本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是針對(duì)一種基于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的質(zhì)粒消除模塊的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、游離型質(zhì)粒是動(dòng)植物、微生物細(xì)胞遺傳操作的通用平臺(tái)，可用于基因組編輯、異源蛋白表達(dá)、基因電路搭建等目的。但當(dāng)使用基因組編輯或基因電路質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)基因組編輯或基因電路設(shè)計(jì)目的后，搭載在質(zhì)粒上的基因組編輯工具或基因電路就成了細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定因素，此時(shí)需要對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行消除，以獲得無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞?，F(xiàn)行的質(zhì)粒消除技術(shù)主要分為3種，分別是溫敏復(fù)制子質(zhì)粒消除、sacb質(zhì)粒消除以及crispr蛋白相關(guān)質(zhì)粒消除技術(shù)。

2、溫敏復(fù)制子質(zhì)粒消除效率偏低，常用于低拷貝質(zhì)粒消除，對(duì)于中高拷貝質(zhì)粒消除效果不佳。且同個(gè)細(xì)胞內(nèi)同種復(fù)制子一般只能同時(shí)服務(wù)一種質(zhì)粒，若用溫敏復(fù)制子服務(wù)多種質(zhì)粒則可能加劇質(zhì)粒的自發(fā)丟失，不利于相關(guān)實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)工作的開(kāi)展。

3、基于sacb基因質(zhì)粒消除能同時(shí)服務(wù)于多個(gè)質(zhì)粒，但當(dāng)多種質(zhì)粒存在細(xì)胞內(nèi)時(shí)，基于sacb基因的質(zhì)粒消除方法無(wú)法準(zhǔn)確的消除特定種類(lèi)的質(zhì)粒，且其對(duì)突變的耐受能力較弱，容易出現(xiàn)失效的情況。

4、基于crispr蛋白的質(zhì)粒消除技術(shù)能夠同時(shí)消除多種質(zhì)粒，并自由選擇需要消除的質(zhì)粒種類(lèi)，但存在crispr蛋白基因突變失效或crispr蛋白切割脫靶的風(fēng)險(xiǎn)，且crispr相關(guān)蛋白元件基因序列較長(zhǎng)，不利于在難以轉(zhuǎn)入大質(zhì)粒的底盤(pán)微生物中使用。當(dāng)?shù)妆P(pán)細(xì)胞內(nèi)無(wú)天然crispr蛋白可利用時(shí)，需要額外的轉(zhuǎn)入帶有crispr蛋白的質(zhì)粒，而帶crispr蛋白的質(zhì)粒自靶向消除失敗率較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提出了一種基于反義rna的質(zhì)粒消除技術(shù)，設(shè)計(jì)了質(zhì)粒消除模塊的應(yīng)用，該模塊能促進(jìn)細(xì)胞中游離型質(zhì)粒發(fā)生丟失，能高效實(shí)現(xiàn)多種游離型質(zhì)粒的選擇消除或同步消除，能應(yīng)用于真核、原核細(xì)胞中的不同種類(lèi)(拷貝數(shù))游離型質(zhì)粒的選擇消除或同步消除，對(duì)于序列突變的耐受性?xún)?yōu)于基于crispr蛋白的質(zhì)粒消除技術(shù)。相關(guān)蛋白元件基因序列長(zhǎng)度小于crispr，對(duì)于難以轉(zhuǎn)入大質(zhì)粒的底盤(pán)細(xì)胞依然適用。

2、針對(duì)代謝關(guān)鍵基因設(shè)計(jì)的反義rna，可以降低該代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)速率。在細(xì)胞擴(kuò)增和傳代時(shí)，質(zhì)粒隨機(jī)分配到子代，含有這種消除模塊的質(zhì)粒的子代細(xì)胞數(shù)量會(huì)越來(lái)越少，不含有該消除模塊的質(zhì)粒的子代細(xì)胞因生長(zhǎng)迅速會(huì)變得越來(lái)越多，從而達(dá)到富集無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒消除的目的。

