專利名稱::熱穩(wěn)定性提高的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活化酶及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明主要涉及提高在升溫條件下生長的植物的光合作用水平。更具體的說,本發(fā)明涉及提高光合酶即Rubisco活化酶的熱穩(wěn)定性。
背景技術(shù):
:核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶/力口氧酶(Rubisco)是光合作用過程中的一種重要的酶。這種酶在光合作用過程中將C02摻入到植物中。大氣氧與C02竟爭作為Rubisco的底物,引起光呼吸作用,使Rubisco成為光合作用中的限速步驟。Rubisco活化酶(RCA)是一種催化Rubisco的活化的蛋白質(zhì),而Rubisco的活化又通過弓j發(fā)光合碳還原和光呼吸碳氧化來調(diào)節(jié)光合作用。Rubisco活化酶催化核酮糖-l,5-二磷酸(RuBP)從Rubisco的釋放。Rubisco上的新未占據(jù)部位現(xiàn)在就空著可結(jié)合C02和Mg、舌化劑以使光合作用進行。Rubisco光合酶還負責從Rubisco釋放糖-磷酸抑制劑,從而恢復(fù)Rubisco催化活性。因此,如果Rubisco活化酶受損,Rubisco保持無活性,光合作用減慢。Rubisco活化酶對熱不穩(wěn)定,因此隨著溫度的升高其活性降低。結(jié)果,光合作用過程由于Rubisco活化的缺乏而減慢。Rubisco活化酶在升溫條件下會變性,從而使它不能將無活性Rubisco轉(zhuǎn)化成活性形式。擬南芥G4ra&Vfo/w/力含有兩種RCA同種型(isoform)-^豆的熱不穩(wěn)定性同種型(RCA1)和長的相對熱穩(wěn)定性同種型(RCA2),它們由pre-mRNA的交替剪接產(chǎn)生(Werneke等,1989,P/a"fCe〃1:815-825)。在高溫氣候中生長的作物檔j朱會得益于光合作用水平的提高。因此,如果能使光合作用中的限速步驟更耐熱,作物植林會更容易地在這些氣候中生長。發(fā)明概述本發(fā)明涉及比天然Rubisco活化酶更具熱穩(wěn)定性的Rubisco活化酶衍生多肽。本發(fā)明的Rubisco活化酶衍生多肽在生長在升溫條件下的植物中很大程度上(substantially)保持著活性。本發(fā)明還涵蓋編碼本發(fā)明多肽的核酸分子。除了本發(fā)明的Rubisco活化酶4汙生多肽外,還應(yīng)認識到本發(fā)明還涵蓋該多肽的變體,包括但不限于該多肽的任何很大程度上相似的序列、任何片段、類似物、同源物、突變體或修飾多肽。本發(fā)明所涵蓋的變體在升溫條件下至少部分上具有功能活性(即它們能夠顯示野生型Rubisco活化酶的一種或多種已知功能活性)。本發(fā)明還涵蓋編碼變體多肽的核酸分子。本發(fā)明還涵蓋包含一種或多種本發(fā)明核酸的載體。本發(fā)明還涵蓋包含本發(fā)明的多肽、核酸分子和/或載體的細胞。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多肽、核酸分子和/或載體的轉(zhuǎn)基因植物。該轉(zhuǎn)基因植物能以本領(lǐng)域公知的任何方式表達轉(zhuǎn)基因,所述方式包括但不限于組成型表達、發(fā)育調(diào)節(jié)表達、組織特異性表達等。本發(fā)明還涵蓋從本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物獲得的種子。附圖簡述圖1A-1C:野生型RCA(RCA1)和熱穩(wěn)定性變體(183H12、301C7和382D8)的表征。(A)在25。C(白色)、40。C(灰色)和45。C(黑色)下處理后被活化酶活化之后的Rubisco活性?;罨傅鞍自谥付囟认聹赜?5分鐘后,于25。C下進行測定。(B)Rubisco在25。C(白色)和40。C(灰色)的催化條件下的活化。(C)在指定溫度下溫育15分鐘后于25。C下進行測定的活化酶蛋白的ATP酶活性。圖2A-2D:Rubisco活化酶突變林(zlrca)在環(huán)境C02下的表征。(A)擬南芥野生型(iC4/iG4)、雜合(iC4/zJ"fl)和純合(Aca/z^ca)植抹的葉子的免疫印跡分析。印跡用抗重組擬南芥RCA1多克隆抗體進行免疫裝飾(immunodecorated)。(B)用熒光圖像分析測出的三周齡野生型(上)和Jrca(下)植林的光合作用性能。(C)(B)所述的植抹(每種表現(xiàn)型50林植林)在指定周齡下的葉子面積。(D)八周齡野生型(上)和(下)植抹的照片。圖3A-3C:z/rca突變林的分子表征。(A)野生型(AC4)和缺失型(z^ca)等位基因的示意圖。各數(shù)字表示各RCA外顯子。標示了用以擴增7C4及zJm等位基因的1.4kbPCR產(chǎn)物的正向和反向引物,分別為RCAf和RCAr及rcaf和rcar。(B)表達183H12的Tl植林的PCR分析(RCA引物-上小圖;rca引物-下小圖)。標示了株系編號(上方)和遺傳背景(下方)。(C)(B)中所述各株系的葉子的總蛋白質(zhì)(5jig/泳道)的蛋白質(zhì)印跡分析。印跡用抗重組RCA1多克隆抗體進行#:測。圖4A-4D:表達RCA1和熱穩(wěn)定性變體183H12、301C7和382D8的各zl"a突變林在正常生長條件下(22。C)的功能互補。各數(shù)字表示各獨立轉(zhuǎn)化事件的抹系標號。(A)三周齡葉子的總蛋白質(zhì)的免疫印跡分熒光圖像分析監(jiān)測出的上述各植林(8-10林植抹/獨立林系)的光合作用性能。(D)暫時(l小時)適度熱應(yīng)激處理對表達RCA1和熱穩(wěn)定性變體的Aca轉(zhuǎn)基因林系的光合作用速度的影響。每種株系四株獨立植林的凈光合作用是用紅外氣體分析4義在22。C(白色)和30。C(灰色)下進行監(jiān)測。圖5A-5F:適度熱應(yīng)激(每天30。C處理4小時)對表達RCA1或熱穩(wěn)定性變體1S3H12、301C7和382D8的野生型植林和zlrca突變林的影響。(A)各植抹的照片顯示RCA變體介導(dǎo)的差異生長速度。(B)用熒光圖像分析系統(tǒng)分析出的每抹系8-10抹獨立植抹的葉子面積。平均數(shù)后帶相同字母者為采用保護最小顯著差數(shù)法(LSD)沒有達到顯著性差異(P-0.05)。(C)在30°C下2小時后通過氣體交換分析監(jiān)測出的各選定林系的四抹獨立植株的凈光合作用。(D)(C)中所述的成熟植林(8周齡)的照片。(E)每抹植林的長角果數(shù)量。每個抹系分析了8-10林獨立植林。(F)從選定林系(每個抹系5株獨立植抹)收獲的種子的種子重量/1000顆種子。圖6A-6D:26。C熱應(yīng)激對表達RCA1和熱穩(wěn)定性變體183H12的野生型植株和Aca突變抹系的發(fā)育和產(chǎn)量的影響。(A)每林植抹的長角果數(shù)量。每個林系分析了1(M2林獨立植林。(B)在指定溫度下生長的各選定林系的長角果的照片,顯示了長角果大小和結(jié)實率的變化。棒條=0.5cm。(C)(A)中描述的各植林收獲的種子的種子重量/1000顆種子。(D)在22°C(白色)或26°C(灰色)下生長的擬南芥各植林收獲的種子(每個抹系250顆種子)的發(fā)芽率(22。C)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供衍自Rubisco活化酶的多肽。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明多肽的核酸分子。本發(fā)明還涵蓋使用本發(fā)明多肽和核酸來提高植物的耐熱性的方法,所述方法包括增強Rubisco活化酶的熱穩(wěn)定性。本發(fā)明的多肽本發(fā)明涉及比天然Rubisco活化酶更具熱穩(wěn)定性的Rubisco活化酶衍生多肽。在優(yōu)選的實施方案中,Rubisco活化酶衍生多肽是SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20和22中的任一個。本發(fā)明的多肽還涵蓋由任何本發(fā)明Rubisco活化酶衍生核酸編碼的那些多肽。除了本發(fā)明的Rubisco活化酶衍生多肽外,還應(yīng)認識到本發(fā)明還涵蓋該多肽的變體,包括但不限于該多肽的任何很大程度上相似的序列、任何融合多肽、任何片段、類似物、同源物、突變體或修飾多肽。本發(fā)明所涵蓋的變體在升溫條件下至少部分上具有功能活性(即它們能夠顯示野生型Rubisco活化酶的一種或多種已知功能活性)。這種功能活性包括4旦不限于生物活性,如對Rubisco的活化;抗原性,即結(jié)合或者與野生型Rubisco活化酶(包括但不限于SEQIDNO:2)竟爭結(jié)合抗Rubisco活化酶抗體的能力;免疫原性,即產(chǎn)生能結(jié)合野生型Rubisco活化酶多肽的抗體的能力。在優(yōu)選的實施方案中,變體具有至少一種很大程度上類似于或優(yōu)于其親本多肽(即未改變的Rubisco活化酶衍生多肽)的功能活性。正如本文所用的那樣,變體的功能活性如果在親本多肽的一個標準偏差之內(nèi),則認為變體"很大程度上類似于"親本多肽。在一個實施方案中,本發(fā)明涵蓋這樣的多肽,其在升溫條件下具有Rubisco活化酶的至少一種功能活性(例如Rubisco活化),且與SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20和22中的任一個的多肽序列有至少85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性。在具體的實施方案中,本發(fā)明的這種多肽當其序列與SEQIDNO:2進行最佳比對時,在對應(yīng)于SEQIDNO:2的殘基42、130、131、168、257、274、293和310的位置中有一個以上、兩個以上、五個以上或者七個以上位置發(fā)生改變。就與參考序列進行最佳比對的氨基酸序列來說,某個氨基酸"對應(yīng)于"參考序列中的與該殘基在比對中配對的那個位置。正如本文所用的那樣,在將某序列定義為與參考序列有"至少X%同一性"的情況中,例如"某多肽與SEQIDNO:4有至少95%同一性",應(yīng)認識到"X。/。同一性"是指絕對同一性百分數(shù),除非另有指明。術(shù)語"絕對同一性百分數(shù)"是指這樣測出的序列同一性百分數(shù):將完全相同的氨基酸或核酸(nucleicacid)計為1分,將任何置換計為0分,而不管錯配氨基酸或核酸的相似性如何。在典型的序列比對中,兩個序列的"絕對同一性百分數(shù)"以氨基酸或核酸"同一性"的百分數(shù)表示。在兩個序列的最佳比對操作需要在其中一個序列或同時在兩個序列插入空隙的情況中,出于測定同一性百分數(shù)的目的,將一個序列中與另一個序列中的空隙配對的氨基酸殘基認為是錯配??障犊梢允莾?nèi)部空隙,或者是外部空隙,即截短??衫缡褂肅lustalW程序(版本1.8,1999年6月)以默認參數(shù)容易地測定出絕對同一性百分數(shù)(Thompson等,1994,iVwcZ&cJc/A及e腦rc/22:4673-4680)。在另一個實施方案中,本發(fā)明涵蓋包含Rubisco活化酶衍生多肽或其變體的融合多肽。在一個具體的實施方案中,將某個肽(如美國專利申請系列號11/150,054中公開的那些肽)力口到本發(fā)明的多肽上,據(jù)此該肽指導(dǎo)其所連接的多肽定位到植物質(zhì)體(plalstid)或植物光合作用器官。在另一個實施方案中,本發(fā)明涵蓋Rubisco活化酶衍生多肽的片段。本發(fā)明涵蓋這樣的多肽,其在升溫條件下具有Rubisco活化酶的至少一種功能活性(例如Rubisco活化),且是SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20和22中的任一個的長度中的至少25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375或380個連續(xù)氨基酸。在優(yōu)選的實施方案中,編碼多肽片段的多核苷酸能在嚴格條件下與編碼SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20和22中的任一個的核酸雜交。在一個具體的實施方案中,本發(fā)明的片段對應(yīng)于Rubisco活化酶的某功能域,包括但不限于ATP結(jié)合域和底物相互作用域(參見例如Li爭,(2005)/歷o/C7zem280:24864-24869;Salvucci等,(1994)所oc/7簡.