本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)，具體涉及一類光響應(yīng)組裝蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在自然界中，光響應(yīng)蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)膜電位、蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，在許多關(guān)鍵的生命過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。利用光作為精確、可逆和非侵入性的控制信號(hào)，已經(jīng)在光遺傳學(xué)和光生物化學(xué)方面取得了重大進(jìn)展，特別是在蛋白質(zhì)定位和神經(jīng)元活動(dòng)等分子和細(xì)胞過(guò)程的控制方面。此外，光響應(yīng)開關(guān)已被應(yīng)用于細(xì)胞外空間，用于創(chuàng)建響應(yīng)性的生物混合材料。這些蛋白質(zhì)的光感受能力通常由色素介導(dǎo)，這些色素能夠在特定波長(zhǎng)的光下吸收光，從而觸發(fā)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，進(jìn)而啟動(dòng)下游信號(hào)傳導(dǎo)，如離子通道的開放或蛋白質(zhì)相互作用的改變。然而，自然界提供的這些蛋白質(zhì)選擇有限。另外，由于這些天然衍生蛋白質(zhì)固有的復(fù)雜光感受機(jī)制，精確控制它們的光感受光譜和動(dòng)力學(xué)，以及在外源系統(tǒng)中有效使用它們?nèi)匀痪哂刑魬?zhàn)性。

2、蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)已經(jīng)發(fā)展成為一種強(qiáng)大的工具，可以創(chuàng)建在自然界中尚未探索的具有新結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)。近年來(lái)，該領(lǐng)域取得了重大進(jìn)展，如設(shè)計(jì)具有多樣化結(jié)構(gòu)的新結(jié)合物和蛋白質(zhì)組裝體。雖然已經(jīng)嘗試使用計(jì)算方法來(lái)工程新的光響應(yīng)蛋白質(zhì)，但這些方法主要基于已存在的天然光響應(yīng)蛋白質(zhì)。在這些蛋白質(zhì)中引入新的構(gòu)象轉(zhuǎn)換功能是復(fù)雜和有限的，并且這些系統(tǒng)中的光響應(yīng)可能是不可預(yù)測(cè)和難以調(diào)節(jié)的。除此之外，先前的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)策略主要使用標(biāo)準(zhǔn)的20種氨基酸作為主要構(gòu)建模塊，這導(dǎo)致潛在的氨基酸化學(xué)空間大部分未被開發(fā)。雖然計(jì)算設(shè)計(jì)方法已經(jīng)被調(diào)整以將非經(jīng)典氨基酸納入蛋白質(zhì)以進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，但準(zhǔn)確定位這些非經(jīng)典氨基酸在關(guān)鍵功能位點(diǎn)的技術(shù)仍處于初級(jí)階段。

3、遺傳密碼擴(kuò)展技術(shù)通過(guò)正交氨酰-trna合成酶/trna配對(duì)重新分配密碼子，將非經(jīng)典氨基酸整合到蛋白質(zhì)中，從而對(duì)蛋白質(zhì)功能提供了異常的控制。這種方法利用非經(jīng)典氨基酸的獨(dú)特性質(zhì)，將蛋白質(zhì)的化學(xué)能力擴(kuò)展到傳統(tǒng)的二十種氨基酸以外，從而在目標(biāo)蛋白質(zhì)中引入新的功能，如光感知和生物正交化學(xué)。經(jīng)典的光開關(guān)基團(tuán)之一的偶氮苯具有可逆的、光誘導(dǎo)的、波長(zhǎng)選擇性的順/反異構(gòu)化反應(yīng)，并具有較高的量子產(chǎn)率。在波長(zhǎng)為340nm的光照下，苯丙氨酸-4'-偶氮苯(azof)這種光敏的非天然氨基酸的偶氮苯可以從較穩(wěn)定的e型異構(gòu)體光異構(gòu)化為z型異構(gòu)體，并可以在波長(zhǎng)為420nm的光照下恢復(fù)為e型異構(gòu)體。它已被廣泛應(yīng)用于生物環(huán)境中，通過(guò)化學(xué)連接相鄰殘基來(lái)控制蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)，或通過(guò)基因工程將其作為非經(jīng)典氨基酸來(lái)控制dna結(jié)合、熒光蛋白功能和酶活性。在先前的研究中，azof的合并位點(diǎn)是通過(guò)半理性方法確定的，沒(méi)有充分優(yōu)化azof構(gòu)型調(diào)整和隨后的功能結(jié)果之間的相關(guān)性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)的技術(shù)目的是提供一類以azof作為設(shè)計(jì)靶標(biāo)的響應(yīng)光進(jìn)行組裝的蛋白多聚體及其相關(guān)應(yīng)用。

