本發(fā)明涉及化工，具體是一種制備二酯油的脂肪酶的制備方法。

背景技術(shù)：

1、酶法催化甘油解反應(yīng)由于體系中原料簡(jiǎn)單易獲得，反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小而被優(yōu)先選擇用于甘油二酯的制備。傳統(tǒng)的酶法催化甘油解反應(yīng)，由于固定化酶的購(gòu)買成本高，反應(yīng)體系中需要添加過量甘油，存在底物粘度大、反應(yīng)不充分、反應(yīng)緩慢等問題，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)不利，本發(fā)明采用自制固定化酶進(jìn)行甘油解反應(yīng)以降低酶的成本，得到高二酯含量的粗制二酯油，進(jìn)一步純化得到純二酯油。酶解反應(yīng)得到的二酯油中含有較多脂肪酸及單甘酯，目前工業(yè)化生產(chǎn)上采用的二酯油純化工藝為分子蒸餾，該工藝所需設(shè)備成本高、能耗高、純化速率低，使得二酯油產(chǎn)量極低且售價(jià)昂貴，本發(fā)明提供一種適用于工業(yè)化生產(chǎn)的二酯油純化方法，可大大降低生產(chǎn)成本，提高純化效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種制備二酯油的脂肪酶的制備方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、一種制備二酯油的脂肪酶的制備方法，包括如下步驟：

4、步驟(1)制備脂肪酶液：脂肪酶菌株的高密度發(fā)酵；

5、步驟(2)制備固定化脂肪酶：高密度發(fā)酵得到的脂肪酶液與樹脂載體混合，在搖床中加熱吸附，固定一定時(shí)間，純水清洗過濾后干燥后得到固定化脂肪酶；

6、步驟(3)催化反應(yīng)：食用油、甘油、固定化脂肪酶混合，加熱反應(yīng)一定時(shí)間以制備粗制二酯油；

7、步驟(4)乙醇多次萃取控溫法純化粗制二酯油，除去脂肪酸和甘油單酯；真空干燥除去乙醇和水分，得到甘油二酯含量高的二酯油。

8、所述步驟(1)所述的脂肪酶菌株，其脂肪酶序列來(lái)源于南極假絲酵母脂肪酶b，表達(dá)菌株為畢赤酵母。

9、所述步驟(2)所述樹脂載體包括大孔吸附樹脂、環(huán)氧樹脂、離子交換樹脂中的一種。

10、所述步驟(2)所述樹脂在固定化前需活化，步驟為95％乙醇溶液浸泡24h(高于樹脂2～3cm)，純水清洗數(shù)次至無(wú)酒精氣味后過濾；再用5％鹽酸溶液浸泡4h(高于樹脂2～3cm)，純水清洗數(shù)次至濾液呈中性；再用5％氫氧化鈉溶液浸泡4h(高于樹脂2～3cm)，純水清洗數(shù)次至濾液呈中性；pbs?ph?7.0溶液浸泡4h(高于樹脂2～3cm)，pbs?ph?7.0溶液浸泡清洗數(shù)次至濾液呈中性，放置4℃冰箱備用。

11、所述步驟(2)所述固定化體系中酶液濃度為4～10mg/ml，優(yōu)選為8mg/ml；酶液體積為50ml；所述固定化體系中活化濕樹脂加入量為1～4g，優(yōu)選為2g；所述搖床溫度設(shè)定為20～30℃，優(yōu)選為25℃；轉(zhuǎn)速設(shè)定為150～220rpm，優(yōu)選為180rpm；所述固定時(shí)間為2～12h，優(yōu)選為4h；所述干燥溫度為20～40℃，優(yōu)選為30℃。

12、所述步驟(3)所述食用油為甘油三酯，優(yōu)選為棕櫚油；添加的棕櫚油與甘油摩爾比為1～3：1，優(yōu)選為2：1；添加的固定化脂肪酶與棕櫚油的質(zhì)量比為2％-5％，優(yōu)選為4％；反應(yīng)溫度設(shè)定為40～80℃，優(yōu)選為60℃；反應(yīng)時(shí)間為4～12h，優(yōu)選為6h。

13、所述步驟(4)所述乙醇濃度為60％～70％，優(yōu)選為70％；所述乙醇與粗制二酯油質(zhì)量比為5～1：1，優(yōu)選為3：1；所述溫度為40～60℃，優(yōu)選為50℃；所述萃取次數(shù)為1～5次，優(yōu)選為3次。

14、所述步驟(4)所述每次萃取過程中，需攪拌混合5～20min，優(yōu)選為10min；兩相靜置分層時(shí)間為5～20min，優(yōu)選為10min。

15、所述步驟(4)步驟(4)所述真空干燥溫度為50～60℃，優(yōu)選為55℃；干燥時(shí)間為30min-2h，優(yōu)選為1h；制備得到的二酯油中甘油二酯含量達(dá)50％以上，同時(shí)單酯含量小于1.5％。

16、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

17、本發(fā)明通過以范德華力、氫鍵、疏水性互作用等弱相互作用為主的物理吸附法將脂肪酶固定于載體上，制備得到的固定化脂肪酶使得酶蛋白活性中心不易被破壞，增加酶的穩(wěn)定性；制作方法簡(jiǎn)單，成本低廉；載體可反復(fù)多次使用，大大降低了生產(chǎn)成本。

