本公開涉及生物，尤其涉及一種人工染色體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、酵母人工染色體是一種存在于酵母細(xì)胞內(nèi)，能夠克隆長(zhǎng)達(dá)幾百kb的dna片段的載體，含有酵母細(xì)胞中必需的端粒、著絲點(diǎn)和復(fù)制起始序列，是細(xì)胞內(nèi)具有遺傳性質(zhì)的物體。在合成生物學(xué)中，酵母人工染色體主要用來構(gòu)建大片段dna文庫，特別用來構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫，并不用作常規(guī)的基因克隆。

2、大片段dna的合成是實(shí)現(xiàn)生物體完整基因組合成的關(guān)鍵步驟，dna片段在生物體內(nèi)穩(wěn)定存在和增殖是必要條件。利用酵母人工染色體合成目標(biāo)大片段dna，是將dna片段引入微生物細(xì)胞內(nèi)，并連接到酵母人工染色體的指定部位。dna合成技術(shù)是合成生物學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)。近年來，隨著dna測(cè)序技術(shù)和dna合成技術(shù)的快速發(fā)展，應(yīng)用工程學(xué)手段對(duì)基因、生物元件、代謝途徑甚至基因組進(jìn)行設(shè)計(jì)與合成的新興學(xué)科合成生物的迅速發(fā)展，dna合成技術(shù)的作用愈發(fā)凸顯。傳統(tǒng)的小片段合成及基因操作雖然仍在很多方面發(fā)揮著重要作用，但在設(shè)計(jì)操縱單元越來越大的趨勢(shì)下已不能滿足需求。

3、目前，人類已開始嘗試合成較大基因組的微生物，甚至是哺乳動(dòng)物的基因組。合成基因組的尺度巨大，而常規(guī)的載體已無法裝載如此大尺度的基因組，更不用說高效的完成組裝過程。因此，為滿足大尺度的dna組裝需求，必須開發(fā)一種相應(yīng)的載體，以實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定的基因組組裝。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本公開提供了一種人工染色體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，以至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的以上技術(shù)問題。

2、根據(jù)本公開的第一方面，提供了一種人工染色體pcu，包括初始人工染色體，以及與所述初始人工染色體連接的功能基因；所述功能基因包括cas9基因、營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記基因、grna識(shí)別序列、同源序列1和片段同源序列。

3、在一可實(shí)施方式中，所述功能基因的核酸序列如seq?id?no:1所示。

4、具體地，所述功能基因的核酸序列全長(zhǎng)為6295bp，其中，1-1180bp為所述片段同源序列，1181-5280bp為所述cas9基因，5281-6179bp為所述營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記基因，6201-6244bp為所述grna識(shí)別序列，6245-6295bp為所述同源序列1。

5、在一可實(shí)施方式中，所述營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記基因?yàn)閡ra篩選標(biāo)記基因。

6、在一可實(shí)施方式中，所述初始人工染色體為pcci-2μ。

7、在一可實(shí)施方式中，所述初始人工染色體與所述功能基因的連接方式為gibson連接。

8、根據(jù)本公開的第二方面，提供了上述人工染色體pcu的構(gòu)建方法，包括以下步驟：將功能基因通過酶切和酶連的方式連接到初始人工染色體上；然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，并在氯霉素抗性平板上挑取陽性克隆，即得所述人工染色體pcu。

9、在一可實(shí)施方式中，所述功能基因通過酶切和酶連的方式連接到所述初始人工染色體的bamhⅰ酶切切點(diǎn)后的位點(diǎn)處。

10、在一可實(shí)施方式中，將所述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至所述大腸桿菌中后，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布于所述氯霉素抗性平板上培養(yǎng)，然后再挑取所述陽性克隆。

11、根據(jù)本公開的第三方面，提供了利用上述人工染色體pcu進(jìn)行dna大片段胞內(nèi)組裝的方法，包括以下步驟：將所述人工染色體pcu和待組裝的dna大片段導(dǎo)入酵母細(xì)胞中，通過胞內(nèi)同源重組，完成組裝。

12、在一可實(shí)施方式中，所述待組裝的dna大片段的長(zhǎng)度為100～800kb。

13、在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述待組裝的dna大片段的長(zhǎng)度為200kb。

14、在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述待組裝的dna大片段由20個(gè)10kb的dna片段在胞內(nèi)組裝而成；相鄰的兩個(gè)所述dna片段中，前一個(gè)所述dna片段的3’端與后一個(gè)所述dna片段的5’端均含有300～700bp的相同序列，確保其在胞內(nèi)能進(jìn)行高效的同源重組。

