本發(fā)明屬于植物研究領(lǐng)域，具體屬于辣椒素合成研究實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域，更具體的，屬于一種驗(yàn)證光信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子cabbx2誘導(dǎo)辣椒素合成影響因素的實(shí)驗(yàn)方法。

背景技術(shù)：

1、瞬時(shí)沉默和瞬時(shí)過(guò)表達(dá)是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的兩種技術(shù)，特別是在基因功能研究、疾病模型建立以及藥物篩選等領(lǐng)域。瞬時(shí)轉(zhuǎn)化不會(huì)將外源基因整合到目標(biāo)受體的染色體中，是細(xì)胞水平的表達(dá)，轉(zhuǎn)化后可直接觀察鑒定，在植物中已有廣泛應(yīng)用。瞬時(shí)沉默是指將攜帶目的基因cdna的病毒載體侵染寄主植物后，通過(guò)激活植物自身免疫系統(tǒng)促使病毒rna降解，同時(shí)產(chǎn)生含內(nèi)源目的基因的microrna，這些microrna與細(xì)胞質(zhì)中同源rna特異性互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致同源mrna降解，從而發(fā)生轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默；瞬時(shí)過(guò)表達(dá)是指通過(guò)某種方法將外源基因?qū)爰?xì)胞，使其在短時(shí)間內(nèi)高效表達(dá)，從而研究該基因的功能或影響。這種技術(shù)通常利用質(zhì)粒、病毒載體等將目的基因?qū)爰?xì)胞，可應(yīng)用在啟動(dòng)子和調(diào)控元件的分析，如研究不同啟動(dòng)子或調(diào)控元件對(duì)基因表達(dá)的影響，及蛋白質(zhì)功能研究，利用過(guò)表達(dá)特定蛋白質(zhì)來(lái)研究其在細(xì)胞內(nèi)的功能和作用機(jī)制。

2、辣椒是我們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｒ?jiàn)的一種蔬菜，也是一味中藥材，有溫中散寒、開(kāi)胃消食的功效?，F(xiàn)代研究表明，辣椒具有抗炎、抗病毒、抗癌等功效，還具有較強(qiáng)的抗氧化作用和免疫調(diào)節(jié)作用，能夠促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、保護(hù)肝臟、提高機(jī)體免疫力，辣椒素類(lèi)物質(zhì)是辣椒屬植物特有的次生代謝產(chǎn)物，是決定辣椒品質(zhì)的重要因素，純辣椒素(類(lèi)物質(zhì))價(jià)值高達(dá)數(shù)萬(wàn)元每千克，因此提高辣椒素的含量可顯著提高辣椒的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

3、辣椒素合成有苯丙烷代謝和脂肪酸代謝兩條通路，辣椒中辣椒素主要有5種，分別是：辣椒素(capsaicin)、二氫辣椒素(dihydrocapsaicin)、降二氫辣椒素(nordihydrocap-saicin)、高辣椒素(homocapsaicin)、高二氫辣椒素(homodihydrocapsaicin)，辣椒素和二氫辣椒素二者約占辣椒素總量的90％，也提供了約90％的辣感和熱感，其含量高低直接影響辣椒及辣椒制品的辣度。

4、光信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子bbx指在植物中，能夠響應(yīng)光信號(hào)并調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)的bbx家族成員，cabbx2在植物中參與多種生物過(guò)程，包括光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控等，在現(xiàn)階段對(duì)研究光信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子cabbx2是否能誘導(dǎo)辣椒素合成這一結(jié)論沒(méi)有相關(guān)實(shí)驗(yàn)佐證，因此，需要一項(xiàng)新的技術(shù)改善這一現(xiàn)狀。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種光信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子cabbx2誘導(dǎo)辣椒素合成的方法，從而解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題。

2、本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)施：一種光信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子cabbx2誘導(dǎo)辣椒素合成的方法，具體為活體植株沉默cabbx2基因?qū)苯匪睾铣傻挠绊懙膶?shí)驗(yàn)方法；實(shí)驗(yàn)步驟如下：