考33:14879-14886和vandeLoo等,(1996)腸cA麵.勿35:8143-8148)。在另一個實施方案中,本發(fā)明涵蓋多肽類似物。多肽類似物可具有已被修飾的殘基,即通過將任何類型的分子共價連接到Rubisco活化酶^[汙生多肽進行修飾。本發(fā)明的多肽類似物可例如但不限于通過糖基化、乙?;EG化、磷酸化、酰胺化、已知保護/封閉基團的衍生化、蛋白水解切割、與細胞配體或其它蛋白質(zhì)的連接等進行修飾。本發(fā)明的多肽類似物可用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)通過化學(xué)修飾加以修飾,所述技術(shù)包括但不限于特異性化學(xué)切割、乙酰化、甲?;⒁旅顾氐拇x合成等。此外,本發(fā)明的多肽的類似物可含有一個以上非典型氨基酸。在本發(fā)明的另一個實施方案中,Rubisco活化酶衍生多肽不是SEQIDNO:2。在本發(fā)明的又一個實施方案中,Rubisco活化酶衍生多肽不是天然野生型多肽。本發(fā)明還提供例如通過重組手段產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法。本發(fā)明的核酸分子本發(fā)明還涉及編碼Rubisco活化酶衍生多肽的核酸分子。在優(yōu)選的實施方案中,Rubisco活化酶衍生核酸分子是SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19和21中的任一個。本發(fā)明的核酸分子還涵蓋編碼本發(fā)明的任何Rubisco活化酶衍生多肽的那些核酸分子。除了編碼Rubisco活化酶衍生多肽的核酸分子外,應(yīng)認識到本發(fā)明的核酸分子還涵蓋編碼Rubisco活化酶衍生多肽的變體多肽的那些核酸分子,所述變體包括但不限于Rubisco活化酶衍生多肽的任何很大程度上類似的序列、任何融合多肽、任何片段、類似物、同源物、突變體或修飾多肽。本發(fā)明所涵蓋的核酸分子變體編碼這樣的多肽,其在升溫條件下至少部分上具有功能活性(即它們能夠顯示野生型Rubisco活化酶的一種或多種已知功能活性)。在一個實施方案中,本發(fā)明涵蓋這樣的核酸分子,其與SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19和21的核酸分子中的任一個有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性。在具體的實施方案中,本發(fā)明的這種核酸分子編碼這樣的多肽,其核香酸序列當與SEQIDNO:2進行最佳比對時,在對應(yīng)于SEQIDNO:2的殘基42、130、131、168、257、274、293和310的位置中有一個以上、兩個以上、五個以上或者七個以上位置發(fā)生改變。為測定兩個核酸分子的同一性百分數(shù),將兩序列出于最佳比較目的進行比對(例如,可在第一核酸分子的序列中引入空隙,以^更與第二核酸分子進行最佳比對)。然后對相應(yīng)核苷酸位置處的核苷酸進行比較。當?shù)谝恍蛄兄械哪硞€位置被與第二序列中的相應(yīng)位置的核苷酸相同的核苷酸占據(jù)時,則兩個分子在該位置是相同的。兩個序列之間的同一性百分數(shù)是這兩個序列所共有的相同位置數(shù)的函數(shù)(即°/。同一性=相同重疊位置數(shù)/總位置數(shù)X100%)。在一個實施方案中,兩個序列長度相同。兩個序列之間的同一性百分數(shù)的測定也可用數(shù)學(xué)算法來完成。用于兩個序列的比較的數(shù)學(xué)算法的一個非限制性實例,是Karlin和Altschul的算法(Karlin和Altschul,(1990)iVoc.淑/.v4cad87:2264-2268,在Karlin和Altschul,(1993)尸rac.扁.<SW.卯:5873-5877中作了修正)。這種算法被并入到NBLAST和XBLAST程序中(Altschul等,(1990)JMo/.B/o/.215:403和Altschul爭,(1997)iVwc/e/c^cW/as.25:3389-3402)。用以進行BLAST分析的軟件是可公開獲得的,例如通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)獲得。該算法涉及到首先通過鑒定查詢序列(querys叫uence)中的長度W的短字(shortword)來鑒定高分序列對(highscoringsequencepair,HSP),所述短字當與數(shù)據(jù)庫序列中的相同長度的字比對時匹配或滿足某一正閾值(positive-valuedthresholdscore)T。T稱為鄰近字閾值(Altschul等,同上)。這些初始鄰近字命中(heighborhoodwordhit)充當用以啟動查找含有它們的更長HSP的搜索的種子。然后將字命中沿每個序列向兩個方向延伸至累積比對分數(shù)(cumulativealignmentscore)能得到最大程度的增加。累積分數(shù)的計算,對于核苷酸序列是使用參數(shù)M(—對匹配殘基的獎分;總是>O)和N(錯配殘基的罰分;總是<0)。對于多肽,使用記分矩陣(scoringmatrix)來計算累積分數(shù)。字命中在每個方向上的延伸當出現(xiàn)以下情況時中斷:累積比對分數(shù)偏離其最大實現(xiàn)值(maximumachievedvalue)達數(shù)值X;累積分數(shù)因一個以上負分殘基比對的累積而變?yōu)?或0以下;或者達到了任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTO程序(對于核苷酸序列)使用字長(W)11、期望值(E)10、截斷值100、M=5、N-4和兩條鏈的比較作為默認設(shè)定。對于多肽,BLASTP程序使用字長(W)3、期望值(E)10和BLOSUM62記分矩陣作為默認設(shè)定(參見Henikoff&Henikoff,(1989)/mS89:匪5)。也可使用ClustalV比對方法來確定同一性百分數(shù)(Higgins和Sharp,(1989)CL4S/OS5:151-153),該方法存在于LASERGENE生物信息學(xué)計算包(bioinformaticscomputingsuite)(DNASTARInc.,Madison,WI)的Megalign程序中。"默認參數(shù)"是程序生產(chǎn)商預(yù)設(shè)定的參數(shù),對于多序列比對來說它們對應(yīng)于空隙罰分(GAPPENALTY)=10和空隙長度罰分(GAPLENGTHPENALTY)-10,而對于雙序列比對來說它們是KTUPLE1、空隙罰分=3、WINDOW=5和DIAGONALSSAVED=5。使用ClustalV程序進行了序列的比對后,查看該程序上的"序列距離(sequencedistance),,表格,可以獲得"同一性百分數(shù),,。兩個序列之間的同一性百分數(shù)可用與上述技術(shù)類似的技術(shù),在允許或不允許空隙下進行測定。在計算同一性百分數(shù)時,通常只對精確匹配進行計凄t。在另一個實施方案中,本發(fā)明涵蓋Rubisco活化酶衍生核酸分子的片段。本發(fā)明涵蓋這樣的核酸分子,其在升溫條件下具有Rubisco活化酶的至少一種功能活性(例如Rubisco活化),且是SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19和21中的任一個的長度中的至少100、250、500、750、950、1000或1100個連續(xù)核苷酸。在一個具體的實施方案中,本發(fā)明的片|殳對應(yīng)于編碼Rubisco活化酶的功能域的核酸分子,所述功能域包括但不限于ATP結(jié)合域和底物相互作用域(參見例如Li等,(2005)J歷o/Ozem280:24864-24869;Salvucci等,(1994)腸c/z簡勿33:14879-14886和徵deLoo等,(1996)腸c/z麵'勿35:8143-8148)。在另一個實施方案中,本發(fā)明涵蓋能在嚴格條件下與SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19和21中的任一個雜交的核酸分子。詞語"嚴格條件"是指某核酸會與通常存在于核酸的復(fù)雜混合物中的其靶核酸雜交、而基本上不會與其它核酸雜交的條件。嚴格條件具有序列依賴性,在不同情況下將會不同。較長的核酸尤其要在較高溫度下雜交。本領(lǐng)域有關(guān)于核酸雜交的詳盡指導(dǎo)(例如Tijssen,TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology—HybridizationwithNucldcProbes,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993))。通常,高嚴格條件選定為比特定核酸在確定的離子強度pH下的熱熔點(TJ低約5-10°C。低嚴格條件通常選定為比Tm低約15-30。C。Tm是50%的靶核酸互補探針與靶核酸處于雜交平衡時的溫度(在確定的離子強度、pH和核酸濃度下)(由于靶核酸過量存在,在Tm下有50%的探針處于占據(jù)平衡中)。雜交條件通常是這樣的條件在pH7.0-8.3下鹽濃度小于約1.0M鈉離子濃度、通常為約0.01-1.0M鈉離子濃度(或其它鹽),溫度對于短探針(例如10-50個核苷酸)為至少約30。C,對于長探針(例如大于50個核苷酸)為至少約60。C。嚴格條件也可通過添加去穩(wěn)定劑如曱酰胺來實現(xiàn)。對于選擇性或特異性雜交,陽性信號至少兩倍于背景雜交,優(yōu)選10倍于背景雜交。詞語"特異性雜交"是指當特定的核苷酸序列存在于復(fù)雜混合物(例如總細胞或文庫DNA或RNA)中時,某分子在嚴格雜交條件下只與該序列發(fā)生結(jié)合、雙鏈化或雜交。在本發(fā)明的另一個實施方案中,Rubisco活化酶書t生核酸分子不是SEQIDNO:1。在本發(fā)明的又一個實施方案中,Rubisco活化酶衍生核酸分子不是天然野生型核酸分子。本發(fā)明還涵蓋包含本發(fā)明核酸分子的載體。本發(fā)明還涵蓋包含本發(fā)明載體的細胞或植物。術(shù)語"核酸分子,,在本文中是指從5,末端向3'末端閱讀的、脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基組成的單鏈或雙鏈聚合物。它包括染色體DNA、自我復(fù)制質(zhì)粒和主要執(zhí)行結(jié)構(gòu)作用的DNA或RNA。Rubisco活4H酶書于生序列本發(fā)明的Rubisco活化酶衍生多肽和核酸分子可通過向野生型(wt)Rubisco活化酶(包括但不限于擬南芥Rubisco活化酶(SEQIDNO:2))中引入一個以上殘基置換、添加和/或缺失來產(chǎn)生。通常,產(chǎn)生Rubisco活化酶衍生多肽,以將野生型Rubisco活化酶多肽的適宜特性加強,或者將不適宜的特性減少。在一個實施方案中,Rubisco活化酶衍生多肽的熱穩(wěn)定性比野生型Rubisco活化酶有提高。在另一個實施方案中,Rubisco活化酶衍生多肽在升溫條件(例如40。C)下的酶活性類似于或高于野生型Rubisco活化酶在正常條件(例如25。C)下的酶活性。在一個實施方案中,用野生型Rubisco活化酶核酸分子(例如SEQIDNO:l)作為模板來產(chǎn)生Rubisco活化酶衍生核酸分子。在一些實施方案中,將編碼一個以上這樣的氨基酸殘基的核酸殘基加以改變,使得受編碼氨基S吏發(fā)生改變,所述氨基酸殘基在將核苷酸序列與SEQIDNO:2進行最佳比對時發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于SEQIDNO:2的殘基42、130、131、168、257、274、293和310??