3、本發(fā)明設(shè)計(jì)的質(zhì)粒消除模塊，除反義rna表達(dá)區(qū)域須部署在待消除質(zhì)粒上以外，其余區(qū)域部署于待消除質(zhì)粒所在的細(xì)胞內(nèi)即可。完成部署后，本發(fā)明設(shè)計(jì)的質(zhì)粒消除模塊可在部署范圍內(nèi)高效的實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒消除。

4、本發(fā)明的意義在于提出了一種便捷可用、可編程、適應(yīng)性廣、穩(wěn)定性強(qiáng)、所需序列較短的通用的質(zhì)粒消除模塊構(gòu)建思路，在滿(mǎn)足前置條件的情況下，該質(zhì)粒消除模塊可用于基因工程菌構(gòu)建后的構(gòu)建質(zhì)粒消除、人工構(gòu)建的質(zhì)粒消除。

5、為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

6、一種基于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的質(zhì)粒消除模塊的應(yīng)用，用于一種指定對(duì)象質(zhì)粒的選擇性消除或幾種指定對(duì)象質(zhì)粒的選擇性同步消除。

7、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，質(zhì)粒消除模塊包括兩類(lèi)相互獨(dú)立的表達(dá)區(qū)域，其中一類(lèi)區(qū)域?yàn)檎T導(dǎo)因子轉(zhuǎn)錄區(qū)域，由誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子片段自帶的組成型啟動(dòng)子(包括rna聚合酶結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs)、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子翻譯區(qū)、終止子構(gòu)成；另一類(lèi)區(qū)域?yàn)榉戳xrna表達(dá)區(qū)域，包括與誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子相對(duì)應(yīng)的誘導(dǎo)因子啟動(dòng)子、反義rna及終止子構(gòu)成；所述反義rna為代謝關(guān)鍵基因mrna的反義rna，能與代謝關(guān)鍵基因mrna結(jié)合阻礙代謝關(guān)鍵基因mrna翻譯。

8、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子為阿拉伯糖轉(zhuǎn)錄因子。

9、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的誘導(dǎo)因子啟動(dòng)子為阿拉伯糖啟動(dòng)子。

10、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的反義rna表達(dá)區(qū)域搭載于待消除質(zhì)粒中。

11、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的待消除質(zhì)粒為細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定游離余基因組之外的能獨(dú)立復(fù)制，或隨基因組復(fù)制并被傳遞給子代細(xì)胞的環(huán)狀或線(xiàn)性dna。

12、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的待消除質(zhì)粒包括pet28a、pec-xk99e、酵母2μ質(zhì)粒中任意一項(xiàng)。

13、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的反義rna干擾的基因?yàn)榇x關(guān)鍵基因。

14、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的代謝關(guān)鍵基因?yàn)閠ca循環(huán)相關(guān)基因、蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因、有氧呼吸相關(guān)基因、無(wú)氧呼吸相關(guān)基因、脂質(zhì)合成相關(guān)基因、細(xì)胞壁合成相關(guān)基因、糖類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)基因、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)基因、atp合成相關(guān)基因、細(xì)胞骨架合成相關(guān)基因、nadph/nadp+合成相關(guān)基因、nadh/nad+合成相關(guān)基因、維生素合成相關(guān)基因、一碳轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因、二氧化碳固定相關(guān)基因、dna/rna合成相關(guān)基因、氨基酸合成相關(guān)基因、核糖合成相關(guān)基因、核糖體合成相關(guān)基因、核糖體組裝相關(guān)基因、氨酰trna合成酶相關(guān)基因及上述基因的同工酶基因。

15、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述質(zhì)粒消除模塊的消除對(duì)象為所有具備穩(wěn)定游離質(zhì)粒、游離質(zhì)粒有一定概率不會(huì)分配給子細(xì)胞、且游離質(zhì)粒消除不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡或無(wú)法增殖的微生物、動(dòng)物或植物細(xì)胞。

16、為便于本專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員理解本發(fā)明，主要詞匯解釋如下：