3、s1.cabbx2-trv2沉默載體構(gòu)建：從辣椒cabbx2基因序列獲取cabbx2的特異性片段，以辣椒cdna為模板，采用flash?master?mix高保真酶通過(guò)pcr對(duì)cabbx2的特異性片段進(jìn)行擴(kuò)增，后純化回收得到cabbx2-trv2；使用限制性?xún)?nèi)切酶xba?i和sma?i對(duì)trv2載體雙酶切：分別加入反應(yīng)試劑吸打混勻并瞬時(shí)離心進(jìn)行反應(yīng)，跑膠確認(rèn)載體切開(kāi)以后，進(jìn)行純化回收得到酶切過(guò)的trv2載體；利用同源重組連接酶將cabbx2-trv2與酶切過(guò)的trv2載體進(jìn)行連接，通過(guò)熱激法將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α，用trv2通用引物鑒定陽(yáng)性單菌落，進(jìn)行測(cè)序及分析，將測(cè)序成功的菌落進(jìn)行擴(kuò)繁并用質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒trv:cabbx2沉默載體；

4、s2.trv:cabbx2沉默載體組及trv:00空載對(duì)照組的浸染液原料a、b的制備：將trv:cabbx2沉默載體、trv:00空載和trv1輔助表達(dá)載體分別涂板在含有卡納和利福平的lb固體培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)后進(jìn)行單菌落pcr檢測(cè)，挑取檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的單克隆接種至含有卡納和利福平的液體lb培養(yǎng)基中進(jìn)行過(guò)夜擴(kuò)增培養(yǎng)，再?gòu)闹形【褐梁邢鄳?yīng)抗生素的液體lb培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)繁，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液的od值，離心、收集菌體，使用預(yù)冷過(guò)的ddh2o清洗菌體，用含乙酰丁香酮的侵染液a重懸浮菌體得到含trv:cabbx2沉默載體的侵染液b及trv:00空載侵染液b1，trv1輔助表達(dá)載體侵染液b2，室溫黑暗靜置，再將浸染液b與浸染液b1分別與侵染液b2混合得到浸染液原料a及對(duì)照組浸染液原料b；

5、s3.遵辣一號(hào)辣椒的處理：待遵辣一號(hào)辣椒生長(zhǎng)出子葉時(shí)，用無(wú)針頭的注射器吸取侵染液浸染液原料a、浸染液原料b分別注入辣椒子葉背面；

6、s4.侵染后的處理：通過(guò)對(duì)辣椒采用先黑暗、弱光到正常光照方式提高沉默效率；

7、s5.授粉及取樣：待四母斗開(kāi)花時(shí)進(jìn)行人工授粉，并掛牌記錄授粉時(shí)間，授粉，取授粉后的辣椒果實(shí)，去除果柄、辣椒籽，將果皮及胎座剪碎液氮速凍，得到測(cè)定辣椒素含量及基因表達(dá)的樣品；

8、s6.cabbx2與辣椒素合成基因(at3，comt，acs，pal3)互作實(shí)驗(yàn)方法如下：構(gòu)建載體，將基因的啟動(dòng)子片段連接到pabai載體上，基因的啟動(dòng)子片段前引物前面加上kpni的識(shí)別序列—ggtacc和接頭，后引物前面加上x(chóng)hoi識(shí)別的序列—tctaga，利用辣椒cm334的基因組dna作為模板，擴(kuò)增獲得基因的啟動(dòng)子片段，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方式連接到pabai載體上作為釣餌，用bstbi和bbsi酶切pabai重組質(zhì)粒，同時(shí)加入磷酸化酶ap，一步法線(xiàn)性化和去磷酸化反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到y(tǒng)1hgold酵母細(xì)胞中，涂布在sd-ura培養(yǎng)基上，得到單克??；挑選單克隆至ypda液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖菌擴(kuò)繁得到菌液，吸取菌液離心集菌；將pgadt7空載質(zhì)粒、pgadt7：cabbx2重組載體轉(zhuǎn)入到上述含啟動(dòng)子-pabai載體的單克隆酵母菌株中，涂布在sd/-ura-leu培養(yǎng)基上，得到陽(yáng)性克隆；在存在aureobasidin?a(aba)抗生素濃度梯度(0-200ng/ml)的sd/-ura-leu培養(yǎng)基上點(diǎn)斑，篩選pgadt7不能正常生長(zhǎng)但pgadt7：cabbx2可以生長(zhǎng)的aba濃度；