赏ㄟ^標準的沖支術(shù)?1入序列變更(sequencealteration),所述技術(shù)如定向分子進化技術(shù),例如DNA改組方法(參見例如Christians等,(1999)Atowe說o^c/z"o/ogy17:259-264;Crameri等,(1998)A^we391:288-291;Crameri等,(1997)A^w"所0&c/7"0/0gy15:436-438;Crameri等,(1996)A^fwe14:315-319;Stemmer,(1994)A/^we370:389-391;Stemmer等,(1994)戶rac.iVa"jcac/.91:10747-10751;美國專利5,605,793、6,117,679、6,132,970、5,939,250、5,965,408、6,171,820;國際公開說明書WO95/22625、WO97/0078、WO97/35966、WO98/27230、WO00/42651和WO01/75767);定點誘變(參見例如Kunkel,(1985)TVoc.A^/.JcadSc/.82:488-492;Oliphant等,(1986)G認44:177-183);寡核苷酸定向誘變(參見例如Reidhaar陽01son等,(1988)5We"ce241:53-57);化學(xué)誘變(參見例如Eckert等,(1987)Mwtaf.178:1-10);易錯PCR(參見例如Caldwell&Joyce,(1992)戶CiMe&oA2:28-33)和盒式誘變(參見例如Arkin等,(1992)/Voc.A^/.Xo^.5W"89:7871-7815);(主要參見例如Arnold,(1993)C群.飽ec/mo/.4:450-455;Ling等,(1997)^"a/.5/oc/em.,254(2):157-78;Dale等,(1996)iWo/.57:369-74;Smith,(1985)爿肌iev.19:423-462;Botstein等,(1985)5We聰,229:1193-1201;Carter,(1986)腸c/z置J237:1-7;Kramer等,(1984)Ce〃38:879-887;Wells等,(1985)G認34:315-323;Minshull等,(1999)CWre"f(9p/m.ow/"C72em/ca/5w/ogv3:284-290)。在一個實施方案中,用DNA改組來產(chǎn)生Rubisco活化酶衍生核酸分子。DNA改組可在體外(invitro)、在體內(nèi)(invivo)、在計算機芯片上(insilico)或它們的組合來實現(xiàn)。在計算機芯片上的重組方法可這的各序列串(s叫uencestring)進行重組。所得的重組序列串任選例如通過同時采用寡核苷酸合成/基因重裝配技術(shù)(oligonucleotidesynthesisgenereassemblytechnique)進4亍對應(yīng)于重組序列的核酸的合成,來轉(zhuǎn)變成核酸。這個方法能產(chǎn)生隨機的、部分隨機的或設(shè)計的變更。有關(guān)在計算機芯片上的重組的許多細節(jié)內(nèi)容,包括遺傳算法、遺傳算子等在計算機系統(tǒng)中的使用,以及相應(yīng)核酸及設(shè)計的核酸的組合的產(chǎn)生(例如基于交4^f立點選擇(cross-oversitesdection》,還有i殳計的、々支隨才幾的或隨機的重組方法,在本領(lǐng)域中都有描述(參見例如國際公開說明書WO00/42560和WO00/42559)。在另一個實施方案中,采用定向誘變,通過選擇野生型Rubisco活化酶中的特定核苷酸序列或位置進行變更,來產(chǎn)生Rubisco活化酶衍生核酸分子。這種定向突變可在核酸中的任何位置引入,可以是保守突變或非保守突變。"非保守氨基酸置換"是其中氨基酸殘基被具有不相似的側(cè)鏈的某氨基酸殘基置換的置換作用。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族在本領(lǐng)域中已有定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺)、具有不帶電極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸、色氨酸)、具有P-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。這種定向突變可以不是非保守氨基酸殘基置換,而是保守氨基酸殘基置換;或者這種定向突變除了可以是非保守氨基酸殘基置換外,還可以是保守氨基酸殘基置換。"保守氨基酸置換"是其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的某氨基酸殘基置換的置換作用。在誘變后,受編碼蛋白質(zhì)可以進行重組表達,并可測定該蛋白質(zhì)的活性。在一些實施方案中,可作出置換,使得位置42處的氨基酸具有不帶電極性側(cè)鏈或(3-分支側(cè)鏈,位置130處的氨基酸具有堿性側(cè)鏈,位置131處的氨基酸具有非極性側(cè)鏈或P-分支側(cè)鏈,位置168處的氨基酸具有堿性側(cè)鏈,位置257處的氨基酸具有非極性側(cè)鏈或(3-分支側(cè)鏈,位置274處的氨基酸具有堿性側(cè)鏈,位置293處的氨基酸具有堿性側(cè)鏈和/或位置310處的氨基酸具有酸性側(cè)鏈。氨基酸位置可通過將受編碼的Rubisco活化酶衍生多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2進行最佳比對來確定。在另一個實施方案中,用隨機誘變來產(chǎn)生Rubisco活化酶書1"生核酸分子。可在編碼序列的整條鏈或一部分鏈上隨機引入突變(例如通過飽和誘變)。在某些實施方案中,可將編碼具有相似結(jié)構(gòu)域、結(jié)構(gòu)基序、活性位點,或者與野生型Rubisco活化酶的一部分比對時有錯配或不完美匹配的其它相關(guān)多肽的核苷酸序列,用于誘變過程中以產(chǎn)生序列的多樣性。應(yīng)認識到,對于一些上述技術(shù)中的每個誘變步驟,可進行任一或所有步驟的多次重復(fù)循環(huán),以使序列的多樣性最優(yōu)化。上述各方法可以以任何合宜的順序進行組合使用。在許多情況下,上述方法產(chǎn)生一批(apoolof)改變的核酸序列或一批包含改變的核酸序列的重組宿主細胞。具有所需特性的改變的核酸序列或表達改變的核酸序列的宿主細胞,可通過用一種或多種本領(lǐng)域公知的測定進行篩選來鑒定。測定可在能選擇具有所需物理或化學(xué)特性的多肽的條件下進行。核酸序列的變更可通過對克隆中的編碼改變的多肽的核酸分子進行測序來確定。另外,Rubisco活化酶衍生核酸分子可在整體上或部分上進行密碼子優(yōu)化。由于任何一個氨基酸(除甲硫氨酸外)都是由多個密碼子(表l)所編碼,可將核酸分子的序列進行改變而不使所編碼的氨基酸發(fā)生改變。當一個以上密碼子在核酸水平上發(fā)生改變以符合或更好地接近特定宿主的密碼子用法時,這就是密碼子優(yōu)化。宿主細胞所顯示的優(yōu)選密碼子用法的頻率,可通過求出該宿主細胞所表達的大量基因中的優(yōu)選密碼子用法的頻率的平均值進行計算。這個分析可限定于該宿主細胞所高度表達的基因。美國專利5,824,864例如提供了雙子葉植物和單子葉植物所顯示的高度表達基因的密碼子用法的頻率。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會認識到,在本領(lǐng)域有提供多種生物的偏好信息的表格和其它參考資料可獲得。測定Rubisco活化酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及與野生型Rubisco活化酶相比熱穩(wěn)定性提高的Rubisco活化酶衍生多肽。本文所用的術(shù)語"熱穩(wěn)定性提高的"是指所述Rubisco活化酶衍生多肽與野生型Rubisco活化酶相比在升溫條件下活化Rubisco的能力提高。在一個實施方案中,Rubisco活化酶衍生多肽在升溫條件下(例如35。C或更高)的酶活性大于野生型Rubisco活化酶在升溫條件下的酶活性。在另一個實施方案中,Rubisco活化酶^"生多肽在升溫條件下(例如26°C或更高,對于體外測定更優(yōu)選40。C)的酶活性很大程度上類似于或高于野生型Rubisco活化酶在正常條件下(例如20-25°C,對于體外測定更優(yōu)選25°C,對于體內(nèi)測定更優(yōu)選22°C)的酶活性。本文所用的術(shù)語"很大程度上類似于"是指Rubisco活化酶衍生多肽的酶活性在野生型Rubisco活化酶的酶活性的一個標準偏差之內(nèi)??捎帽绢I(lǐng)域公知的任何方法測定Rubisco活化酶衍生多肽在升溫條件下的活性(包括但不限于Rubisco活化和ATP水解)。在一些實施方案中,Rubisco活化酶^f汙生多肽活性在體外進^f亍測定。在一個實施方案中,可測定Rubisco活化酶衍生多肽在包含失活的Rubisco、RuBP、ATP和標記碳的來源(例如[C"]NaHC03)的溶液中溫育時其活化Rubisco的能力??杀O(jiān)測標記碳向3-磷酸甘油酸(GPA)中的摻入情況,作為Rubisco活化的標志。在另一個實施方案中,可測定Rubisco活化酶衍生多肽在包含ATP的溶液中溫育時其水解ATP的能力。在進行測定之前對Rubisco活化酶衍生多肽進行熱處理,然后在升溫條件下或在正常條件下進行測定??梢允褂眉兓腞ubisco活化用成分,也可使用包含Rubisco活化用成分的細胞。在其它的實施方案中,Rubisco活化酶衍生多肽活性在體內(nèi)進行測定??墒共槐磉_野生型Rubisco活化酶的植物(例如缺失突變林)表達一種或多種Rubisco活化酶衍生多肽,并可分析該植物在升溫生長條件下的光合作用速度、生物量、生長速度和種子產(chǎn)量。該植物可完全在升溫條件下生長,或者可在升溫條件下生長較短時間。在一個實施方案中,光合作用速度是通過分析植物的C02固定進行測量。在另一個實施方案中,生長速度是通過分析植物的葉子面積進行測量。在另一個實施方案中,種子產(chǎn)量是通過測定成熟干燥植物的種子重量進行分析。在另一個實施方案中,種子產(chǎn)量是通過測定種子發(fā)芽率進行測定。增強植物的耐熱'性的方法Rubisco活化酶能活化植物中的Rubisco?;罨腞ubisco參與光合作用,它是光合作用過程中的限速步驟。隨著Rubisco活化酶活性的下降,Rubisco保持無活性,光合作用減慢或停止。溫度的升高會使Rubisco活化酶不穩(wěn)定和/或變性,從而使該酶不太能夠或不能夠?qū)o活性的Rubisco轉(zhuǎn)化成活性形式。本發(fā)明涉及與野生型Rubisco活化酶相比熱穩(wěn)定性提高的Rubisco活化酶衍生多肽。由此,在熱穩(wěn)定性提高的Rubisco活化酶衍生多肽的參與下,光合作用過程可變得更具耐熱氺生。可用本領(lǐng)域公知的任何方法促使植物表達本發(fā)明的一種或多種Rubisco活化酶衍生多肽。在一個實施方案中,可構(gòu)建能表達本發(fā)明的一種或多種多肽的轉(zhuǎn)基因植物。該轉(zhuǎn)基因植物可在所有組織中表達本發(fā)明的一種或多種多肽(例如全局表達)?;蛘撸景l(fā)明的一種或多種多肽可只在一部分(asubsetof)組織中表達(例如組織特異性表達),肽可在植物中組成型表達,或者在可誘導(dǎo)啟動子的控制下表達。在一些實施方案中,才直物的內(nèi)源Rubisco活化酶的表達和/或活性:故降^氐或消除。重組表達本發(fā)明的核酸分子和多肽可用本領(lǐng)域公知的標準的重組DNA和分子克隆才支術(shù)《列^口Sambrook,Fritsch和Maniatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,(1989))進行重組表達。另外,可使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生適合用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物的核酸構(gòu)建物。因此,本發(fā)明的一個方面涉及包含本發(fā)明核酸分子或其變體的載體,優(yōu)選表達載體。本文所用的術(shù)語"載體"是指能夠轉(zhuǎn)運已連接到其上的另一核酸的多核苷酸。一種類型的載體是"質(zhì)粒",它是指其中可引入另外的DNA區(qū)段的環(huán)形雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體,其中另外的DNA區(qū)段可引入到病毒基因組中。某些載體能夠在它們所引入到的宿主細胞中進行自主復(fù)制(例如具有細菌復(fù)制起點的細菌載體和附加型載體)。其它的載體(例如非附加型載體)在引入到宿主細胞中時整合到宿主細胞的基因組中,從而隨著宿主基因組進行復(fù)制。一般來說,適用于重組DNA技術(shù)的表達載體往往為質(zhì)粒(載體)的形式。但是,本發(fā)明有意包括其它形式的表達載體,如病毒載體(例如復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒)。