本發(fā)明屬于獸用診斷試劑和獸用疫苗。本發(fā)明涉及一種偽狂犬病病毒gd蛋白及其應(yīng)用；具體涉及一種偽狂犬病病毒gd蛋白以及哺乳動物hek293細(xì)胞表達(dá)偽狂犬病病毒gd蛋白在制備新型診斷試劑和重組亞單位疫苗中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、偽狂犬病(pseudorabies,pr)是一種由偽狂犬病病毒(pseudorabies?virus,prv)感染引起的以多種家畜及野生動物為主的以發(fā)熱、奇癢、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)障礙為主要特征的急性傳染病。世界衛(wèi)生組織(oie)將其列為b類動物疫病。國內(nèi)外針對該病的防控以疫苗免疫為主，通過配套prv?gb和ge抗體鑒別診斷方法可淘汰、凈化野毒感染豬。

2、目前國內(nèi)臨床應(yīng)用的偽狂犬病疫苗分為三類：一是將分離的野毒或強(qiáng)毒經(jīng)甲醛滅活后，加佐劑乳化制成滅活疫苗，比如豬偽狂犬病滅活疫苗鄂a株和閩a株；二是將分離的野毒或強(qiáng)毒經(jīng)非豬源細(xì)胞或者雞胚反復(fù)傳代致弱而研制的弱毒疫苗，如豬偽狂犬病活疫苗bartha-k61株；三是利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的基因缺失疫苗，包括豬偽狂犬病活疫苗hb-98株、hb2000株、sa215株和豬偽狂犬病耐熱保護(hù)劑活疫苗c株，以及豬偽狂犬病滅活疫苗hn1201-δge株、hnx-12株、js-2012-δgi/ge株。這些疫苗在我國偽狂犬病的防控中起著非常重要的作用。除了針對偽狂犬病病毒變異株的基因缺失滅活疫苗和活疫苗，基于豬偽狂犬病病毒gd基因的亞單位疫苗也因其安全性高、免疫保護(hù)效果好及可進(jìn)行血清學(xué)鑒別診斷而成為生物制品研發(fā)領(lǐng)域的一個重要方向。

3、在目前偽狂犬病病毒變異株流行范圍廣泛、疾病診斷快速可靠和疫苗高效安全的市場需求背景下，匹配當(dāng)前流行變異毒株的診斷試劑和亞單位疫苗的開發(fā)對未來偽狂犬病的控制和凈化具有積極意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一在于提供一種偽狂犬病病毒gd蛋白，通過hek293哺乳動物細(xì)胞表達(dá)獲得的gd蛋白抗原性和免疫原性與天然蛋白質(zhì)相似，具有高糖基化修飾和免疫原性強(qiáng)的特點(diǎn)。

2、本發(fā)明的目的之二在于提供編碼上述重組蛋白的核酸分子，以及插入這些核酸分子以用于重組表達(dá)上述重組蛋白的重組真核載體和重組細(xì)胞。

3、本發(fā)明的目的之三在于提供上述偽狂犬病病毒gd蛋白的制備方法和用途。

4、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

5、本發(fā)明提供了一種偽狂犬病病毒gd蛋白，所述重組蛋白包括偽狂犬病病毒gg信號肽序列、截去跨膜區(qū)的偽狂犬病病毒gd基因序列，以及純化標(biāo)簽6×

6、his序列。

7、優(yōu)選地，所述偽狂犬病病毒gd基因具有序列1所示的氨基酸序列；所述偽狂犬病病毒gg信號肽具有序列3所示的氨基酸序列。

8、本發(fā)明還提供了編碼前面所述的重組蛋白的核酸分子，所述核酸分子包括編碼偽狂犬病病毒gg信號肽的核苷酸序列，編碼偽狂犬病病毒gd蛋白的核苷酸序列。

9、具體地，編碼偽狂犬病病毒gg信號肽的核酸分子序列如序列4所示，編碼偽狂犬病病毒gd蛋白的核酸分子序列如序列2所示。

10、本發(fā)明還提供了一種重組載體，所述重組載體包含前面所述的核酸分子，此外，還包括與所述核酸分子序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。

11、本發(fā)明中“載體”依次是指，可將編碼某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白獲得表達(dá)的一種核酸運(yùn)載工具。載體可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞中得以表達(dá)。舉例來說，載體包括：質(zhì)粒、噬菌體、柯斯質(zhì)粒、人工染色體、噬菌體和動物病毒等。用作載體的動物病毒種類有慢病毒、腺病毒、皰疹病毒、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒等。一種載體可能含有多種控制表達(dá)元件，包括啟動子序列、逆轉(zhuǎn)錄起始序列、增強(qiáng)子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有復(fù)制起始位點(diǎn)。載體還有可能包括協(xié)助其進(jìn)入細(xì)胞的成分，如病毒顆粒、脂質(zhì)體或蛋白外殼，但不僅僅只有這些物質(zhì)。

12、在本發(fā)明的具體實施例中，重組載體是將前面所示的核酸分子插入pcdna3.1載體(thermo?fisher?scientific)中構(gòu)建而成。