2、一方面，本發(fā)明提供一種含有苯丙氨酸-4'-偶氮苯的光響應(yīng)組裝蛋白或其突變體，其在340nm波長(zhǎng)光照下為解聚狀態(tài)，在420nm波長(zhǎng)光照下為聚合狀態(tài)，所述光響應(yīng)組裝蛋白選自以下：

3、(i)選自以下各項(xiàng)的同源聚體：

4、lro-c2-5二聚體，其單體包括seq?id?no.:1的氨基酸序列；

5、lro-c2-35二聚體，其單體包括seq?id?no.:2的氨基酸序列；

6、lro-c3-7三聚體，其單體包括seq?id?no.:3的氨基酸序列；

7、lro-c3-37三聚體，其單體包括seq?id?no.:4的氨基酸序列；

8、lro-c3-64三聚體，其單體包括seq?id?no.:5的氨基酸序列；

9、lro-c4-13四聚體，其單體包括seq?id?no.:6的氨基酸序列；

10、lro-c5-1五聚體，其單體包括seq?id?no.:7的氨基酸序列，(ii)選自以下各項(xiàng)的包含a鏈和v鏈的異源二聚體：

11、lrd-2異源二聚體：其a鏈包括seq?id?no.:8的氨基酸序列，v鏈包括seq?id?no.:9的氨基酸序列；

12、lrd-7異源二聚體：其a鏈包括seq?id?no.:10的氨基酸序列，v鏈包括seq?id?no.:11的氨基酸序列；

13、lrd-10異源二聚體：其a鏈包括seq?id?no.:12的氨基酸序列，v鏈包括seq?idno.:13的氨基酸序列，

14、其中，所述突變體是指與上述序列seq?id?no.:1-13分別具有至少90％，例如91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％以上序列同一性的序列，前提是各序列中包含的苯丙氨酸-4'-偶氮苯不發(fā)生變化。

15、在具體實(shí)施方式中，

16、lro-c2-5二聚體單體的氨基酸序列為seq?id?no.:1；

17、lro-c2-35二聚體單體的氨基酸序列為seq?id?no.:2；

18、lro-c3-7三聚體單體的氨基酸序列為seq?id?no.:3；

19、lro-c3-37三聚體單體的氨基酸序列為seq?id?no.:4；

20、lro-c3-64三聚體單體的氨基酸序列為seq?id?no.:5；

21、lro-c4-13四聚體單體的氨基酸序列為seq?id?no.:6；

22、lro-c5-1五聚體單體的氨基酸序列為seq?id?no.:7；

23、lrd-2異源二聚體的a鏈氨基酸序列為seq?id?no.:8，v鏈氨基酸序列為seq?idno.:9；

24、lrd-7異源二聚體的a鏈氨基酸序列為seq?id?no.:10，v鏈氨基酸序列為seq?idno.:11；

25、lrd-10異源二聚體的a鏈氨基酸序列為seq?id?no.:12，v鏈氨基酸序列為seq?idno.:13。

26、在具體實(shí)施方式中，在上述各序列seq?id?no.:1-13的n端還包括序列mg，和/或上述各氨基酸序列的c端還包括用于純化的標(biāo)簽序列，例如6*his、mbp、gst、ha、c-myc、flag等標(biāo)簽序列，其可通過(guò)連接子連接到各序列的c端，所述連接子選自gs、gg、ggg、ggs或gsg中一者或多者，各連接子的重復(fù)次數(shù)為1-20次，例如所述連接子為(ggs)1-5。