本發(fā)明的重組表達載體包含其形式適合于其在宿主細胞中的表達的本發(fā)明核酸分子。這意味著該重組表達載體包括一個以上根據(jù)待用來進行表達的宿主細胞而選擇的調(diào)節(jié)序列,所述調(diào)節(jié)序列與待表達的多核苷酸發(fā)生可操作性結(jié)合(operablyassociated)。在重組表達載體當中,"可操作性結(jié)合"是指目的核苷酸序列以能使它得以表達的方式與調(diào)節(jié)序列連接(所述表達例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中,或者當載體被引入到宿主細胞中時在宿主細胞中)。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"意指包括啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。這種調(diào)節(jié)序歹'J在本領(lǐng)域中有描述(例如Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology,(1990)AcademicPress,SanDiego,CA)。調(diào)節(jié)序列包括那些指導(dǎo)核苷酸序列在多種類型的宿主細胞中進行組成型表達的調(diào)節(jié)序列和那些指導(dǎo)核苷酸序列只在某些宿主細胞中進行表達的的調(diào)節(jié)序列(例如組織特異性調(diào)節(jié)序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到,表達載體的設(shè)計須取決于諸如以下因素;待轉(zhuǎn)化的宿主細胞的選擇、所需的蛋白質(zhì)表達水平、生物體中需要進行表達的部位等??蓪⒈景l(fā)明的表達載體引入到宿主細胞中,從而產(chǎn)生本文所述的核酸分子所編碼的蛋白質(zhì)或肽,包括融合蛋白和肽。在一些實施方案中,可將充當啟動子或增強子元件的分離核酸引入到本發(fā)明多核苷酸的非異源形式(non-heterologousform)的適當位置(通常是上游),以向上或向下調(diào)節(jié)本發(fā)明多核苷酸的表達。例如,可通過突變、缺失和/或置換對內(nèi)源啟動子進行體內(nèi)改變(參見美國專利5,565,350;國際專利申請?zhí)朠CT/US93/03868),或者可將分離的啟動子以正確的方向和離本發(fā)明多核苷酸的關(guān)聯(lián)基因(cognategene)正確的距離引入到植物細胞中,以控制基因的表達。可使基因表達在適合于植物生長的條件下得到調(diào)整,以改變本發(fā)明多肽在植物細胞中的總濃度和/或改變其組成。因此,本發(fā)明提供用以制備可操作性連接到(operablylinkedto)本發(fā)明多核苷酸的天然、內(nèi)源(即非異源)形式的異源啟動子和/或增強子的組合物和方法。如果需要進行多肽表達,通常需要在多核苷酸編碼區(qū)的3'末端包括聚腺苷酸化區(qū)域。該聚腺苷酸化區(qū)域可衍自天然基因,衍自多種其它植物基因或者衍自T-DNA。待加入的3,末端序列可衍自例如胭脂氨酸合酶或章魚氨酸合酶基因,或者衍自另一植物基因,或者較不優(yōu)選地衍自任何其它真核生物基因。本發(fā)明的重組表達載體可設(shè)計成能在原核細胞(例如腸桿菌科(五她ra6a"m'ace—,如埃希氏菌屬(E^c/zen'c/n'a);芽孑包桿菌科CSac/〃aceae);根瘤菌科(//z/zo6oceae),如根瘤菌屬(i/zZzc^'wm)和才艮瘤桿菌屬(7/2/zoZ^cfe。;螺菌科(S;/n7/acefle),如發(fā)光細菌(photobacterium);發(fā)酵單月包菌屬(Zymomo"os);妙、雷氏菌屬(Serra&);氣單月包菌屬04eramo"w);弧菌屬(P76ho);脫硫弧菌屬(/)^"http://0*^/0);螺菌屬(S^n7/wm);乳桿菌科(Z^cto^d〃aceae);假單胞菌科(尸化W(iomowac/aceae),^口j叚單月包才干菌屬(i^ew(iowowos)和醋#干菌屬(Jceto^c&r);固氮菌科04zoto6o"eraceae)和硝化桿菌-牛(Mfrakzc&raceae))或真核細胞(例如昆蟲細胞(使用桿狀病毒表達載體)、酵母細胞、植物細胞或哺乳動物細胞)中表達本發(fā)明多肽(有關(guān)合適的宿主細胞的討^侖參見Goeddel,同上)?;蛘?,可例如^f吏用T7啟動子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯重組表達載體。蛋白質(zhì)在原核生物中的表達,往往是用包含指導(dǎo)融合蛋白或非融合蛋白的表達的組成型或可誘導(dǎo)型啟動子的載體,在大腸桿菌中進行。融合載體將多個氨基酸加到在其中編碼的蛋白質(zhì)中,通常是加到重組蛋白質(zhì)的氨基末端。這種融合載體通常起到至少以下三個目的l)增加重組蛋白質(zhì)的表達;2)增加重組蛋白質(zhì)的溶解性;和/或3)通過充當親和純化中的配體幫助重組蛋白質(zhì)的純化。通常,在融合表達載體中,將蛋白水解切割位點引入到融合部分(flisionmoiety)和重組蛋白質(zhì)的接點(junction),以使在融合蛋白的純化之后重組蛋白能與融合部分分離開來。這種酶和它們的關(guān)聯(lián)(cognate)識別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達載體包括pGEX(PharmaciaBiotechInc;Smith和Johnson,(1988)67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ),它們分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或A蛋白融合到靶重組蛋白。在另一個實施方案中,表達載體是酵母表達載體。用以在釀酒酵母(6".ce^WW"e)中表達的載體的實例包括pYepSecl(Baldari等,(1987)£MB(9/6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz,(1982)Ce//30:933-943)、pJRY88(Schultz等,(1987)(認54:113-123)、pYES2(InvitrogenCorp.,SanDiego,CA)和pPicZ(InvitrogenCorp.,SanDiego,CA)。或者,表達載體是桿狀病毒表達載體??晒┰谂囵B(yǎng)的昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中表達蛋白質(zhì)的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等,(1983)Mo/.CW/編,3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers,(l卿)W油gy170:31-39)。在又一個實施方案中,使用植物表達載體,包括但不限于煙草花葉病毒和馬鈴薯病毒表達載體,將本發(fā)明的核酸分子在植物細胞中表達。其它用于原核細胞和真核細胞的合適的表達系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的(參見例如Sambrook等,(1990)MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版,ColdSpring'HarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY中的第16和17章)。有多種啟動子可用于本發(fā)明的實施??筛鶕?jù)所需的結(jié)果來選^^啟動子??蓪⒑怂崤c組成型的、組織特異性的、可誘導(dǎo)型的或其它的啟動子進行組合,以在宿主生物中表達。"組織特異性啟動子"可指導(dǎo)本發(fā)明核酸在特定組織、器官或細胞類型中的表達。組織特異性啟動子可以是可誘導(dǎo)型的。類似地,組織特異性啟動子可只在該組織中的一定時框(timeframe)或發(fā)育階^a內(nèi)啟動轉(zhuǎn)錄。其它的組織特異性啟動子可在特定組織的整個生命周期內(nèi)都有活性。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會認識到,組織特異性啟動子可驅(qū)動被有效連接的序列在靶組織以外的組織中的表達。因此,本文所用的組織特異性啟動子是這樣的啟動子,它優(yōu)先在耙組織或細胞類型中驅(qū)動表達,但也可在其它的組織中導(dǎo)致一定的表達。有多種組織特異性啟動子可用于本發(fā)明。任何器官都可用適當?shù)膯幼影邢颍@些器官如出芽(shootvegetative)器官/結(jié)構(gòu)(例如葉子、莖干和塊莖)、根、花和花器官/結(jié)構(gòu)(例如苞葉、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花粉嚢和胚珠)、種子(包括胚芽、胚乳和種皮)和果實。例如,指導(dǎo)核酸分子在葉子中的表達的啟動子和/或光合作用器官特異性啟動子(如Khoudi等,(1997)197:343中所公開的朋CS啟動子)可用于增強光合作用。另外,可通過將這樣的肽加入到本發(fā)明的多肽來獲得組織特異性表達,所述肽能指導(dǎo)被連接的多肽定位到光合作用器官(例如美國專利申請系列號11/150,054中公開的那些器官)。"組成型啟動子"定義為能指導(dǎo)基因在所有組織中的表達,在大多數(shù)環(huán)境條件和發(fā)育或細胞分化狀態(tài)下有活性的啟動子。組成型啟動子的實例包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域、衍自根瘤土壤才干菌(^gr。6(3"en'wwmma/ade"力的T-DNA的l,-或2,隱啟動子和本4貞i或普通技術(shù)人員公知的來自各種植物基因的其它轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域。這種基因包括例如來自擬南芥的^CT"(Huang等,(1996)P/aWMo/.脂.33:125-139)、來自擬南芥的Cad(GenBank登錄號U43147,Zhong等,(1996)Mo/.251:196-203)、來自油茱(5ra^z'ca"a/w力的編碼硬脂酰-?;d體蛋白去飽和酶的基因(Genbank登錄號X74782,Solo麵be等,(1994)尸/a"f尸—'o/.104:1167-1176)、來自玉米的GPcl(GenBank登錄號X15596,Martinez等,(1989)JMo/.編.208:551-565)和來自玉米的Gpc2(GenBank登錄號U45855,Manjunath爭,(1997)/VaWMo/.Ao/.33:97-112)。任何強組成型啟動子如CaMV35S啟動子都可用于本發(fā)明多肽在整林植物中的表達。術(shù)語"可誘導(dǎo)型啟動子"是指處在精確的環(huán)境或發(fā)育控制下的啟動子??捎绊懣烧T導(dǎo)型啟動子的轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的實例包括絕氧條件、高溫、光線的存在或者化學(xué)品/激素的施噴。用于植物宿主細胞的合適的組成型啟動子包括例如Rsyn7啟動子和其它相關(guān)組成型啟動子的核心啟動子(國際7>開"^兌明書WO99/43838和美國專利6,072,050);核心CaMV35S啟動子(Odell等,(1985)7Vaft^313:810-812);水稻肌動蛋白啟動子(McElroy等,(1990)尸/a"fCe//2:163-171);遍在蛋白啟動子(Christensen等,(1989)尸/a"fAfo/.脂.12:619-632和Christensen等,(1992)P/a"rMo/.腺.18:675-689);pEMU(Last等,(1991)TTz,.勿/.81:581-588);MAS(Velten等,(1984)五MS(9J.3:2723-2730);ALS啟動子(美國專利5,659,026)及其它(例如美國專利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611)。本發(fā)明的另一個方面涉及已引入了本發(fā)明的重組表達載體的宿主細胞。術(shù)語"宿主細胞"和"重組宿主細胞"在本文中可互用。應(yīng)認識到,該術(shù)語不僅指特定的受試者細胞,也指該細胞的子代或潛在子代。