17、基因電路：將特定的基因元件如啟動(dòng)子、終止子、蛋白質(zhì)翻譯區(qū)、特定蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)按照一定規(guī)律組合在一起單位點(diǎn)或多位點(diǎn)布置以實(shí)現(xiàn)特定功能的dna序列的組合。

18、便捷可用：該模塊可以以pcr產(chǎn)物/質(zhì)粒等形式保存，可通過(guò)吉布森組裝、金門(mén)克隆、酶切酶連、基因組編輯等形式插入細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒上。

19、可編程：該模塊的使用不受質(zhì)?？截悢?shù)限制，且可通過(guò)組合不同的調(diào)控蛋白在含有復(fù)數(shù)種質(zhì)粒的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)選擇性消除。

20、適應(yīng)性廣：該模塊可通過(guò)密碼子優(yōu)化/替換相關(guān)控制的元件的形式跨物種使用。

21、穩(wěn)定性強(qiáng)：即使反義rna與目的mrna存在一定的序列偏差也不影響本發(fā)明提出的模塊的功能。

22、所需序列較短：當(dāng)使用細(xì)胞本底調(diào)控因子時(shí)，本發(fā)明提出的質(zhì)粒消除模塊序列總長(zhǎng)通?？尚∮?kbp，甚至小于100bp，當(dāng)自帶調(diào)控因子時(shí)，本發(fā)明提出的質(zhì)粒消除模塊序列總長(zhǎng)通常不會(huì)超過(guò)3kbp。

23、構(gòu)建質(zhì)粒：主要指搭在了基因組編輯必須功能蛋白用于輔助實(shí)現(xiàn)基因工程細(xì)胞基因組編輯目的的工具質(zhì)粒，這類(lèi)質(zhì)粒在完成工程細(xì)胞基因組編輯后通常需要消除，以避免在工程細(xì)胞應(yīng)用中引入或造成額外的突變。

24、人工構(gòu)建質(zhì)粒：主要是指不涉及基因組編輯的、人工搭建的表達(dá)同源/異源蛋白或一些功能基因電路的質(zhì)粒。

25、質(zhì)粒的骨架：搭載質(zhì)粒復(fù)制子與質(zhì)粒維持基因的dna序列。

26、游離質(zhì)粒：能在細(xì)胞中自主輔助或隨基因組共同復(fù)制，能伴隨細(xì)胞增殖分配給子細(xì)胞，且能穩(wěn)定游離余基因組之外的線(xiàn)性或環(huán)狀雙鏈dna。

27、組成型啟動(dòng)子：能被大腸桿菌σ因子識(shí)別并招募rna聚合酶亞基對(duì)下游進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的特定dna序列。

28、舉例說(shuō)明如下：

29、大腸桿菌相關(guān)序列：

30、大腸桿菌acnb基因干擾區(qū)全序列：

31、actatgacaatgagagcgaggagaaccgtcgtgctagaagaataccgtaagcacgtagctgagcgtgccgctgaggggattgcgcccaaacccctggatgcaaaccaaatggccgcacttgtagagctgctgaaaaacccgcccgcgggcgaagaagaattcctgttagatct(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

32、ggcgctgattggcaaactgccgacgccggaagagtaccagacctacgtggcgcaagta

33、gataaaactgccgttgatacttatcgttatctgaacttcaaccagctttctcagtacacc?gaaaaagccgatggggtgattttccagactgcggtttaa(seq?id?no：1)

34、pet28a質(zhì)粒全序列：

35、tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctt(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

36、taactttaagaaggagatataccatgtaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgc

37、tgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggg?gttttttgctgaaaggaggaactatatccggat(seq?id?no：2)

38、阿拉伯糖啟動(dòng)子序列(箭頭為轉(zhuǎn)錄起始方向)：

39、aagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttactggctcttctcgctaaccaaaccggtaaccccgcttattaaaagcattctgtaacaaagcgggaccaaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtctataatcacggcagaaaagtccacattgattatttgcacggcgtcacactttgctatgccatagcatttttatccataagattagcggatcctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctccat→(seq?idno：3)

