本公開涉及細胞療法的領(lǐng)域，并且更具體地涉及用于制造工程化淋巴細胞的組合物和方法。

背景技術(shù)：

1、免疫細胞可被改性為靶向并殺死患者體內(nèi)的癌細胞。為了增加免疫細胞靶向和殺死特定癌細胞的能力，已開發(fā)了工程化免疫細胞以表達將免疫細胞引導(dǎo)至特定靶癌細胞的構(gòu)建體的方法。包括能夠與特定腫瘤抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體（car）和工程化t細胞受體（tcr）允許免疫細胞靶向并殺死表達特定腫瘤抗原的癌細胞。

2、重大的挑戰(zhàn)來自高度復(fù)雜的自體細胞工程化和生產(chǎn)過程，這通常需要至少一周，并且甚至可能長達幾周。在該過程中，從患者采集的淋巴細胞必須被運送到處理中心，而產(chǎn)生的細胞必須冷凍保存，并且然后被運送回患者以進行移植。這種高度復(fù)雜的過程必然導(dǎo)致高成本和有限的臨床應(yīng)用。

3、另外，冗長的過程可能會導(dǎo)致細胞活力降低和淋巴細胞成熟度增加，這兩者都對體內(nèi)功效有害。因此，強烈需要開發(fā)不僅持續(xù)時間更短，而且產(chǎn)生具有提高的治療功效的免疫細胞的過程。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、如所提供的，當(dāng)前自體car細胞制造過程通常需要約7天，并且可能更長。本公開描述了可在6天或甚至4天內(nèi)（或在富集步驟后的5天或甚至3天內(nèi)）完成的改進過程。在各種示例中，5天的過程（即，富集后的5天）包括轉(zhuǎn)導(dǎo)準(zhǔn)備和具體實施步驟，其中更多數(shù)量的淋巴細胞與載體接觸，該載體固定在包被于密閉系統(tǒng)的內(nèi)表面的重組纖連蛋白上。這種改進的轉(zhuǎn)導(dǎo)程序允許大大縮短轉(zhuǎn)導(dǎo)后細胞擴增步驟。

2、又另一種完全不需要轉(zhuǎn)導(dǎo)后擴增的改進過程可在初始富集步驟后僅3天內(nèi)完成。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，3天和5天的兩個過程都產(chǎn)生了具有較高百分比的幼年細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細胞。至少部分由于增加的幼年細胞群體，與常規(guī)的7天過程相比，這些細胞產(chǎn)物表現(xiàn)出大大提高的體內(nèi)抗腫瘤功效。

3、因此，根據(jù)本公開的一個實施方案，提供了一種用于制備轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細胞的方法，該方法包括：將從供體受試者獲得的包括淋巴細胞的樣品與多核苷酸載體一起溫育，以轉(zhuǎn)導(dǎo)該淋巴細胞，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細胞；以及將包括該轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細胞的該樣品培養(yǎng)小于72小時，之后收獲該淋巴細胞以產(chǎn)生收獲的樣品。

4、在一些實施方案中，該轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細胞被培養(yǎng)小于48小時，之后被收獲。在一些實施方案中，該轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細胞被培養(yǎng)小于36小時，之后被收獲。

5、在一些實施方案中，該溫育是在密閉系統(tǒng)中執(zhí)行的。在一些實施方案中，該密閉系統(tǒng)具有至少1500cm2的內(nèi)表面積。在一些實施方案中，該密閉系統(tǒng)具有涂覆有重組人纖連蛋白的內(nèi)表面，其中該涂覆是利用包括約1μg/ml至10μg/ml的該重組人纖連蛋白的溶液執(zhí)行的。在一些實施方案中，該內(nèi)表面還與包括該多核苷酸載體的第二溶液接觸，其中該第二溶液具有約200ml的體積。在一些實施方案中，該涂覆還包括排出該第二溶液。在一些實施方案中，該密閉系統(tǒng)中的該樣品包括至少1.5×108個淋巴細胞。在一些實施方案中，該樣品包括至少4×108個淋巴細胞。

6、在一些實施方案中，該淋巴細胞是外周血單核細胞（pbmc）或t細胞。在一些實施方案中，該收獲的樣品包括cd3+細胞。在一些實施方案中，該收獲的樣品包括cd4+?t細胞和cd8+?t細胞。在一些實施方案中，至少20%的該收獲的cd4+?t細胞是幼稚t細胞，并且不超過12%的該收獲的cd4+?t細胞是效應(yīng)記憶t細胞。在一些實施方案中，至少25%的該收獲的cd4+t細胞是幼稚t細胞，并且不超過9%的該收獲的cd4+?t細胞是效應(yīng)記憶t細胞。在一些實施方案中，至少80%的該收獲的cd4+?t細胞是ccr7+細胞。在一些實施方案中，至多20%的該收獲的cd4+?t細胞是效應(yīng)記憶t細胞和效應(yīng)t細胞的組合。