因為由于突變或環(huán)境影響的緣故在后續(xù)各代中可能出現(xiàn)某些變化,這種子代細胞實際上可能與親本細胞不相同,不過它們?nèi)园ㄔ诒疚乃玫脑撔g(shù)語的范圍內(nèi)。因此,本發(fā)明提供具有包含本發(fā)明核酸分子或其變體的表達載體的宿主細胞。宿主細胞可以是任何真核細胞(例如大腸桿菌、蘇云金芽孑包#干菌(5acz7/w^wn'wg/em/"或真才亥細月包(例如昆蟲細月包、酵母或才直物細胞)。本發(fā)明還提供表達本發(fā)明的核酸分子從而制備所編碼的多肽的方法,所述方法包括i)在能使所編碼的多肽得以生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)包含本發(fā)明核酸分子的細胞;和ii)分離所表達的多肽。載體DNA可通過常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)引入到原核細胞或真核細胞中。本文所用的術(shù)語"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)染"意指多種本領(lǐng)域公認的用以將外來核酸分子引入到宿主細胞中的技術(shù),包括磷酸鉤或氯化4丐共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、電穿孔、根瘤土壤桿菌(^gro6a"en'wmfwne々cz'era)和真空、滲入。在本領(lǐng)域有合適的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞的方法(例如Sambrook等,同上)。轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生可采用任何本領(lǐng)域公知的方法,用本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)化植物或植物細胞??蓪⒑怂岱肿右氲街参顳NA(例如基因組DNA或葉綠體DNA)中,或者保持不插入到植物DNA中(例如通過使用任何染色體)。合適的將核酸分子引入到植物細胞中的方法包括微注射(Crossway等,(1986)S/o&c/m^w^4:320-334);電穿孔(Riggs等,(1986)iVoc.^cac/.83:5602-5606;D'Halluin等,(1992)P/amCe〃4:1495-1505);土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國專利5,563,055和5,981,840;Osjoda等,(1996)Atowrej5/o&c/z"o/ogy14:745-750;Horsch等,(1984)We"ce233:496-498;Fraley等,(1983)尸rac.A^/.爿cad80:4803和7hms/er隱尸/a他,Potrykus,(編輯),Springer-Verlag,Berlin1995);直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等,(1984)五M5C^3:2717-2722);彈道顆粒力口速(ballisticparticleacceleration)(美國專利4,945,050、5,879,918、5,886,244、5,932,782;Tomes等,(1995)"DirectDNATransferintoIntactPlantCellsviaMicroprojectileBombardment,PlantCell,Tissue和OrganCulture:FundamentalMethods,Gamborg和Phillips(編輯),Springer曙Verlag,Berlin和McCabe等,(1988)所ofec/mo/ogy6:923-926);病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國專利5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931);花粉轉(zhuǎn)化(DeWet等,(1985)TheExperimentalManipulationofOvuleTissues,Chapman等(編輯),Longman,NewYork,第197-209頁);Lec1轉(zhuǎn)化(美國專利申請系列號09/435,054;國際公開說明書WO00/28058);頸須介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(whisker-mediatedtransformation)(Kaeppler等,(1990)P/a"fCW//印o^y9:415-418;Kaeppler等,(1992)T7zeor^p/.84:560-566);and葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)(Bogorad,(2000)7e油腸加/zwo/。gy18:257-263;Ramesh等,(2004)MeAo^Mo/B/o/.274:301-7;Hou等,(2003)Traragew'ci仏12:111-4;Kindle等,(1991)iVoc.扁.Jcac/.SW.88:1721-5;Bateman和Purton,(2000)Mo/Gew263:404-10;Sidorov等,(1999)尸/a"fJ19:209-216)。用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物和植物細胞的轉(zhuǎn)化方案的選擇,可根據(jù)作為轉(zhuǎn)化目標的植物或植物細胞的類型(即單子葉植物或雙子葉植物)而變。特別適合于特定植物類型的轉(zhuǎn)化方案的實例,包括適于以下植物的轉(zhuǎn)化方案馬鈴薯(Tu等,(1998)P/cmfMo〖ecw/arS/o/ogy37:829-838;Chong等,(2000)7>aragem'cie"(3rc/29:71-78);大豆(Christou等,(1988)尸/a"f尸;z,/0/.87:671-674;McCabe等,(1988)Aorec/mo/ogv6:923-926;Finer和McMullen,(1991)/"Ce〃Dev.5/o/.27P:175-182;Singh等,(1998)T7zeory4p//.96:319-324);玉米(Klein等,(1988)Prac.扁.爿c"dSd.85:4305-4309;Klein等,(1988)胸ec/zwo/ogy6:559-563;Klein等,(1988)P/a"/戶/2;w'0/.91:440-444;Fromm等,(1990)所o&c/mo/ogy8:833-839;Tomes等,(1995)"DirectDNATransferintoIntactPlantCellsviaMicroprojectileBombardment,"PlantCell,Tissue和'OrganCulture:FundamentalMethods,Gamborg(編輯),(Springer-Verlag,Berlin));谷類(Hooykaas-VanSlogteren等,(1984)Atowe311:763-764;美國專利5,736,369)。在一些實施方案中,使用一個以上的構(gòu)建物進行轉(zhuǎn)化來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物和植物細胞??蓪⒍鄠€構(gòu)建物引入在順式或反式位置。在優(yōu)選的實施方案中,每個構(gòu)建物都具有啟動子和其它調(diào)節(jié)序列。轉(zhuǎn)基因植物可按任何本領(lǐng)域公知的方式表達轉(zhuǎn)基因,所述方式包括但不限于組成型表達、發(fā)育調(diào)節(jié)表達和組織特異性表達。在一個具體的實施方案中,使用能指導(dǎo)核酸分子在葉子和/或光合作用器官中的表達的啟動子(如Khoudi等,197:343中公開的/^GS啟動子)來表達本發(fā)明的核酸分子和/或多肽??蓪⑼ㄟ^任何上述轉(zhuǎn)化技術(shù)得到的轉(zhuǎn)化植物細胞進行培養(yǎng),以再生出具有轉(zhuǎn)化基因型從而具有所需的表現(xiàn)型的整抹植物。這種再生技術(shù)依賴于對組織培養(yǎng)生長培養(yǎng)基中的某些植物激素的操縱,而所述操縱通常依賴于已與所需的核苷酸序列一起引入的殺生物劑和/或除草劑標記。從培養(yǎng)的原生質(zhì)體進行的植物再生在本領(lǐng)域中已有描述(例如Evans等,ProtoplastsIsolationandCulture,HandbookofPlantCellCulture,第124-176頁,MacM腿anPublishingCompany,NewYork,1983;andBinding,RegenerationofPlants,PlantProtoplasts,第21-73頁,CRCPress,BocaRaton,1985)。也可從植物愈傷組織、外才直體、器官或它們的部分(part)獲得再生。這種再生技術(shù)在本領(lǐng)域中也有描述(例如Klee等,(1987)j朋.iev.0/戶/aW尸/y^38:467-486)。術(shù)語"植物"包括整抹植物、出芽(shootvegetative)器官/結(jié)構(gòu)(例如葉子、莖干和塊莖)、根、花和花器官/結(jié)構(gòu)(例如苞葉、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花粉嚢和胚珠)、種子(包括胚芽、胚乳和種皮)和果實(成熟子房)、植物組織(例如維管組織、基本組織等)和細胞(例如保衛(wèi)細胞、卵細胞、藻絲(trichome)等)和它們的子代??捎糜诒景l(fā)明方法的植物的類別包括適于轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等和低等植物的各類別,包括被子植物(單子葉植物和雙子葉植物)、棵子植物、蕨類植物和多細胞藻類。本發(fā)明也包括多個倍性水平的植物,包括非整倍體、多倍體、雙倍體、單倍體和半合體植物。本發(fā)明的核酸分子可用來將所需的性狀賦予到基本上任何植物。因此,本發(fā)明可用于各種各樣的植物,包括以下各屬植物的各個種Agrafe、蔥屬(力/z'謂)、鳳梨屬(^4"朋oy)、腰果屬04加caW簡)、芽屬(z4//謂)、落花生屬(Jracto)、天門冬屬(y^p"ragus)、y4/za畫"A(3、顛癡屬(」/ro/")、燕麥屬(jve"a)、簕竹屬(Saw6wa)、甜菜屬CBeto)、蕓苔屬(Sra肌'ca)、雀麥屬(萬ra扁力、Bro麗a/z'a、山茶屬(C細e腸)、大麻屬(Qzww^)、番木瓜屬(C臘'ca)、長角豆屬(Ora加/a)、鷹嘴豆屬(C7cer)、舉屬(C7zewopoc/i!'ww)、C7z/ccWwm、斥甘橘屬(C"7-w力、西瓜屬(GYrw〃w力、多束才杈屬(Ca/w/cwm)、紅花屬(CaW/ztwms)、椰子屬(Cocos)、咖啡屬(Co^ea)、薏苡屬(Co/x)、甜瓜屬(Cwcwm'力、南瓜屬(CwcwrWto)、狗牙根屬(C,o^")、鴨茅屬(Z^c(y/z》、曼陀羅屬(A3fwra)、胡蘿卜屬(Z)"mc—、石竹屬(D/朋^7ws)、毛地黃屬(D妙a/z》、薯蕷屬(D/ojcw—、油棕屬(五/ag&)、穆屬(J57/ww."e)、大戟屬(五wp/z。r&")、羊茅屬(Fesfwca)、熔屬CF/cus)、草莓屬(Fragw7.a)、老鸛草屬(Geram'wm)、大豆屬(G7ydwe)、禾本科(GV薩z'"ae)、棉屬(C7ow爐'畫)、向曰葵屬(//Wcw^z—、(T7efenx^〃&)、橡股樹屬(7/ev—、木槿屬(歷6/sc—、大麥屬(/7onie畫)、天仙子屬(i^oscya附ws)、甘薯屬(ipcwoea)、萬苣屬(Z^cfwca)、山黧、豆屬(丄"^yn^)、兵豆屬(丄era)、百合屬(丄///"^)、亞麻屬(丄z'"wn)、黑麥草屬(丄o〃ww)、百月:K才艮屬、習(xí)習(xí)扇豆屬(丄wp/"w"、番癡屬(Z^copem'cow)、澳洲堅果屬(Maca(i聽fc2)、八仙花屬(M3CTO//^〃a)、蘋果屬(Afo/us)、忙果屬(Mawgz/era)、木募屬(JVfam'/20f)、M<q/orawa、首諧屬(Afed/cago)、藝蕉、屬(Mwsa)、7jOf山屬(iVi3rc/Mus)、7Vemes/a、火因草屬(M'co"a加)、驢豆屬(Owo67c/z/力、木犀沖覽屬(0/ea)、((9/,eae)、稻屬、泰屬(尸a"/c訓(xùn))、泰屬(尸a"/cwm)、(尸G"/e讓)、狼尾草屬(Pawm's"wm)、《良尾草屬(Pewmie&w)、碧冬癡屬(Pefwm'a)、天竺葵屬(尸e/argowz.ww)、旁f梨屬(Pe;^ea)、(/Varo/ofeae)、菜豆屬(P/zoseo/ws)、才弟牧草屬(戶/z/ewm)、云杉屬(尸z'cea)、早熟禾屬(尸oa)、松屬(A'm^)、P/stoc/n."