27、在具體實(shí)施方式中，lro-c2-5二聚體單體的氨基酸序列為seq?idno.:30；

28、lro-c2-35二聚體單體的氨基酸序列為seq?id?no.:31；

29、lro-c3-7三聚體單體的氨基酸序列為seq?id?no.:32；

30、lro-c3-37三聚體單體的氨基酸序列為seq?id?no.:33；

31、lro-c3-64三聚體單體的氨基酸序列為seq?id?no.:34；

32、lro-c4-13四聚體單體的氨基酸序列為seq?id?no.:35；

33、lro-c5-1五聚體單體的氨基酸序列為seq?id?no.:36；

34、lrd-2異源二聚體的a鏈氨基酸序列為seq?id?no.:37，v鏈氨基酸序列為seq?idno.:40；

35、lrd-7異源二聚體的a鏈氨基酸序列為seq?id?no.:38，v鏈氨基酸序列為seq?idno.:41；

36、lrd-10異源二聚體的a鏈氨基酸序列為seq?id?no.:39，v鏈氨基酸序列為seq?idno.:42。

37、另一方面，本發(fā)明提供上述同源聚體在制備光響應(yīng)水凝膠中的用途。

38、在具體實(shí)施方式中，所述光響應(yīng)水凝膠可以響應(yīng)于光照而在凝膠和溶液兩種狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換，例如在420nm波長(zhǎng)光照下呈現(xiàn)凝膠狀態(tài)，在340nm波長(zhǎng)光照下呈現(xiàn)溶液狀態(tài)。

39、在具體實(shí)施方式中，所述同源聚體為上述lro-c5-1五聚體。

40、另一方面，本發(fā)明提供一種光響應(yīng)水凝膠體系的構(gòu)建方法，所述方法包括：

41、1)構(gòu)建用于表達(dá)融合蛋白spytag-mbp-lro-c5-1的質(zhì)粒，并進(jìn)行表達(dá)和純化以得到融合蛋白spytag-mbp-lro-c5-1，所述融合蛋白spytag-mbp-lro-c5-1從n端至c端依次包含：spy-tag序列、linker1、mbp序列、linker2、如上所述的lro-c5-1單體序列；以及

42、構(gòu)建用于表達(dá)同源二聚體dimer-spycatcher蛋白的質(zhì)粒，并進(jìn)行表達(dá)和純化以得到同源二聚體dimer-spycatcher蛋白，所述同源二聚體dimer-spycatcher蛋白的單體序列從n端至c端依次包含：homodimer序列、linker3、spy-cartcher序列，

43、2)將步驟1)中得到的融合蛋白spytag-mbp-lro-c5-1與同源二聚體dimer-spycatcher蛋白以1:2-3的摩爾比進(jìn)行混合，使得最終溶液中的蛋白質(zhì)量比在6％-20％之間，經(jīng)過(guò)反應(yīng)，即可形成凝膠。

44、在具體實(shí)施方式中，所述linker1、linker2、linker3各自獨(dú)立地選自gs、gg、ggg、ggs或gsg中一者或多者的重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)可以為1-20次。

45、在具體實(shí)施方式中，spytag-mbp-lro-c5-1的氨基酸序列為seq?idno.:14，同源二聚體dimer-spycatcher蛋白單體的氨基酸序列為seq?idno.:15。

46、在具體實(shí)施方式中，在步驟2)中，spytag-mbp-lro-c5-1與dimer-spycatcher的摩爾比為1:2.5，反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)。

47、又一方面，本發(fā)明提供一種光響應(yīng)水凝膠體系，其包括在水介質(zhì)緩沖液分散介質(zhì)中的如下兩種蛋白：

48、融合蛋白spytag-mbp_lro-c5-1：其從n端至c端依次包含spytag序列、linker1、mbp序列、linker2、lro-c5-1單體序列；以及

49、同源二聚體dimer-spycatcher蛋白：其單體序列從n端至c端依次包含homodimer序列、linker3、spycatcher序列。

50、在具體實(shí)施方式中，所述緩沖液僅為凝膠的形成提供一種水性環(huán)境，因此其選擇可以不受限制，例如可以為常規(guī)的pbs或tbs緩沖液。

51、在具體實(shí)施方式中，所述linker1、linker2、linker3各自獨(dú)立地選自gs、gg、ggg、ggs或gsg中一者或多者的重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)可以為1到20次。

52、在具體實(shí)施方式中，融合蛋白spytag-mbp_lro-c5-1的氨基酸序列為seq?id?no.:14，同源二聚體dimer-spycatcher蛋白單體的氨基酸序列為seq?id?no.:15。

53、在具體實(shí)施方式中，所述光響應(yīng)水凝膠體系在340nm光照下由凝膠狀態(tài)轉(zhuǎn)換為液體狀態(tài)，在420nm光照下恢復(fù)為凝膠狀態(tài)。