15、在一可實(shí)施方式中，所述人工染色體pcu的同源序列1與所述待組裝的dna大片段的n-端和c-端中任一端的部分序列同源，所述人工染色體pcu的片段同源序列與所述待組裝的dna大片段的n-端和c-端中另一端的部分序列同源。

16、具體地，若人工染色體pcu的同源序列1與待組裝的dna大片段的n-端的部分序列同源，則人工染色體pcu的片段同源序列與待組裝的dna大片段的c-端的部分序列同源；反之，若同源序列1與待組裝的dna大片段的c-端的部分序列同源，則片段同源序列與待組裝的dna大片段的n-端的部分序列同源。

17、在一可實(shí)施方式中，通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將所述人工染色體pcu和所述待組裝的dna大片段導(dǎo)入所述酵母細(xì)胞中。

18、根據(jù)本公開的第四方面，提供了上述人工染色體pcu在基因克隆、dna合成中的應(yīng)用。

19、根據(jù)本公開的一種可實(shí)施方式，至少具有以下有益效果：

20、本公開通過對(duì)人工染色體進(jìn)行設(shè)計(jì)和改造，借助酵母細(xì)胞內(nèi)的高效同源重組能力實(shí)現(xiàn)了大片段dna在胞內(nèi)的一次組裝，提高了大片段dna的合成效率，避免了體外操作易斷裂，效率較低的問題，為后續(xù)更大尺度完整基因組的合成提供了工具。

21、應(yīng)當(dāng)理解，本部分所描述的內(nèi)容并非旨在標(biāo)識(shí)本公開的實(shí)施例的關(guān)鍵或重要特征，也不用于限制本公開的范圍。本公開的其它特征將通過以下的說明書而變得容易理解。

技術(shù)特征：

1.一種人工染色體pcu，其特征在于，所述人工染色體pcu包括初始人工染色體，以及與所述初始人工染色體連接的功能基因；所述功能基因包括cas9基因、營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記基因、grna識(shí)別序列、同源序列1和片段同源序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工染色體pcu，其特征在于，所述營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記基因?yàn)閡ra篩選標(biāo)記基因；

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工染色體pcu，其特征在于，所述功能基因的核酸序列如seqid?no:1所示；所述功能基因的核酸序列全長(zhǎng)為6295bp，其中，1-1180bp為所述片段同源序列，1181-5280bp為所述cas9基因，5281-6179bp為所述營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記基因，6201-6244bp為所述grna識(shí)別序列，6245-6295bp為所述同源序列1。

4.權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述人工染色體pcu的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：將功能基因通過酶切和酶連的方式連接到初始人工染色體上；然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，并在氯霉素抗性平板上挑取陽性克隆，即得所述人工染色體pcu。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述功能基因通過酶切和酶連的方式連接到所述初始人工染色體的bamhⅰ酶切位點(diǎn)后的位點(diǎn)處。

6.利用權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述人工染色體pcu進(jìn)行dna大片段胞內(nèi)組裝的方法，其特征在于，包括以下步驟：將所述人工染色體pcu和待組裝的dna大片段導(dǎo)入酵母細(xì)胞中，通過胞內(nèi)同源重組，完成組裝。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述待組裝的dna大片段的長(zhǎng)度為100～800kb。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述人工染色體pcu的同源序列1與所述待組裝的dna大片段的n-端和c-端中任一端的部分序列同源，所述人工染色體pcu的片段同源序列與所述待組裝的dna大片段的n-端和c-端中另一端的部分序列同源。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將所述人工染色體pcu和所述待組裝的dna大片段導(dǎo)入所述酵母細(xì)胞中。

10.權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述人工染色體pcu在基因克隆、dna合成中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本公開屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種人工染色體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。人工染色體包括連接的初始人工染色體和功能基因；功能基因包括Cas9基因、Ura篩選標(biāo)記基因、gRNA識(shí)別序列、同源序列1和片段同源序列。構(gòu)建方法：將功能基因通過酶切酶連的方式連接到初始人工染色體上；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，并在氯霉素抗性平板上挑取陽性克隆。DNA大片段胞內(nèi)組裝：將上述人工染色體和待組裝的DNA大片段導(dǎo)入酵母細(xì)胞中，通過胞內(nèi)同源重組完成組裝。還公開了上述人工染色體在基因克隆、DNA合成中的應(yīng)用。本公開的人工染色體可提高大片段DNA合成效率，避免了體外操作易斷裂，效率低的問題，為后續(xù)完整基因組的合成提供了工具。

技術(shù)研發(fā)人員：仰大勇,姚池,譚維,賈雪梅,李帥
受保護(hù)的技術(shù)使用者：天津大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30