、5宛豆屬(尸&w附)、楊屬(尸opw/w"、黃杉屬(戶^W(ic^wga)、梨屬(尸3^us)、李屬(/Vwmw)、Psewto&wg"、番石.插屬(尸w'(ifwm)、才樂屬(gwm7w力、毛茛屬(ia咖ncw/—、蘿卜屬(ia;/za"w51)、茶薦子屬(雄as)、荒麻屬(7/"."M力、杜鵑屬(i^。fifo(ie"(ira")、薔薇屬("os")、甘蔗屬(Sacc/zaraw)、美人襟屬(Sa/;^'g/os;^)、黑麥屬(&ca/e)、千里光屬0Se"edo)、狗尾草屬(5"eton'a)、北美紅杉屬OSe《wc^)、白芥屬0S/"a;^)、癡屬(6b/a"訓(xùn))、高粱屬(5brg/7訓(xùn))、鈍葉草屬(5Vewo鄉(xiāng)/^簡)、r/zeo6rom^、胡盧巴屬(7h'go"e〃a)、車軸草屬(7h/o/!'wm)、胡盧巴屬(7Wgo"e//a)、小麥屬(7W&wm)、4失杉屬(7^wga)、郁金香屬(r"/^")、野豌豆屬(7/c/a)、葡萄屬(W&)、虹豆屬(Wg"a)和玉蜀黍?qū)?Zea)。在具體的實施方案中,轉(zhuǎn)基因植物是玉米、西紅柿、馬鈴薯、水稻、大豆、棉花、向日葵、苜蓿、萵苣、卡諾拉油菜、高粱或煙草植物??墒罐D(zhuǎn)基因植物生長并用同一轉(zhuǎn)化植株或不同的植抹授粉??缮L出兩代或多代植物,以確保所需核酸分子、多肽的表達和/或表現(xiàn)型特征得到穩(wěn)定保持和承襲。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會認識到,本發(fā)明核酸分子在被穩(wěn)定并入到轉(zhuǎn)基因植物中并被確認可操作(opemble)后,可通過有性雜交將它引入到其它植物中。可使用多種標準的育種技術(shù)中的任何一種,這取決于代雜交的種類。轉(zhuǎn)基因植物中的表達的測定可使用任何本領(lǐng)域公知的方法,來測定本發(fā)明核酸分子或由其編碼的多肽在植物中的表達水平。例如,本發(fā)明核酸分子所編碼的多肽在植物中的表達水平可用分子技術(shù)進行測定,所述技術(shù)包括但不限于免疫測定、免疫沉淀法、凝膠電泳和定量凝膠電泳。另外,本發(fā)明核酸分子所編碼的多肽在植物中的表達水平,可通過在升溫條件下與表達野生型Rubisco活化酶的植物相比植物表現(xiàn)型(包括但不限于光合作用速度、生長許多和種子產(chǎn)量)的改變程度來測定。此外,可將從轉(zhuǎn)基因植物及其組織分離的提取物或多肽用于體外測定中。本文所引述的所有出版的論文、書籍、參考手冊和文摘的內(nèi)容通過引用整體結(jié)合到本文中,以更加完全地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展水平。由于可不偏離本發(fā)明的范圍和精神對上述主題作出各種變化,因此規(guī)定所有以上描述中所包含的和/或所附權(quán)利要求書中所限定的主題都應(yīng)被解釋為旨在描述和說明本發(fā)明。根據(jù)以上教導(dǎo)內(nèi)容可以對本發(fā)明作出各種修改和變化。實施例實施例1:分離Rubisco活化酶衍生多肽用SEQIDNO:1的野生型Rubisco活化酶作為模板,從單基因改組(singlegeneshuffling)(參見例如Crameri等,(1998)A^匿.391(6664):288-91;Chang等,(1999)5/o&c/2"o/.17(8):793-7;Ness等,(1999)淑腺ec/wo/.17(9):893-6;Christians等,(1999)淑所o&c/7"o/.17(3):259-64和USPatentNos.6,605,430、6,117,679;and5,605,793)和合成改組(syntheticshuffling)(參見例如USPatentNo.6,436,675和國際公開說明書WO00/42561、WO01/23401、WO00/42560;andWO00/42559)產(chǎn)生Rubisco活化酶文庫。簡單的說,用Trizof試劑按廠商的方案(Invitrogen)從擬南芥的綠葉分離RNA。用TITANIUMone-stepRT-PCRKit(BDBiosciences-Clontech)將RCAcDNA(GenBankaccessionnumberNM179990)PCR克隆到TOPC^載體(Invitrogen)中。對于單基因改組,在第一輪,將成熟RCA短形式(編碼區(qū)V59-K438)在無引物PCR反應(yīng)中進行PCR擴增(Qiagenra《DNA聚合酶或StratageneMutazymeDNA聚合酶),片段化和重裝配,然后用含有A^oI位點(5,)和^wzHI位點、6x-His編碼區(qū)和終止密碼子(3,)的側(cè)翼引物拯救被改組的基因。將變體的文庫克隆到用iVcol和5awffl消化的大腸桿菌表達載體(pET16b,Novagen)。為擴大第一輪的遺傳庫(poolofgenetic),用小麥、水稻、棉花、菠菜和黃瓜的多樣性進行合成改組(參見Ness等,(2002)Aotec/mo/.20:1251-1255)。按之前Crameri等,(1998)iVamre15:288-291的描述用第一輪變體作為親本進行第二輪的基因改組。熱穩(wěn)定性提高的Rubisco活化酶衍生多肽通過以下篩選方法分離。第一級Rubisco活化測定。將表達Rubisco活化酶衍生多肽的大腸桿菌的培養(yǎng)物在4。C、3,500rpm下離心沉淀15分鐘后,在96孔V形底PCR板中-80。C下儲藏。這樣制備大腸桿菌細胞裂解產(chǎn)物將培養(yǎng)物在室溫下解凍5分鐘,向每孔加入75^1超聲緩沖液(100mMTricineKOHpH8.0、20mM抗壞血酸、3mMMg陽ATP、10mMMgCl2、10%v/v甘油、10mMJ3me、x3.33蛋白酶抑制劑、1|ul/mlbenzonase、lmg/ml溶菌酶),將板在4。C下振搖60分鐘,直到細胞沉淀被裂解。將板用MISONIX微板超聲波儀進行超聲處理1分鐘,然后冷卻1分鐘。這個過程重復(fù)四次。將培養(yǎng)物在4。C、4,000rpm下離心20分鐘。將含有可溶性蛋白質(zhì)的上清液用于Rubisco活化測定。將22|il的大腸桿菌上清液轉(zhuǎn)移到96孑LU形底閃爍板(scintillation-plate),在室溫下溫育15分鐘(并在測定中用作"正常條件,,的裂解產(chǎn)物)。裂解產(chǎn)物的熱處理是通過將35pl的大腸桿菌上清液轉(zhuǎn)移到96孔V形底PCR板并在40。C下溫育15分鐘來進行。然后將熱處理過的上清液轉(zhuǎn)移到96孔U形底閃爍板(并在測定中用作"熱處理條件"的裂解產(chǎn)物)。兩板在進行性能測定前在4°C下溫育5分鐘。這樣測定Rubisco活化情況將含有Rubisco活化酶或Rubisco活化酶衍生多肽的細胞裂解產(chǎn)物與純化的失活的擬南芥Rubisco(15jug)在反應(yīng)緩沖液(100mMTricineKOHpH8.0、10mMMgCl2、10mM[14C]NaHC03、Mg-ATP、4mMRuBP、lmMPEP、40(ig/ml丙酮酸激酶)中室溫下溫育15分鐘(參見Shen等,(1991)JSZo/.C/2em.266:8963-8968)。加入1NHCl終止表達Rubisco活化酶衍生多肽的細胞裂解產(chǎn)物對Rubisco的活化作用,通過液體閃爍光譜測定法測定14co2的摻入情況。上述測定中所用的Rubisco從擬南芥葉子純化得到。將葉子均質(zhì)化并在液氮中冷凍,然后重新懸浮于提取緩沖液(100mMHepes-KOHpH8.0、lmMEDTApH8.0、3mMDDT、0.5mMPMSF、10mMMgCl2、10mMNaHCO3)中。將懸浮液在4。C、12,000rpm下離心20分鐘,收集上清液。將上清液在連續(xù)攪拌下保持在冰上,同時加入硫酸銨至最終濃度為35。/。飽和,在4。C、12,000rpm下離心20分鐘。將上清液再攪拌30分鐘,同時加入^5克酸銨至最終濃度為55%飽和,然后在4。C、12,000rpm下離心20分鐘。將所得沉淀溶于提取緩沖液中,再用18%聚乙二醇進行沉淀并離心。再將所得沉淀重新懸浮于提取緩沖液(約1ml/原始40ml上清液)中,在4。C、13,000rpm下離心30分鐘。純化的Rubisco在上清液中,加入甘油至最終濃度為10%。通過以下方案使純化的Rubisco失活(參見Wang等,(1992)P/a"/^"z'o/.100:1858-1862)。向純化的Rubisco加入10mMDTT,在45。C下溫育10分鐘。將所得混合物取1ml加到用平衡緩沖液(50mMTricine-KOHpH8.0和0.5mMEDTApH8,0)平衡的20mlSephadexG-50柱。加入1ml/份的平衡緩沖液,將失活的Rubisco從柱上洗脫下來。收集洗脫下來的失活Rubisco,在室溫下溫育1小時,然后在4mMRuBp的存在下在冰上溫育1小時。第二級活性克隆的細胞裂解產(chǎn)物活化Rubisco的HTP溫度概況(temperatureprofile)。第一級篩選中鑒定出的目的克隆在笫二級篩選中作進一步的表征。將每個活性克隆的細胞裂解產(chǎn)物如上所述再作試驗,例外的是測定前先在四個不同的溫度(16。C、25。C、40。C和45。C)下進行溫度處理。選出與野生型Rubisco活化酶(SEQIDNO:2)相比具有相對提高的熱穩(wěn)定性概況的克隆進行第三級篩選。第三級純化的Rubisco活化酶變體活化Rubisco的溫度扭無況。為測定前面兩級篩選所鑒定出的衍生多肽的比活性,將親和純化的多肽在不同溫度下進行預(yù)溫育,然后分析它們在25°C下活化Rubisco的能力。由于Rubisco活化酶以時間依賴性方式催化失活的Rubisco,對每個反應(yīng)以三分鐘時間間隔監(jiān)測15分鐘。Rubisco活化酶:Rubisco的比例設(shè)定為1:40,類似于植物葉子中的比例。野生型Rubisco活化酶(SEQIDNO:2)和Rubisco活化酶衍生多肽的熱穩(wěn)定性在表2中顯示。熱穩(wěn)定性百分數(shù)代表40°C下被Rubisco活化酶活化的Rubisco的量占25°C下被Rubisco活化酶活化的Rubisco的量的百分數(shù)。實施例2:Rubisco活化酶衍生多肽的體外表征將實施例6.1中分離的Rubisco活化酶衍生多肽在三個不同的測定中進行體外試驗,以測定它們在25。C和40°C下的比活性及熱穩(wěn)定性(t.s.)。在所有情況中都將用野生型Rubisco活化酶在25°C下獲得的結(jié)果設(shè)定為100%。失活Rubisco的活化。將純化的Rubisco活化酶衍生多肽按實施例1第一級測定所述進行測定,例外的是在進行Rubisco活化性能測定前先將衍生多肽在40。C或45。C下溫育15、30、45或60分鐘。結(jié)果在表3的第2-4列顯示。表3的第2列代表在將失活Rubisco與Rubisco活化酶在25°C下溫育后獲得的活化Rubisco的量。沒有使用到升溫條件。表3的第3列代表15分鐘的40。C熱處理后被Rubisco活化酶活化的Rubisco的量占25。C下被Rubisco活化酶活化的Rubisco的量的百分數(shù)。表3的第4列代表45分鐘的40°C熱處理后被Rubisco活化酶活化的Rubisco的量占沒有進行熱處理(在25°C下)時被Rubisco活化酶活化的Rubisco的量的百分^:。Rubisco活化酶衍生多肽301C7和382D8的Rubisco活化作用在40°C和45°C處理下顯示出高的熱穩(wěn)、定性(圖IA)。382D8在45。C處理后的活性比在相同溫度下處理的RCA1高80%,比在25。C下溫育的RCA1的活性只低10%。在催化條件下的Rubisco活化。將純化的Rubisco活化酶衍生多肽按實施例1第一級測定所述進行測定,例外的是測定是在升溫條件(即40。C)下進行(Crafts-Brandner和Salvucci,(2000)/WJS97:13430-13435)。結(jié)果在表3的5-6列顯示。表3的第5列代表在將失活Rubisco與Rubisco活化酶在25。C下溫育后獲得的活化Rubisco的量。沒有使用到升溫條件。表3的第6列代表在40。