54、在具體實(shí)施方式中，對(duì)于所述光響應(yīng)水凝膠體系，在蛋白溶劑比為10％w/v時(shí)，凝膠狀態(tài)下的模量為液體狀態(tài)下模量的約10倍。

55、再一方面，本發(fā)明提供上述光響應(yīng)水凝膠體系在制備細(xì)胞培養(yǎng)基中的應(yīng)用。

56、再一方面，本發(fā)明提供一種上述異源二聚體在制備光響應(yīng)胞外分子傳感器中的應(yīng)用。

57、在具體實(shí)施方式中，所述異源二聚體為lrd-7。

58、在具體實(shí)施方式中，將lrd-7的a鏈同源二聚化，形成d-7a二聚體蛋白，作為光響應(yīng)胞外分子傳感器，進(jìn)一步通過(guò)將lrd-7異源二聚體的v鏈融合到促紅細(xì)胞生成素受體epor的n端，作為光響應(yīng)胞外分子傳感器的細(xì)胞膜上的受體。

59、在具體實(shí)施方式中，通過(guò)將lrd-7異源二聚體的v鏈融合到epor的n端而構(gòu)造的epor的胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為seq?id?no.:23，同源二聚體d-7a的a鏈二聚體單體的氨基酸序列為seq?id?no.:22。

60、在具體實(shí)施方式中，所述光響應(yīng)胞外分子傳感器可以響應(yīng)于光照來(lái)激活細(xì)胞信號(hào)通路(例如，jak/stat、plcg、mapk)傳導(dǎo)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞分泌報(bào)告基因產(chǎn)物(例如，seap酶)。具體地，通過(guò)340nm光照處理分子傳感器可以控制細(xì)胞信號(hào)通路(例如，jak/stat、plcg、mapk)傳導(dǎo)進(jìn)而抑制細(xì)胞分泌報(bào)告基因產(chǎn)物(例如，seap酶)，通過(guò)420nm光照處理分子傳感器可以激活細(xì)胞信號(hào)通路(jak/stat、plcg、mapk)傳導(dǎo)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞分泌報(bào)告基因產(chǎn)物(例如，seap酶)。

61、有益效果

62、本發(fā)明精確設(shè)計(jì)了一系列c對(duì)稱性的同源2、3、4、5聚體(分別為lro-c2-5、lro-c2-35、lro-c3-7、lro-c3-37、lro-c3-64、lro-c4-13、lro-c5-1)以及異源2聚體蛋白(分別為lrd-2、lrd-7、lrd-10)，并在含有特定氨酰-trna合成酶的大腸桿菌中以及azof存在下表達(dá)這一系列蛋白，隨后在篩選中得到了能夠在340nm光照下多聚體解聚或親和力降低，并能夠在420nm光照下恢復(fù)其聚集態(tài)或相互作用模式的蛋白。其中l(wèi)rd-7的親和力差異接近177倍。除此之外，篩選得到的蛋白質(zhì)分子量小、穩(wěn)定性好，表達(dá)量高，能夠作為標(biāo)簽將單體靶標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)楣饷舾腥诤隙嗑刍鞍住?/p>

63、基于這一系列光敏感蛋白中的光控5聚體，本技術(shù)進(jìn)一步設(shè)計(jì)并制備了一種光敏感的蛋白水凝膠，在波長(zhǎng)340nm光照射下，這種水凝膠由凝膠(gel)轉(zhuǎn)變?yōu)槿芤?sol)狀態(tài)，在420nm光照射下，則由溶液(sol)轉(zhuǎn)變凝膠(gel)，經(jīng)旋轉(zhuǎn)流變儀測(cè)試，儲(chǔ)存模量變化接近10倍，并且這種轉(zhuǎn)化可以重復(fù)進(jìn)行而性質(zhì)不發(fā)生明顯的下降。

64、進(jìn)一步，本技術(shù)中利用異源二聚體的融合設(shè)計(jì)了控制細(xì)胞信號(hào)通路傳導(dǎo)的蛋白，這種蛋白能夠通過(guò)細(xì)胞表面改造的epor，傳導(dǎo)至胞內(nèi)的jak/stat、plcg、mapk三條信號(hào)通路，并具體表現(xiàn)在seap酶分泌表達(dá)上，相關(guān)通路能夠受到340nm光的控制而抑制相關(guān)酶的分泌，并且在420nm光照射后能夠恢復(fù)激活相關(guān)通路。