7、在一些實施方案中，至少10%的該收獲的cd8+?t細胞是幼稚t細胞，并且不超過30%的該收獲的cd8+?t細胞是效應(yīng)記憶t細胞。在一些實施方案中，至少20%的該收獲的cd8+?t細胞是幼稚t細胞，并且不超過20%的該收獲的cd8+?t細胞是效應(yīng)記憶t細胞。在一些實施方案中，該幼稚t細胞被表征為ccr7+和cd45ra+。在一些實施方案中，該效應(yīng)記憶t細胞被表征為ccr7-、cd45ro+和cd95+。在一些實施方案中，至少60%的該收獲的cd8+?t細胞是ccr7+細胞。在一些實施方案中，至多40%的該收獲的cd8+?t細胞是效應(yīng)記憶t細胞和效應(yīng)t細胞的組合。

8、在一些實施方案中，該方法還包括：從該供體受試者獲取該淋巴細胞。在一些實施方案中，該方法還包括：富集該淋巴細胞。在一些實施方案中，該方法還包括：將該樣品與淋巴細胞刺激劑接觸以活化該淋巴細胞。

9、在一些實施方案中，該活化該樣品是在將該樣品與該多核苷酸載體一起溫育之前。在一些實施方案中，該樣品包括至少1×109個淋巴細胞。在一些實施方案中，該活化該樣品是在將該樣品與該多核苷酸載體一起溫育之后。在一些實施方案中，該淋巴細胞刺激劑包括抗cd3抗體和/或抗cd28抗體。

10、在一些實施方案中，該方法還包括：在該收獲之后，向受試者施用收獲的淋巴細胞或冷凍該收獲的淋巴細胞。在一些實施方案中，該受試者與該供體受試者相同。在一些實施方案中，向該受試者施用每千克該受試者總共10,000個至3,000,000個收獲的淋巴細胞。在一些實施方案中，向該受試者施用每千克該受試者總共20,000個至400,000個收獲的淋巴細胞。在一些實施方案中，利用該載體來轉(zhuǎn)導(dǎo)至少15%的該收獲的淋巴細胞。

11、在一些實施方案中，該多核苷酸載體是病毒載體。在一些實施方案中，該病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體。在一些實施方案中，該載體編碼嵌合抗原受體（car）或t細胞受體（tcr）。在一些實施方案中，該car包括胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，該胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域是選自由以下組成的組的蛋白質(zhì)的信號傳導(dǎo)區(qū)域：dap-10、cd28、ox-40、4-1bb（cd137）、cd2、cd7、cd27、cd30、cd40、程序性死亡-1（pd-1）、誘導(dǎo)型t細胞共刺激因子（icos）、淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1（lfa-1、cd11a/cd18）、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd247、cd276（b7-h3）、腫瘤壞死因子超家族成員14、tnfsf14、light）、nkg2c、ig?α（cd79a）、fc?γ受體、mhc?i類分子、tnf受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞因子受體、整合素、信號傳導(dǎo)淋巴細胞活化分子（slam蛋白）、活化nk細胞受體、btla、toll配體受體、cds、gitr、baffr、hvem（lightr）、kirds2、slamf7、nkp80（klrf1）、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8?α、cd8?β、il2r?β、il2r?γ、il7r?α、itga4、vla1、cd49a、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad（cd11d）、itgae（cd103）、itgal（cd11a）、itgam（cd11b）、itgax（cd11c）、itgb1、cd29、itgb2、cd18、itgb7、nkg2d、tnfr2、trance（rankl）、dnam1（cd226）、slamf4（cd244、2b4）、cd84、cd96（tactile）、ceacam1、crtam、ly9（cd229）、cd160（by55）、psgl1、cd100（sema4d）、cd69、slamf6（ntb-a、lyl08）、slam（slamf1、cd150、ipo-3）、blame（slamf8）、selplg（cd162）、ltbr、lat、gads、slp-76、pag（cbp）、cd19a、特異性地結(jié)合cd83的配體和它們的組合。在一些實施方案中，該胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域是cd28的信號傳導(dǎo)區(qū)域。

12、在一些實施方案中，該car或tcr識別腫瘤抗原。在一些實施方案中，腫瘤抗原是cd19。在一些實施方案中，包括該car的該淋巴細胞是阿基侖賽（axicabtageneciloleucel）或brexucabtagene?autoleucel。在一些實施方案中，該腫瘤抗原是cd19和/或cd20。在一些實施方案中，腫瘤抗原是cll-1。