9、s7.基因表達(dá)量檢測(cè)：提取步驟s5的樣品分子樣的rna，用瓊脂糖凝膠電泳儀檢驗(yàn)rna質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)rna濃度及純度；使用逆轉(zhuǎn)錄試劑將所獲得的rna反轉(zhuǎn)錄為cdna，放置于4℃保存；基因表達(dá)實(shí)時(shí)定量qrt-pcr實(shí)驗(yàn)：以合成的cdna第一鏈稀釋3倍作為模板，qcabbx2上游引物和qcabbx2下游引物組成的引物對(duì)檢測(cè)cabbx2基因；以辣椒肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)內(nèi)參基因的引物為qactin；

10、s8.辣椒素的測(cè)定：采用高效液相色譜法測(cè)定辣椒素；

11、s9.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)：首先，在sd-ura-leu培養(yǎng)基上點(diǎn)斑，篩選pgadt7不能正常生長(zhǎng)，但pgadt7：cabbx2可以生長(zhǎng)的aba濃度，證明cabbx2可以與該基因互作；

12、其次，根據(jù)trv:cabbx2沉默載體組及trv:00空載對(duì)照組授粉后不同時(shí)間的辣椒素含量數(shù)據(jù)顯示，在對(duì)活體辣椒授粉后33d，辣椒素的積累達(dá)到頂峰，沉默了cabbx2基因以后辣椒素的含量相對(duì)于trv2顯著下調(diào)，可評(píng)價(jià)為cabbx2與辣椒素的生物合成存在關(guān)聯(lián)；

13、最后，根據(jù)trv:cabbx2沉默載體組及trv:00空載對(duì)照組授粉后不同時(shí)間的辣椒素合成相關(guān)基因表達(dá)量數(shù)據(jù)顯示，cabbx2被有效沉默，沉默效率為40％-60％，且隨著cabbx2的沉默，辣椒素合成相關(guān)基因表達(dá)量也有不同程度的降低，在33d的數(shù)據(jù)中cacomt和caat3的表達(dá)量甚至與對(duì)照組相比下降了70％，可評(píng)價(jià)為cabbx2可通過(guò)調(diào)控辣椒素合成相關(guān)基因的表達(dá)從而影響辣椒素的合成。

14、進(jìn)一步的，步驟s1中pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃10s，55℃退火5s，72℃5s·1kb，34個(gè)循環(huán)；

15、pcr反應(yīng)體系：mix?25μl、f?2μl、r?2μl、模板2μl、再加入ddh2o至50μl；

16、所述反應(yīng)試劑為質(zhì)粒dna?20μl、10×nebbuffer?5μl、xba?i?1.5μl、sma?i?1.5μl、ddh2o?22μl；

17、所述瞬時(shí)離心后的反應(yīng)方式為37℃反應(yīng)3h。

18、進(jìn)一步的，步驟s2的具體步驟如下：

19、將trv:cabbx2沉默載體、trv:00空載和trv1輔助表達(dá)載體分別涂板在含有100mg/ml卡納和利福平的lb固體培養(yǎng)基上，于28℃倒置培養(yǎng)2-3d后進(jìn)行菌落pcr檢測(cè)；挑取檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的單克隆接種至含有100mg/ml卡納和利福平的液體lb培養(yǎng)基中進(jìn)行過(guò)夜擴(kuò)增培養(yǎng)，按照28℃，200r/min的條件進(jìn)行搖菌處理；

20、利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液的od值，直至od600介于0.8-1.0，離心、收集菌體，使用預(yù)冷過(guò)的ddh2o清洗兩遍菌體，用含150μm乙酰丁香酮的侵染液a重懸浮菌體得到含trv:cabbx2沉默載體的侵染液b及trv:00空載侵染液b1，trv1輔助表達(dá)載體侵染液b2，室溫黑暗靜置3h，再將浸染液b與浸染液b1分別與侵染液b2按1:1混合得到浸染液原料a及對(duì)照組浸染液原料b其中，侵染液a具體為10mm?mes，10mm?mgcl2，ph＝5.5。