18、本發(fā)明提出乙醇萃取法對(duì)粗制二酯油進(jìn)行純化。傳統(tǒng)的分子蒸餾法，由于高溫環(huán)境會(huì)導(dǎo)致縮水甘油酯的產(chǎn)生，縮水甘油酯食用后在人體內(nèi)會(huì)分解為有害的縮水甘油，因此后期還需增加去除縮水甘油酯的工藝；分子蒸餾設(shè)備價(jià)格昂貴，能耗高，進(jìn)料速度及體積有限，使得純化成本極高且二酯油產(chǎn)量低。本發(fā)明采用的乙醇萃取法中，乙醇為友好溶劑，獲取方式簡(jiǎn)單且可通過旋蒸回收利用；萃取塔設(shè)備操作簡(jiǎn)單，價(jià)格相比于分子蒸餾設(shè)備價(jià)格更便宜；整個(gè)純化過程溫度均處于低溫狀態(tài)，避免了縮水甘油酯等有害物質(zhì)生成。

技術(shù)特征：

1.一種制備二酯油的脂肪酶的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備二酯油的脂肪酶單位制備方法，其特征在于所述步驟(1)所述的脂肪酶菌株，其脂肪酶序列來(lái)源于南極假絲酵母脂肪酶b，表達(dá)菌株為畢赤酵母。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備二酯油的脂肪酶單位制備方法，其特征在于所述步驟(2)所述樹脂載體包括大孔吸附樹脂、環(huán)氧樹脂、離子交換樹脂中的一種。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備二酯油的脂肪酶單位制備方法，其特征在于所述步驟(2)所述樹脂在固定化前需活化，步驟為95％乙醇溶液浸泡24h(高于樹脂2～3cm)，純水清洗數(shù)次至無(wú)酒精氣味后過濾；再用5％鹽酸溶液浸泡4h(高于樹脂2～3cm)，純水清洗數(shù)次至濾液呈中性；再用5％氫氧化鈉溶液浸泡4h(高于樹脂2～3cm)，純水清洗數(shù)次至濾液呈中性；pbsph7.0溶液浸泡4h(高于樹脂2～3cm)，pbs?ph?7.0溶液浸泡清洗數(shù)次至濾液呈中性，放置4℃冰箱備用。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備二酯油的脂肪酶單位制備方法，其特征在于所述步驟(2)所述固定化體系中酶液濃度為4～10mg/ml，優(yōu)選為8mg/ml；酶液體積為50ml；所述固定化體系中活化濕樹脂加入量為1～4g，優(yōu)選為2g；所述搖床溫度設(shè)定為20～30℃，優(yōu)選為25℃；轉(zhuǎn)速設(shè)定為150～220rpm，優(yōu)選為180rpm；所述固定時(shí)間為2～12h，優(yōu)選為4h；所述干燥溫度為20～40℃，優(yōu)選為30℃。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備二酯油的脂肪酶單位制備方法，其特征在于所述步驟(3)所述食用油為甘油三酯，優(yōu)選為棕櫚油；添加的棕櫚油與甘油摩爾比為1～3：1，優(yōu)選為2：1；添加的固定化脂肪酶與棕櫚油的質(zhì)量比為2％-5％，優(yōu)選為4％；反應(yīng)溫度設(shè)定為40～80℃，優(yōu)選為60℃；反應(yīng)時(shí)間為4～12h，優(yōu)選為6h。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備二酯油的脂肪酶單位制備方法，其特征在于所述步驟(4)所述乙醇濃度為60％～80％，優(yōu)選為70％；所述乙醇與粗制二酯油質(zhì)量比為5～1：1，優(yōu)選為3：1；所述溫度為40～60℃，優(yōu)選為50℃；所述萃取次數(shù)為1～5次，優(yōu)選為3次。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備二酯油的脂肪酶單位制備方法，其特征在于所述步驟(4)所述每次萃取過程中，需攪拌混合5～20min，優(yōu)選為10min；兩相靜置分層時(shí)間為5～20min，優(yōu)選為10min。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備二酯油的脂肪酶單位制備方法，其特征在于所述步驟(4)步驟(4)所述真空干燥溫度為50～60℃，優(yōu)選為55℃；干燥時(shí)間為30min-2h，優(yōu)選為1h；制備得到的二酯油中甘油二酯含量達(dá)50％以上，同時(shí)單酯含量小于1.5％。

技術(shù)總結(jié)
一種制備二酯油的脂肪酶的制備方法，其特征在于包括如下步驟：(1)制備脂肪酶液：脂肪酶菌株的高密度發(fā)酵；(2)制備固定化脂肪酶：高密度發(fā)酵得到的脂肪酶液與樹脂載體混合，在搖床中加熱吸附，固定一定時(shí)間，純水清洗過濾后干燥后得到固定化脂肪酶；(3)催化反應(yīng)：食用油、甘油、固定化脂肪酶混合，加熱反應(yīng)一定時(shí)間以制備粗制二酯油；(4)乙醇多次萃取控溫法純化粗制二酯油，除去脂肪酸和甘油單酯；真空干燥除去乙醇和水分，得到甘油二酯含量高的二酯油。本發(fā)明通過自制固定化脂肪酶提高酶的穩(wěn)定性和使用次數(shù)，提出了一種全新的純化方法，即乙醇萃取法來(lái)純化甘油二酯油。此方法相比傳統(tǒng)的分子蒸餾法效率更高，主要表現(xiàn)在純化設(shè)備簡(jiǎn)單易獲得、全程低溫條件、單次純化物料量大、萃取時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)。

技術(shù)研發(fā)人員：系祖斌,李明磊,姚立成,梅倩云,李一佳,曹許昊珺
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海同合萬(wàn)康生物技術(shù)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30