13、本發(fā)明還提供了前面所述的重組載體的構(gòu)建方法，所述方法包括將前面所述的核酸分子插入pcdna3.1載體中。

14、具體地，本發(fā)明的重組載體的構(gòu)建方法如下所示：

15、分別將信號肽(編碼序列如序列4)、偽狂犬病病毒gd蛋白和6×his序列合并，在基因序列c端加上終止密碼子taa后人工合成表達(dá)偽狂犬病病毒gd重組蛋白的完整基因序列，并將其利用分子克隆的方法克隆至表達(dá)載體pcdna3.1，構(gòu)建得到重組真核表達(dá)質(zhì)粒。

16、具體的，所述重組表達(dá)載體為將序列表中序列5所示的核苷酸序列插入到表達(dá)載體pcdna3.1的nheⅰ和notⅰ酶識別位點(diǎn)之間，構(gòu)建得到表達(dá)偽狂犬病病毒gd重組蛋白的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcdna3.1-gd。

17、本發(fā)明還提供了一種重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞中導(dǎo)入了前面所述的核酸分子或轉(zhuǎn)染了前面所述的重組載體。

18、本發(fā)明中“重組細(xì)胞”一詞是指導(dǎo)入核酸分子或載體的細(xì)胞，包括如下許多細(xì)胞類型，如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌等原核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞或曲霉菌等真菌細(xì)胞，如s2果蠅細(xì)胞sf9等昆蟲細(xì)胞，或者如纖維原細(xì)胞，cho細(xì)胞，cos細(xì)胞，bhk細(xì)胞，hek293細(xì)胞等。

19、在本發(fā)明的具體實施方案中，所述重組細(xì)胞是hek293細(xì)胞。

20、本發(fā)明還提供了一種利用前面所述的重組細(xì)胞產(chǎn)生偽狂犬病病毒gd重組蛋白的方法，所述方法包括在合適的條件下培養(yǎng)前面所述的重組細(xì)胞并回收所述重組蛋白，所述方法包括以下步驟：將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞或上述重組細(xì)胞，通過多次收獲所述的轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)上清，和/或?qū)⒅亟M細(xì)胞在目標(biāo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，收獲培養(yǎng)上清進(jìn)行純化，獲得上述的偽狂犬病病毒gd重組蛋白。

21、本發(fā)明還提供了一種偽狂犬病亞單位疫苗及其制備方法與應(yīng)用。

22、所述偽狂犬病亞單位疫苗包括偽狂犬病病毒gd重組蛋白與藥學(xué)可接受的佐劑，如isa?206vg佐劑。

23、進(jìn)一步地，該亞單位疫苗制備方法為：將上述表達(dá)純化獲得的gd重組蛋白經(jīng)nanodrop2000?a280定量，與isa?206vg按體積比1:1混合，制成偽狂犬病亞單位疫苗。

24、本發(fā)明提供的偽狂犬病亞單位疫苗免疫豬后可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平抗偽狂犬病病毒變異株中和抗體，具有免疫原性強(qiáng)、安全性好且與當(dāng)前流行毒株相匹配的優(yōu)點(diǎn)，可用于預(yù)防和控制偽狂犬病的傳播和流行。

25、本發(fā)明還提供了一種偽狂犬病病毒gd蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，包括：偽狂犬病病毒gd重組蛋白、封閉液(含有10mg/ml酪蛋白ph7.4的pbs緩沖液)，酶標(biāo)二抗(hrp標(biāo)記的兔抗豬igg)，pbst，顯色液(tmb底物液)、終止液(2mol/l硫酸)。

26、具體的，所述一種偽狂犬病病毒gd蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括：

27、偽狂犬病病毒gd重組蛋白包被的酶聯(lián)反應(yīng)板。

28、所述試劑盒中還可以包括陽性對照血清和陰性對照血清，所述陽性對照血清為豬偽狂犬滅活疫苗免疫后采集的豬血清，陰性對照血清為無特定病原體(spf)豬血清。

29、所述試劑盒中還可以包括：樣品稀釋液、20倍濃縮洗滌液、酶標(biāo)二抗(hrp標(biāo)記的兔抗豬igg)、底物液a、底物液b和終止液。

30、樣品稀釋液含有5mg/ml酪蛋白的0.01m的磷酸鹽緩沖液(ph值7.4)。

31、底物液a為含0.6mg/ml過氧化氫尿素的檸檬酸磷酸鹽緩沖液。

32、底物液b為0.2mg/ml的四甲基聯(lián)苯胺(tmb)溶液。

33、20倍濃縮洗滌液為含有濃度為0.8％～1.2％(ml/ml)的tween-20的0.01m，ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液。

34、終止液為2m的硫酸溶液。

35、根據(jù)需要，試劑盒中還可以包括樣品稀釋板(2塊、96孔/塊)，用于樣品的稀釋。

36、本發(fā)明所述偽狂犬病病毒gd重組蛋白，能特異性、高效結(jié)合豬血清樣品中的特異性抗體，具有很好的抗原性，可通過對疫苗免疫動物血清中g(shù)d和ge抗體的鑒別診斷區(qū)分疫苗免疫和野毒感染動物。