C進行測定時被Rubisco活化酶活化的Rubisco的量占在25°C下進行測定時被Rubisco活化酶活化的Rubisco的量的百分數(shù)。野生型RCA在40°C下保持0.5的Rubisco活化狀態(tài),而Rubisco活化酶衍生多肽183H12、301C7和382D8在相同條件下能夠保持0.62-0.72的活化狀態(tài)(圖1B)。相對于在25。C下的反應(yīng),熱穩(wěn)定性變體在40°C下保持78-98%的Rubisco活化狀態(tài),而野生型的酶保持70%。在25。C或40°C下都顯示最高比活性的蛋白質(zhì)是在第一4侖分離的最好變體183H12。ATP酶活性。由于Rubisco活化酶是需要ATP來松開Rubisco與糖-磷酸的結(jié)合的ATP酶(多肽中含有AAA+結(jié)構(gòu)域),因此測試了溫度對Rubisco活化酶的ATP水解作用的影響。監(jiān)測活化酶復(fù)合物的內(nèi)在活性而不管其與Rubisco的相互作用的ATP酶測定,常被用于Rubisco活化酶表征。按Salvucci((1992)所oc/ze肌所o;^^.298:688-696)的描述進行了ATP酶測定。結(jié)果在表3的7-8列顯示。表3的第7列代表將Rubisco活化酶與ATP在25°C下溫育后所存在的水解ATP的量。沒有使用到升溫條件。表3的第8列代表在與經(jīng)過40°C熱處理的Rubisco活化酶溫育后所存在的水解ATP酶的量,表示為占與不經(jīng)熱處理的Rubisco活化酶溫育后所存在的水解ATP酶的量的百分數(shù)。圖1C顯示,Rubisco活化酶衍生多肽301C7和382D8在35°C和40°C下穩(wěn)定性與RCAl相比提高了超過10倍,而183H12在25。C和40。C下分別顯示20%和30°/"是高。實施例3:Rubisco活化酶缺失突變體的互補為了在對缺失而言純合的背景(z^^/Aca)(參見Li等,(2001)尸/a"f/.27:235-242)中表達改組的變體,開發(fā)了以下互補級聯(lián)(complementationcascade):l)采用單葉96孔DNA提取方法(Xin等,(2003)所orec/zw々wes34:820-826),通過HTP-PCR,以針對野生型和缺失等位基因的特異性引物,針對缺失對雜合植林進行選擇;2)用目的基因進行轉(zhuǎn)化;3)進行抗生素抗性的T0選擇,并進行純合性的PCR分析;4)將所得的純合植株進行自花授粉,以獲得T1轉(zhuǎn)基因抹系。對野生型、雜合和純合植抹(遺傳背景分別為7C4/AC4、iC4/z/rca^zlrca/Aca)的免疫印跡分析揭示,基因產(chǎn)物(長形式和短形式)在野生型和雜合植林中表達的水平相似(圖2A)。在對缺失而言純合的植抹中不存在短同種型和長同種型,這證實突變把RCA1和RCA2的表達消除了。Aca植林與野生型相比,在環(huán)境C02下生長時顯示較低的光合作用性能(Fq,/Fm,值)(分別為0.185±0.038和0.332±0.033)(圖2B),在土壤上生長3周后葉子面積顯著較低(分別為2.93±0.49和395.4±8.75mm"(圖2C)。兩月齡zlrca純合植抹與野生型植林相比生長嚴重矮小,且發(fā)生萎黃病(圖2D)?;趯θ笔蔚男蛄蟹治龊妥鲌D,設(shè)計了兩套引物RCA引物(正向引物5,-CAGACAATGTTGGCCTC-3,(SEQIDNO:23)和反向引物5,-ACGAGTAACGATGGTAGG-3,(SEQIDNO:24)),它們對野生型等位基因特異,產(chǎn)生1.5kb產(chǎn)物;和rca引物(正向引物5,-GTCTATACCTTGAGC-3,(SEQIDNO:25)和反向引物5,-TCAGTCATACTCGG-3,(SEQIDNO:26)),它們在缺失型等位基因產(chǎn)生1.5kb產(chǎn)物,在野生型等位基因產(chǎn)生4.9kb產(chǎn)物(圖3A)。為了用rca引物擴增1.5kb產(chǎn)物但不擴增4.9kb產(chǎn)物,將PCR擴增循環(huán)設(shè)定為1.5分鐘。將這兩套引物用于表征T1植林的遺傳背景。由于轉(zhuǎn)化宿主對內(nèi)源"a基因座的缺失而言是雜合的,表達Rubisco活化酶轉(zhuǎn)基因的Tl植林是野生型(AC4/RC4)、雜合體CRC4/Aca)和純合體(z^ca"rca)的混合體。用PCR篩選(圖3B)和免疫印跡分析(圖3C)已鑒定出在不同遺產(chǎn)背景中表達改組變體183H12的轉(zhuǎn)基因抹系。在含有至少一個野生型等位基因的遺傳背景中表達i83H12的植4朱(#13;wt,#12;對缺失而言是雜合的),同時具有酶蛋白質(zhì)的短形式和長形式。在抹系#2(對缺失而言是純合的)中只檢測出短形式,因為轉(zhuǎn)基因被設(shè)計成只表達酶蛋白質(zhì)的短形式。實施例4:Rubisco活化酶衍生多肽的植物內(nèi)(7np/朋to)表征為測定提高的Rubisco活化酶在正常溫度和升溫下的作用,使用了擬南芥Rubisco活化酶缺失突變林(zfrca)(參見實施例3)。用野生型Rubisco活化酶(SEQIDNO:l)、第一輪Rubisco活化酶衍生多肽183H12(SEQIDNO:7)和兩種第二輪382D8(SEQIDNO:15)和301C7(SEQIDNO:19)對z/rca進行功能互補。為了在轉(zhuǎn)基因擬南芥植抹C^ca)中表達野生型Rubisco活化酶和Rubisco活化酶書亍生多肽,將編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽和rc"7或^f汙生多肽的編碼區(qū)的轉(zhuǎn)基因與雙增強子結(jié)構(gòu)域(doubleenhancerdomain)(Day&Maiti,(1999)rraragemb3:61-70)、UBQ3終止子和卡那霉素抗性基因"/rtl—起,克隆到含有Mirabilis花椰菜花葉病毒(MirabilisMosaicCaulimovirus,MMV)啟動子的pMAXY4384中。采用floraldipping方法(Clough等,(1998)i^""16:735-743),用根瘤土壤桿菌GV3101菌林轉(zhuǎn)化雜合的DeleteageneRCA突變抹。為證實表達,將蛋白質(zhì)從液N2和1ml的提取緩沖液(IOOmMTricine-KOHpH8,EDTApH8,10mM2-巰基乙醇和蛋白酶抑制劑cocktailSetV)中的植物組織(2-3g鮮重)中提取。將粗提取物4妄連在3000g下離心5分鐘和12,000g下離心20分鐘進行澄清。取IO微克的可溶性蛋白質(zhì)提取物在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行分離后,轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(按照Invitrogen所提供的說明書)。用重組擬南芥RCAl產(chǎn)生的多克隆抗體對印跡進行免疫裝飾,用Ap綴合底物試劑盒(Bio-Rad)檢測蛋白質(zhì)。如圖4A所示,野生型植抹(iC4/RC4)表達活化酶的短形式和長同種型,而用轉(zhuǎn)基因進行互補的轉(zhuǎn)基因抹系只表達43kDa短同種型。在22°C培養(yǎng)條件下(植林在16小時光照(225iLimol光子m—2s")/8小時黑暗循環(huán)中生長),轉(zhuǎn)基因抹系顯示出與野生型未轉(zhuǎn)化植4朱相似的生長速度(圖4B)。用葉綠素熒光成像系統(tǒng)(Fluorlmager,QubitSystems)按先前的描述(Baker等,(2001)52:615-621)分析光合作用性能(光合系統(tǒng)II運行效率Fq,/Fm,)和生長速度。表達RCA1或者Rubisco活化酶衍生多肽183H12、301C7或382D8的轉(zhuǎn)基因缺失林系(分別為々c"RCAl、z/rc"183H12、Jrca301C7和z/rca382D8)的Fq,/Fm,值與野生型未轉(zhuǎn)化植株相似,表明短形式的表達足以在正常生長條件下對々ca進行功能互補(圖4C)。在這些條件下,通過便攜式紅外氣體分析儀(LI6400,Li-Cor)在150pmol光子m—2s"和350(abarC02下測量的zlrcGRCAl-l的光合作用活性與Acal83H12-3、Jrc"301C7-3和z^ca382D8-l相似(圖4D)。將z/rcaRCAl-l暫時暴露于30。C1小時導(dǎo)致其光合作用下降12%。相反,zJrcal83H12-3、zlrc^301C7-3和z^ca382D8-l林系在30。C下1小時后顯示光合作用增加16、22和16%。由于將擬南芥植林暴露于30。C會造成熱激蛋白的少量誘導(dǎo)(通常在32。C及以上被誘導(dǎo))和對氣孔開度的些微影響(Salvucci等,(2001)尸/""fP/^/0/.127:1053-1064),用表達野生型或熱穩(wěn)定性Rubisco活化酶的擬南芥植林進行在長時間熱處理下的生長。將四周齡轉(zhuǎn)基因林系暴露于中度熱應(yīng)激兩周時間。生長條件為16小時光照(225(imol光子m-、")和8小時黑暗。在光循環(huán)中,檔^朱在22。C下生長6小時,然后快速升溫到30°C(每分鐘2。C)生長4小時,然后再返回22。C生長至光循環(huán)結(jié)束。在黑暗循環(huán)中,植抹保持在22。C下。按先前的描述(Barth等,(2003)/fw^/—.91:36-42)進行生長、生物量和產(chǎn)量的表征。各植林顯示正常的表現(xiàn)型和葉子顏色,但大小各異(圖5A)。相比于野生型未轉(zhuǎn)化植林和表達Rubisco活化酶衍生多肽的zJrca株系,々caRCAl(抹系1、8和9)矮小(圖5B)。表達具有最高體外比活性的183H12-3的轉(zhuǎn)基因擬南芥是最大的植林。表達301C7和382D8的抹系比drcaRCAl林系大,但沒有達到183H12林系的葉子面積水平。盡管僅表達野生型基因的短形式(RCAl)的Aca林系比野生型未轉(zhuǎn)化林系(同時表達長形式和短形式)小,但大多數(shù)表達Rubisco活化酶衍生多肽的轉(zhuǎn)基因抹系顯示出比野生型未轉(zhuǎn)化植抹更大的葉子面積(圖5B),且所有表達Rubisco活化酶衍生多肽的林系都比表達RCA1的z)rca轉(zhuǎn)化林顯著更大(/M).01)。暴露于兩周的中度熱應(yīng)激的四周齡植林也顯示出植物發(fā)育速度上的差異。在處理期結(jié)束時,分別有74、44和33。/。的z!rcal83H12、Aca301C7和Ac"382D8具有成熟花序,花朵張開,而100%的未轉(zhuǎn)化野生型植林和88%的AcaRCAl抹系具有形成中的不成熟花序,花朵不張開(數(shù)據(jù)未顯示)。另外,12。/。的z/w"RCAl抹系處于營養(yǎng)階段,沒有可見的花序。在正常生長條件下,擬南芥植物在四周后開花。因此,顯示正常發(fā)育的zJrcal83H12、Ac"301C7和Aca382D8林系占相對較高的百分比,這很可能是因為RCA的熱穩(wěn)定性提高所致,該熱穩(wěn)定性使得對中度熱應(yīng)激條件下的光合作用和生長的抑制減至最低。對每種變體的最佳株系進一步分析其在中度熱應(yīng)激循環(huán)(30。C下2小時后)中的光合作用活性。轉(zhuǎn)基因抹系顯示出與葉子面積相關(guān)的C02固定模式。Acal83H12-3、zJ簡301C7-3和d腦382D8-l林系C02固定速度分別比zlrcaRCAl-l林系高30、25和23%。這些結(jié)果證明Rubisco活化酶在實驗條件下是光合作用的限制性因素。暴露于中度熱應(yīng)激8周時間的各個成熟植林(IO周齡)其外觀相似。相比于ArcaRCAl-l,在Arcal83H12-3、Arca301C7-3和厶rca382D8-l抹系中檢測到對植抹高度的稍微正向的影響(分別為116、121和119%)(圖5D)。在每抹植株的長角果數(shù)量上觀察到巨大的差異,Arcal83H12-3、Arca301C7-3和Arca382D8-l分別為130.8±48.2、84.3±19.6和100.8土26.9,與此對比,ArcaRCAl-l和野生型分別為40.2±16.3和47.5土15.8(圖5E)。為證實表達提高的RCA的轉(zhuǎn)化體中長角果形成的相對提高并不是以犧牲單顆種子大小為代價獲得,比較了1000顆種子沐1:的重量。如圖5F所示,Arcal83H12-3和Arca382D8-l產(chǎn)生的種子比ArcaRCAl-l稍大(分別大18和32%),而Arca301C7-3和野生型植抹的種子重量與△rcaRCAl-1相似。