40、t7終止子序列(箭頭為轉(zhuǎn)錄終止方向)：

41、→ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg(seq?id?no：4)

42、阿拉伯糖轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)框(包含啟動(dòng)子、cds區(qū)、終止子)：

43、ggatttctgttcatgggggtaatgataccgatggcgcacatttccccgaaaagtgccacctgcatcgatttattatgacaacttgacggctacatcattcactttttcttcacaaccggcacggaactcgctcgggctggccccggtgcattttttaaatacccgcgagaaatagagttgatcgtcaaaaccaacattgcgaccgacggtggcgataggcatccgggtggtgctca(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

44、cattgccgtcactgcgtcttttactggctcttctcgctaaccaaaccggtaaccccgctt

45、attaaaagcattctgtaacaaagcgggaccaaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaa?gtgtct(seqid?no：5)

46、谷氨酸棒桿菌相關(guān)序列：

47、谷氨酸棒桿菌acn基因cds區(qū)全序列：

48、ttggagctcactgtgactgaaagcaagaactccttcaatgctaagagcacccttgaagt

49、tggcgacaagtcctatgactacttcgccctctctgcagtgcctggcatggagaagctgc

50、cgtactccctcaaggttctcggagagaaccttcttcgtaccgaagacggcgcaaacatc(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

51、gagaacggcgacgtcgtcgagttcgacgcagttgtccgcatcgacaccccaggtgagg

52、ctgactactaccgccacggcggcatcctgcagtacgtgctgcgtcagatggctgcttctt?ctaagtaa(seq?id?no：6)

53、谷氨酸棒桿菌pec-xk99e質(zhì)粒序列：

54、gaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttgg

55、ctgttttggcggatgagagaagattttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaa

56、gcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgacccc(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

57、taattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttctggataatgttttttgcgccgacatcata

58、acggttctggcaaatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatg?tgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaccatg(seq?id?no：7)阿拉伯糖啟動(dòng)子序列(箭頭為轉(zhuǎn)錄起始方向)：

59、aagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttactggctct

60、tctcgctaaccaaaccggtaaccccgcttattaaaagcattctgtaacaaagcgggacc

61、aaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtctataatcacggcagaaaagtccaca

62、ttgattatttgcacggcgtcacactttgctatgccatagcatttttatccataagattagcggatcctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctccat→(seq?id?no：8)t7終止子序列(箭頭為轉(zhuǎn)錄終止方向)：

63、→ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg(seq?id?no：9)阿拉伯糖轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)框(包含啟動(dòng)子、cds區(qū)、終止子)：

64、ggatttctgttcatgggggtaatgataccgatggcgcacatttccccgaaaagtgccacc

65、tgcatcgatttattatgacaacttgacggctacatcattcactttttcttcacaaccggca

66、cggaactcgctcgggctggccccggtgcattttttaaatacccgcgagaaatagagttg(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

67、cttttcatactcccgccattcagagaagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgc

68、cgtcactgcgtcttttactggctcttctcgctaaccaaaccggtaaccccgcttattaaa

69、agcattctgtaacaaagcgggaccaaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtct(seq?id?no：10)

70、釀酒酵母相關(guān)序列：

71、釀酒酵母aco1/glu1基因cds區(qū)全序列：

72、atgctgtctgcacgttctgccatcaagagacccattgttcgtggtcttgcgacagtctcc

73、aacttgactagagattcaaaagtcaaccaaaacttattagaagatcattcttttattaac

74、tacaagcagaatgtggaaacgctggatatcgtaagaaaaagattaaacaggccatttac(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

75、gacagaatcgatattctgggtctagctgaattggctccaggtaagcctgtaacaatgag

76、agttcatccaaagaatggtaagccatgggatgctgtgttgacccatactttcaacgatga

77、gcaaattgaatggttcaaatatggttctgccttaaataaaattaaggccgatgagaagaaataa(seqid?no：11)