21、進(jìn)一步的，步驟s4的具體步驟如下：

22、辣椒先在18℃黑暗培養(yǎng)56h，然后光強(qiáng)50μmol·m-2·s-1的弱光光照條件下適應(yīng)24h，再按光照周期12h，晝夜溫度22/20℃，光照為200μmol·m-2·s-1的條件在育苗室中栽培生長(zhǎng)；待對(duì)椒開(kāi)始長(zhǎng)花苞時(shí)，按照步驟s3對(duì)對(duì)椒結(jié)位周?chē)钠氯~進(jìn)行沉默，保證沉默效果。

23、進(jìn)一步的，步驟s5的具體步驟如下：

24、取授粉后16、25、33、38d的辣椒果實(shí)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)為25-30個(gè)果，去除果柄、辣椒籽，將果皮及胎座剪碎液氮速凍，得到樣品，備用。

25、進(jìn)一步的，步驟s6中一步法線(xiàn)性化和去磷酸化反應(yīng)體系為：10×fast?digstbuffer，2μl；bstbi和bbsi，各1μl；ap，1μl；pabai重組質(zhì)粒，10μl；ddh2o，5μl；一步法線(xiàn)性化和去磷酸化反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃，10min；65℃，15min；所述sd/-ura培養(yǎng)基、所述sd/-ura-leu培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為：30℃恒溫箱，2-3d；所述搖菌擴(kuò)繁得到菌液其反應(yīng)條件為30℃，180rpm，16h。

26、進(jìn)一步的，步驟s7的具體反應(yīng)參數(shù)如下：

27、使用10μl內(nèi)參基因的qrt-pcr反應(yīng)體系：sybr?5μl，ddh2o?3.4μl，10μm?primerf0.3μl，10μm?primerr?0.3μl，cdna?1μl；使用10μl內(nèi)參基因的qrt-pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min，95℃變性10s，40次循環(huán)，58℃退火45s，72℃延伸30s，基因相對(duì)表達(dá)量用相對(duì)定量分析法2-δδct的方法計(jì)算，步驟s7重復(fù)三次，得到最終試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

28、進(jìn)一步的，步驟s8的具體步驟如下：

29、準(zhǔn)確稱(chēng)量樣品10g于50ml離心管中，加入25ml?95％乙醇溶液，振蕩，用超聲波提取器提取30min，過(guò)濾，收集濾液；

30、將濾渣連同濾紙重新用25ml95％乙醇溶液經(jīng)超聲波提取器提取30min后，過(guò)濾，收集濾液，再重復(fù)一次；

31、將三次過(guò)濾收集的濾液合并，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至25ml，轉(zhuǎn)移至新的50ml離心管，用95％乙醇溶液定容至30ml，經(jīng)0.45μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾后進(jìn)行色譜分析；

32、將制備好的試液按照色譜條件測(cè)定，以峰面積積分值定量，計(jì)算辣椒素、二氫辣椒素、總辣椒素的最終含量。

33、其中，色譜參考條件為：色譜柱：ultimate?ods-3(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈：水＝7：3，用前過(guò)0.45μm濾膜，脫氣；流速：1ml/min；紫外檢測(cè)器：波長(zhǎng)280nm；進(jìn)樣量：10μl。

34、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配置過(guò)程如下：稱(chēng)取天然辣椒堿、二氫辣椒堿分別用甲醇配置為1mg/ml的母液，并稀釋成質(zhì)量濃度為0.2mg/l、1mg/l、10mg/l、20mg/l、40mg/l、80mg/l和160mg/l系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

35、有益效果

36、本發(fā)明通過(guò)對(duì)活體遵辣一號(hào)辣椒的cabbx2進(jìn)行沉默處理，采用trv:00空載對(duì)照組，通過(guò)對(duì)辣椒素含量及表達(dá)量的測(cè)定以及cabbx2與辣椒素合成基因互作實(shí)驗(yàn)，證明了cabbx2可以與辣椒素合成相關(guān)互作，并評(píng)價(jià)了活體植株沉默cabbx2的基因授粉后不同時(shí)間辣椒素含量在沉默了cabbx2基因以后辣椒素的含量相對(duì)于trv:00顯著下調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證了cabbx2的基因可影響辣椒素合成，隨著cabbx2的沉默，辣椒素合成相關(guān)基因表達(dá)量也有不同程度的降低，同時(shí)也驗(yàn)證了cabbx2可通過(guò)調(diào)控辣椒素合成相關(guān)基因的表達(dá)從而影響辣椒素的合成。