為進一步分析提高的RCA對中度溫度應(yīng)激下的生長的影響,使在25。C下(體外)表達最具活性的克隆的T3抹系183H12在26。C和比前面的實驗更高的光強度和濕度下連續(xù)生長。生長的條件是26°C和85%濕度下16小時光照(300pmol光子m'2s")和8小時黑暗。野生型和zfrcaRCAl抹系在26。C下生長比起在正常生長條件下生長,產(chǎn)生的總生物量稍有下降,顯示植抹發(fā)育速度較慢,而Acal83H12的各植株的生物量和發(fā)育過程不變(未顯示)。與此對比,26。C下生長的z^c"植抹產(chǎn)生的每林長角果數(shù)量受到它們所表達的Rubisco活化酶衍生多肽的巨大影響(圖6A)。Acal83H12抹系比z^c"RCAl林系每林多出50-100顆長角果,比野生型植林多出40-80顆長角果。另外,Jrcal83H12的長角果比野生型植林和AcaRCAl林系的大,且產(chǎn)生更多的種子(圖6B)。26。C下生長的zlrcal83H12的長角果顯示出其表現(xiàn)型與正常生長條件下生長的野生型相似,但產(chǎn)生的種子較少。觀察到在正常生長條件下,表達RCA1和183H12的drca林系其種子重量比野生型植株稍有下降(圖6C;白色棒條)。但是,觀察到在連續(xù)暴露于26。C下,z(rol83H12的各抹系的種子重量比野生型植林或zJrcaRCAl的各林系大50%-150%。將26°C下生長的每個4^系的種子重量與22°C下生長的相同4朱系的種子重量進行比4交發(fā)現(xiàn),z]rcal83H12-2、Ac"183H12-3和zlrral83H12-20抹系比^caRCAl林系或野生型明顯不受更高生長溫度的影響。由于暴露于26°C導(dǎo)致產(chǎn)生小的長角果,所含種子數(shù)量較少,種子重量也小,故用發(fā)芽試驗分析種子發(fā)育能力。收集在正常生長條件和在26°C下生長的野生型、AcaRCAl-l和zlrcal83H12-3植抹的種子,然后在22°C下發(fā)芽。在22°C下生長的^r"RCAl-l和zlrc"183m2-3親本林系的種子顯示相同的發(fā)芽率(86%),這比野生型植林(94。/。)稍低(圖6C)。從26。C下生長的zlrcaRCAl-l親本收集的種子觀察到發(fā)芽被完全抑制(4%),而野生型種子被顯著抑制(26%)。相反,從26°C下生長的zlrcal83H12-3親本收集的種子顯示70%的相對較高的發(fā)芽率。另外,還分析了檔4朱在以下生長條件下的光合作用速度、生長速度和種子產(chǎn)量。正常條件:植株在22。C下按16小時光照(225)imol光子m-2s")和8小時黑暗方案生長。升溫條件:植林在正常生長條件下生長兩周,然后轉(zhuǎn)移到生長箱中按16小時光照(225jiimol光子m々s")和8小時黑暗方案生長。在光照循環(huán)中,溫度設(shè)定至22°C保持6小時,然后快速升溫至30。C(每分鐘2。C),保持4小時。熱處理后,溫度設(shè)定回22。C。連續(xù)升溫條件:植抹在正常生長條件下生長兩周,然后轉(zhuǎn)移到生長室中按16小時高光照(300(imol光子nf2s")和8小時黑暗方案生長。在光照/黑暗循環(huán)中,溫度設(shè)定為26。C,適當設(shè)定為80%。以下總結(jié)對上述各條件下的Rubisco活化酶衍生多肽活性的植物內(nèi)測定的結(jié)果。生長速度。使用葉綠素熒光成像系統(tǒng)(Fluorlmager,QubitSystemInc.)測量葉子面積。將未轉(zhuǎn)化野生型植林在不同生長條件下觀察到的葉子面積設(shè)定為100%。表4中的數(shù)據(jù)證明,表達三種Rubisco活化酶衍生多肽的任何一種的植抹與野生型植抹或表達轉(zhuǎn)基因的野生型Rubisco活化酶的植林相比,在升溫條件下生長速度提高。光合作用速度。用便攜式紅外氣體分析儀(LI6400,Li-Cor)分析各植林的C02固定情況15分鐘。光源設(shè)定為225|imol光子m々s",通過內(nèi)置的C02注入系統(tǒng)供應(yīng)到葉子的C02水平為SSO^nolm-Ss-L表5中的數(shù)據(jù)證明,表達三種Rubisco活化酶衍生多肽的任何一種的植林與野生型植林或表達轉(zhuǎn)基因的野生型Rubisco活化酶的植抹相比,在升溫條件下光合作用速度提高(參見第3列)。種子產(chǎn)量。從成熟的千燥植林測定種子重量(mg)。種子發(fā)芽率通過在補充以卡那霉素的MS板上發(fā)芽的植抹的數(shù)量進行測定。表5中的數(shù)據(jù)證明,表達三種Rubisco活化酶衍生多肽的任何一種的植林與野生型植林或表達轉(zhuǎn)基因的野生型Rubisco活化酶的植抹相比,在升溫條件下種子產(chǎn)量提高(參見第4列)。表達三種Rubisco活化酶衍生多肽的任何一種的植抹在連續(xù)升溫條件下也出現(xiàn)種子產(chǎn)量的提高(參見表6)。表達Rubisco活化酶衍生多肽183H12(SEQIDNO:7)的植抹與野生型植林或表達轉(zhuǎn)基因的野生型Rubisco活化酶的植抹相比,在連續(xù)升溫條件下種子發(fā)芽率提高(參見表7)。表l:密碼子表<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表2:氨基酸置換對Rubisco活化酶活性和熱穩(wěn)定性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>M0。C下的活化Rubisco的數(shù)量占25°C下的活化Rubisco的數(shù)量的百分數(shù)。表3:Rubisco活化酶衍生多肽的相對活性(%)<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>表4:正常和升溫條件下的葉子面積<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>*擬南芥未轉(zhuǎn)化野生型的葉子面積設(shè)定為100%。表5:正常和升溫條件下光合作用速度和種子產(chǎn)量<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>:在30°C下2小時后監(jiān)測凈光合作用。#升溫條件下生長的植林的1000顆種子重量占正常條件下生長的植抹的1000顆種子重量的百分凄t表6:正常和連續(xù)升溫條件下的種子產(chǎn)量<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>表7:從正常和連續(xù)升溫條件下生長的植抹收獲的種子的發(fā)芽率<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>權(quán)利要求1.一種分離的核酸分子,所述核酸分子包含SEQIDNO3、5、7、9、11、13、15、17、19、21中的任何一個或其互補序列。2.—種分離的核酸分子,所述核酸分子選自a.包含這樣的核苷酸序列的核酸分子,該核苷酸序列與SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21中的任何一個或其互補序列的核苷酸序列有至少95%同一性;b.編碼這樣的多肽的核酸分子,所述多肽包含SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22中的任何一個的氨基酸序列;c.在嚴格條件下與這樣的核酸探針雜交的核酸分子,所述核酸探針由SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21中的任何一個或其互補序列的核苦S交序列組成。3.權(quán)利要求1或2的分離的核酸分子,其中所述核酸分子編碼與SEQIDNO:2的多肽相比熱穩(wěn)定性」提高的多肽。4.一種載體,所述載體包含權(quán)利要求1或2的核酸分子。5.權(quán)利要求4的載體,所述載體是表達栽體。6.—種宿主細胞,所述宿主細胞包含權(quán)利要求4的載體。7.—種分離的多肽,所述多肽包含SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22中的任何一個。8.—種分離的多肽,所述多肽選自a.與SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22中的任何一個的氨基酸序列有至少95%同一性的多肽;b.由這樣的核酸分子編碼的多肽,所述核酸分子包含與SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21中的4壬何一個或其互補序列有至少95%同一性的核普酸序列;c.由這樣的核酸分子編碼的多肽,所述核酸分子在嚴格條件下與由SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21中的任何一個或其互補序列的核苷酸序列組成的核酸揮3十雜交。9.權(quán)利要求7或8的分離的多肽,其中所述多肽與SEQIDNO:2的多肽相比熱穩(wěn)定性提高。10.—種轉(zhuǎn)基因植物,所述轉(zhuǎn)基因植物包含的轉(zhuǎn)基因表達a.SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22中的任何一個的多肽;或b.SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21中的任何一個的核酸分子。11.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)基因植物,其中所述植物選自玉米、西紅柿、馬鈴薯、水稻、大豆、棉花、向日葵、苜蓿、萵苣、卡諾拉油菜、高粱或煙草植物。12.權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因植物,其中所述轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因植物相比耐熱性提高。13.—種轉(zhuǎn)基因植物,所述轉(zhuǎn)基因植物包含的轉(zhuǎn)基因表達c.權(quán)利要求8的多肽,或d.權(quán)利要求2的核酸分子。14.權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因植物,其中所述植物選自玉米、西紅柿、馬鈴薯、水稻、大豆、棉花、向日葵、苜蓿、萵苣、卡諾拉油菜、高粱或煙草植物。15.權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因植物,其中所述轉(zhuǎn)基西植物與非轉(zhuǎn)基因才直物相比耐熱性提高。16.—種提高植物的耐熱性的方法,所述方法包括在該植物中表達SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22中的任何一個的多肽。17.權(quán)利要求16的方法,其中所述多肽在該植物的一個或一個以上質(zhì)體中表達。18.權(quán)利要求16的方法,其中所述多肽的表達導(dǎo)致在升溫條件下光合作用速度提高。19.權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因植物,其中所述植物的內(nèi)源核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活化酶的表達或活性被向下調(diào)節(jié)。20.權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因植物,其中所述植物的內(nèi)源核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活化酶的表達或活性被消除。全文摘要本發(fā)明提供與擬南芥核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活化酶多肽有關(guān)的熱穩(wěn)定性多肽。還提供了編碼本發(fā)明多肽的核酸。本發(fā)明還涵蓋使用本發(fā)明的多肽和核酸來提高植物對熱應(yīng)激的抗性的方法。文檔編號C12N15/82GK101292027SQ200680039176公開日2008年10月22日申請日期2006年8月22日優(yōu)先權(quán)日2005年8月24日發(fā)明者G·朱,I·庫雷克,L·劉申請人:先鋒高級育種國際公司