)使用seq?id?no:21～22所示的引物對或seq?id?no:23～24所示的引物對對待測樣品擴增得到tdna；

8、(2)構(gòu)建包含5’磷酸化的gdna、pfago蛋白、所述tdna、pfago反應(yīng)緩沖液和分子信標(biāo)的反應(yīng)體系，然后進行切割反應(yīng)；

9、(3)反應(yīng)結(jié)束后，對上述反應(yīng)體系進行熒光檢測；

10、所述gdna包含序列如seq?id?no:7所示的g6和序列如seq?id?no:19所示的g6-1；

11、所述分子信標(biāo)的序列如seq?id?no:66所示。

12、本發(fā)明第三方面提供了如上所述的試劑盒在鑒定或輔助鑒定lmbv病毒中的應(yīng)用。

13、本發(fā)明提供的pfago蛋白介導(dǎo)的大口黑鱸虹彩病毒檢測試劑盒，含有經(jīng)篩選和優(yōu)化得到的gdna(向?qū)na)，相比于cas13a系統(tǒng)的向?qū)na，該向?qū)sdna不僅能方便、穩(wěn)定的獲得，而且具有成本優(yōu)勢；同時，通過選用特定序列的gdna，不僅增加了檢測的靈敏度，也減少了實驗過程中g(shù)dna的用量，更降低減少了實驗過程中必要的5’磷酸化反應(yīng)程序，從而降低檢測的成本，減少費時費力的繁雜過程。

14、本發(fā)明提供的基于上述試劑盒的檢測方法，與pcr技術(shù)聯(lián)用后，待檢測的lmbv低至1.0copy/μl時仍能被檢測到，其檢測靈敏度超過了raa-crispr/cas13法。

技術(shù)特征：

1.一種pfago蛋白介導(dǎo)的大口黑鱸虹彩病毒核酸檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含pfago蛋白、擴增引物對、gdna和分子信標(biāo)；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述分子信標(biāo)帶有熒光基團和猝滅基團。

3.一種pfago蛋白介導(dǎo)的lmbv病毒核酸檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述pfago反應(yīng)緩沖液包含hepes、氯化鈉和氯化錳。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系中，使用的是10×pfago反應(yīng)緩沖液，其中，所述pfago反應(yīng)緩沖液包含：150～250mm?hepes，2～3m氯化鈉和20～30mm氯化錳。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述pfago反應(yīng)緩沖液中，hepes的ph為7.5～8.5。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，切割反應(yīng)的條件包括：溫度為93～98℃，時間為20～40min。

8.權(quán)利要求1或2所述的試劑盒在鑒定或輔助鑒定lmbv病毒中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及大口黑鱸虹彩病毒技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種PfAgo蛋白介導(dǎo)的大口黑鱸虹彩病毒核酸檢測試劑盒及其檢測方法，該試劑盒包含PfAgo蛋白、擴增引物對、gDNA和分子信標(biāo)；gDNA包含序列如SEQ?ID?NO:7所示的g6和序列如SEQ?ID?NO:19所示的g6?1；擴增引物對為序列如SEQ?ID?NO:21～22所示的引物對或SEQ?ID?NO:23～24所示的引物對；分子信標(biāo)的序列如SEQ?ID?NO:66所示。本發(fā)明提供的大口黑鱸虹彩病毒檢測試劑盒，含有經(jīng)篩選和優(yōu)化得到的gDNA，相比于Cas13a系統(tǒng)的向?qū)NA，該向?qū)sDNA不僅能方便、穩(wěn)定的獲得，而且具有成本優(yōu)勢；同時，通過選用特定序列的gDNA，不僅增加了檢測的靈敏度，也減少了實驗過程中g(shù)DNA的用量，更減少了實驗過程中必要的5’磷酸化反應(yīng)程序，從而降低檢測的成本，減少費時費力的繁雜過程。

技術(shù)研發(fā)人員：何如怡,張楷文,張辰辰,何彎彎,劉志國,李玥佳
受保護的技術(shù)使用者：武漢輕工大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/28