本發(fā)明涉及生物化學，具體涉及一種烯還原酶突變體、工程菌及其應用。

背景技術：

1、二肽基肽酶-iv(dpp-4)抑制劑是一類用于治療2型糖尿病的藥物，通過抑制胰高血糖素樣肽-1(glp-1)和葡萄糖依賴性促胰島素分泌多肽(gip)的滅活，提高內(nèi)源性glp-1和gip的水平，促進胰島β細胞釋放胰島素，同時抑制胰島α細胞分泌胰高血糖素，從而降低血糖。這類藥物具有不易引起低血糖和體重增加的優(yōu)點，因此在臨床上得到了廣泛的應用。其中一些常見的二肽基肽酶-4抑制劑包括西格列汀、沙格列汀、維格列汀和利格列汀等。

2、瑞士羅氏公司開發(fā)了一種新型的長效dpp-4抑制劑卡格列汀(carmegliptin)，該藥物對dpp-4的ic50值為6.8nmol/l，口服一日一次能夠安全有效地控制血糖，具有良好的市場預期，因此開發(fā)其高效且綠色的合成工藝具有重要的經(jīng)濟和社會價值。

3、從逆合成的角度分析，carmegliptin分子可由含氟的手性內(nèi)酯1和手性胺縮合而成，手性內(nèi)酯1可通過wittig反應串聯(lián)氟化和不對稱還原反應得到。酶催化具有高效、高選擇性、綠色環(huán)保等優(yōu)點，其中烯還原酶催化不對稱還原被廣泛用于藥物中間體和精細化學品的制備?，F(xiàn)有的烯還原酶難以催化4-氟甲基-2(5h)-呋喃酮的不對稱還原，其難點之一在于f原子的特殊性，f原子半徑與h原子十分接近，卻有著極強的電負性，可能會與酶蛋白中的極性氨基酸形成氫鍵，因此需要開發(fā)一種高產(chǎn)率的烯還原酶。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術中存在的上述技術問題，本發(fā)明提供一種烯還原酶突變體、工程菌及其應用，可催化不對稱還源，以制備卡格列汀中間體。

2、本發(fā)明第一方面公開了一種烯還原酶突變體，其特征在于，包括以下任一氨基酸序列：seq?id?no.3-seq?id?no.11。

3、本發(fā)明第二方面提供一種工程菌，包含有表達上述氨基酸序列的質(zhì)粒或基因序列。

4、優(yōu)選的，工程菌構建的方法包括：

5、基于所述野生型烯還原酶的基因序列進行定點突變，獲得烯還原酶突變體的基因序列；

6、將所述基因序列提純并連接到質(zhì)粒后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中，獲得工程菌。

7、優(yōu)選的，所述工程菌用于對底物4-氟甲基-2(5h)-呋喃酮進行還原，生成(s)-4-(氟甲基)二氫呋喃-2-酮。

8、優(yōu)選的，催化的反應條件為：

9、10-50g/l的工程菌濕細胞，1-20g/l底物，1.5-155g/l葡萄糖，ph?7-9,反應溫度為20-40℃，反應時間為10-36h。

10、優(yōu)選的，所述反應條件還包括10％,v/v異丙醇。

11、優(yōu)選的，(s)-4-(氟甲基)二氫呋喃-2-酮用于制備卡格列汀。

12、本發(fā)明第三方面提供上述工程菌的應用：(s)-4-(氟甲基)二氫呋喃-2-酮的制備，制備方法包括：通過上述工程菌對底物4-氟甲基-2(5h)-呋喃酮進行催化，獲得(s)-4-(氟甲基)二氫呋喃-2-酮。

13、優(yōu)選的，催化的反應條件為：

14、10-50g/l的工程菌濕細胞，1-20g/l底物，1.5-155g/l葡萄糖，ph?7-9,反應溫度為20-40℃，反應時間為10-36h。

15、優(yōu)選的，所述反應條件還包括10％,v/v異丙醇。

16、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：烯還原酶突變體的表達細胞對4-氟甲基-2(5h)-呋喃酮進行還原，生成(s)-4-(氟甲基)二氫呋喃-2-酮，克服由于f離子造成底物難以催化的問題。

技術特征：

1.一種烯還原酶突變體，其特征在于，包括以下任一氨基酸序列：

2.一種工程菌，其特征在于，包含有表達如權利要求1所述氨基酸序列的質(zhì)?；蚧蛐蛄?。

3.根據(jù)權利要求2所述的工程菌，其特征在于，工程菌構建的方法包括：

4.根據(jù)權利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌用于對底物4-氟甲基-2(5h)-呋喃酮進行還原，生成(s)-4-(氟甲基)二氫呋喃-2-酮。

5.根據(jù)權利要求4所述的工程菌，其特征在于，催化的反應條件為：

6.根據(jù)權利要求5所述的工程菌，其特征在于，所述反應條件還包括10％v/v異丙醇。

7.根據(jù)權利要求5所述的工程菌，其特征在于，(s)-4-(氟甲基)二氫呋喃-2-酮用于制備卡格列汀。

8.(s)-4-(氟甲基)二氫呋喃-2-酮的制備方法，其特征在于，通過如權利要求2或3所述工程菌對底物4-氟甲基-2(5h)-呋喃酮進行催化，獲得(s)-4-(氟甲基)二氫呋喃-2-酮。

9.根據(jù)權利要求8所述的制備方法，其特征在于，催化的反應條件為：

10.根據(jù)權利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述反應條件還包括10％v/v異丙醇。

技術總結
本發(fā)明公開了一種烯還原酶突變體、工程菌及其應用，屬于生物化學技術領域，所述烯還原酶突變體包括以下任一氨基酸序列：SEQ?ID?NO.3?SEQ?ID?NO.11。烯還原酶突變體的表達細胞對4?氟甲基?2(5H)?呋喃酮進行還原，生成(S)?4?(氟甲基)二氫呋喃?2?酮，克服由于氟離子造成底物難以催化的問題。

技術研發(fā)人員：王劍峰,陳曉陽,徐鑒,張瑜
受保護的技術使用者：杭州凱創(chuàng)生物科技有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/2