78、釀酒酵母2μ穿梭質(zhì)粒序列：

79、caactttgtatagaaaagttgacggattagaagccgccgagcgggtgacagccctccga

80、aggaagactctcctccgtgcgtcctcgtcttcaccggtcgcgttcctgaaacgcagatg

81、tgcctcgcgccgcactgctccgaacaataaagattctacaatactagcttttatggttatg(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

82、gccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctaggg

83、cgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcg?ccgctacagggcgcgtggggatcgatccactagt(seq?id?no：12)

84、釀酒酵母硫酸新霉素抗性基因序列(包含啟動(dòng)子、表達(dá)框、終止子)：gtgagttgagtatacatgcatttacttataatacagtttttcagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgtaaagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtcctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccattttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcctcgccgtcgggcatgctcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcattgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtgagatgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcttgcagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctgacagccggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgcccagtcatagccgaatagcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttcaatcatgatttatcttcgtttcctgcaggtttttgttctgtgcagttgggttaagaatactgggcaatttcatgtttctttcaacactacatatgcgtatatataccaatctaagtctgtgctccttccttcgttcttccttctg(seq?id?no：13)

85、穿梭載體大腸桿菌復(fù)制子序列：

86、tttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggt

87、ggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtg

88、cgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcggga

89、agcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgc

90、tccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccgg

91、taactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagcca

92、ctggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtgg

93、tggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagcca

94、gttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtag

95、cggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaa(seq?id?no：14)

96、穿梭載體氨芐青霉素抗性基因表達(dá)框(包含啟動(dòng)子、表達(dá)框、終止子)：ggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacggg(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

97、ttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatg

98、ccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttccttttt

99、caatgggtaataactgatataattaaattgaagctctaatttgtgagttgagtatacatgc(seq?idno：15)

100、釀酒酵母誘導(dǎo)型啟動(dòng)子gal1序列：

101、acggattagagccgccgagcgacgagcgagcggagcgcagcagcgccgaaggaagac

102、tctcctccgtgcgctcctcgtctcgtcttcaccggtcgtcgtcctgaaacgagatgtgtg

103、cctcgcgccgcactgctccgaacaataatacaataaagattctacaatactagctatggtt

104、atggttatgaagagaaaaatggcagtacctggccccaaacctcaaatgaacgaatcaat

105、taacaaccataggatgatgataatgcgattagttagcttattctatttctggggtaattaat

106、cagcgaagcgatgatgattttgatctattacagatatataatgcaaaactgcataaccact

107、taactaactaatataatactttcaacattttcgtgttgattacttcttatcaaatgtaatacaaaaattgtaatatatacctatactactactacttaacgtcaaggagacc(seq?id?no：16)酵母終止子cyc1序列：

108、atcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccg

109、aaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgtt

110、agtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacg

111、catgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagct(seq?id?no：17)

112、本發(fā)明的有益效果在于：

113、本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種基于反義rna的、模塊化的質(zhì)粒消除技術(shù)，構(gòu)建質(zhì)粒消除模塊所需元件簡(jiǎn)單易得，質(zhì)粒模塊消除效率高，可根據(jù)需要自由設(shè)置消除對(duì)象，可實(shí)現(xiàn)多種質(zhì)粒的選擇性或同步消除。且本發(fā)明應(yīng)用范圍廣，真核原核生物中均可應(yīng)用該技術(shù)，中心代謝途徑相關(guān)基因皆可結(jié)合反義rna用于質(zhì)粒消除，中心代謝途徑之外的氨基酸、核酸、脂質(zhì)合成途徑、轉(zhuǎn)錄翻譯、dna復(fù)制、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等代謝相關(guān)基因的反義rna同樣可應(yīng)用于本技術(shù)，還可通過(guò)增加反義rna種類(lèi)、延長(zhǎng)反義rna長(zhǎng)度等策略強(qiáng)化消除效果。