13、在一些實施方案中，該car或tcr識別抗原，該抗原包括2b4（cd244）、4-1bb、5t4、a33抗原、腺癌抗原、腎上腺素受體β?3（adrb3）、a激酶錨定蛋白4（akap-4）、甲胎蛋白（afp）、間變性淋巴瘤激酶（alk）、雄激素受體、b7h3（cd276）、β2-整合素、baff、b淋巴瘤細胞、b細胞成熟抗原（bcma）、bcr-abl（由斷裂點簇集區(qū)（bcr）和阿伯森鼠白血病病毒致癌基因同源物1（abl）組成的致癌基因融合蛋白）、bhcg、骨髓基質(zhì)細胞抗原2（bst2）、ccctc-結(jié)合因子（鋅指蛋白）樣（boris或印記位點調(diào)節(jié)物兄弟）、bst2、c242抗原、9-0-乙酰基-ca19-9標(biāo)志物、ca-125、caex、鈣網(wǎng)蛋白、碳酸酐酶9（caix）、c-met、ccr4、ccr5、ccr8、cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、cd7、cd10、cd16、cd19、cd20、cd22、cd23（ige受體）、cd24、cd25、cd27、cd28、cd30（tnfrsf8）、cd33、cd34、cd38、cd40、cd40l、cd41、cd44、cd44v6、cd49f、cd51、cd52、cd56、cd63、cd70、cd72、cd74、cd79a、cd79b、cd80、cd84、cd96、cd97、cd100、cd123、cd125、cd133、cd137、cd138、cd150、cd152（ctla-4）、cd160、cd171、cd179a、cd200、cd221、cd229、cd244、cd272（btla）、cd274（pdl-1、b7h1）、cd279（pd-1）、cd352、cd358、cd300分子樣家族成員f（cd300lf）、癌胚抗原（cea）、閉合蛋白6（cldn6）、c型凝集素樣分子-1（cll-1或clecl1）、c型凝集素結(jié)構(gòu)域家族12成員a（clec12a）、巨細胞病毒（cmv）感染的細胞抗原、cnt0888、crtam（cd355）、cs-1（也稱為cd2亞類1、cracc、cd319和19a24）、ctla-4、細胞周期蛋白b?l、染色體x開放閱讀框61（cxorf61）、細胞色素p450?1b?1（cyp1b1）、dnam-1（cd226）、橋粒芯糖蛋白4、dr3、dr5、e-鈣粘蛋白新表位、表皮生長因子受體（egfr）、egf1r、表皮生長因子受體變體iii（egfrviii）、上皮糖蛋白-2（egp-2）、上皮糖蛋白-40（egp-40）、含有egf樣模塊的粘蛋白樣激素受體樣2（emr2）、延長因子2突變（elf2m）、內(nèi)皮唾液酸蛋白、上皮細胞粘附分子（epcam）、肝配蛋白a型受體2（epha2）、肝配蛋白b2、受體酪氨酸蛋白激酶erb-b2,3,4（erb-b2,3,4）、erbb、erbb2（her2/neu）、erg（跨膜蛋白酶、絲氨酸2（tmprss2）ets融合基因）、eta、位于染色體12p上的ets易位變體基因6（etv6-aml）、iga受體的fc片段（fcar或cd89）、成纖維細胞活化蛋白α（fap）、fbp、fc受體樣5（fcrl5）、胎兒乙酰膽堿受體（achr）、纖連蛋白額外結(jié)構(gòu)域-b、fms樣酪氨酸激酶3（flt3）、葉酸結(jié)合蛋白（fbp）、葉酸受體1、葉酸受體α、葉酸受體β、fos-相關(guān)抗原1、巖藻糖基、巖藻糖基gm1；gm2、神經(jīng)節(jié)苷脂g2（gd2）、神經(jīng)節(jié)苷脂gd3（aneu5ac(2-8)aneu5ac(2-3)bdgalp(l-4)bdglcp(l-l)cer）、o-乙?；?gd2神經(jīng)節(jié)苷脂（oacgd2）、gitr（tnfrsf?18）、gm1、神經(jīng)節(jié)苷脂gm3（aneu5ac(2-3)bdgalp(l-4)bdglcp(l-l)cer）、gp?100、globoh糖神經(jīng)酰胺的己糖部分（globoh）、糖蛋白75、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（gpc3）、糖蛋白100（gp1oo）、gpnmb、g蛋白-偶聯(lián)受體20（gpr20）、g蛋白偶聯(lián)受體c類組5成員d（gprc5d）、甲型肝炎病毒細胞受體1（havcr1）、人表皮生長因子受體2（her-2）、her2/neu、her3、her4、hgf、高分子量黑素瘤相關(guān)聯(lián)抗原（hmwmaa）、人乳頭瘤病毒e6（hpv?e6）、人乳頭瘤病毒e7（hpv?e7）、熱休克蛋白70-2突變（mut?hsp70-2）、人分散因子受體激酶、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（htert）、hvem、icos、胰島素樣生長因子受體1（igf-1受體）、igf-i、iggl、免疫球蛋白λ樣多肽1（igll1）、il-6、白介素11受體α（il-11ra）、il-13、白介素13受體亞基α-2（il-13ra2或cd213a2）、胰島素樣生長因子i受體（igf1-r）、整合素α5β1、整合素ανβ3、腸羧基酯酶、κ-輕鏈、kcs1、激酶插入結(jié)構(gòu)域受體（kdr）、kir、kir2dl1、kir2dl2、kir2dl3、kir3dl2、kir-l、kg2d配體、kit（cd117）、klrgi、lage-la、lag3、淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶（lck）、白細胞免疫球蛋白樣受體亞家族a成員2（lilra2）、豆莢蛋白、白細胞相關(guān)聯(lián)免疫球蛋白樣受體1（lair1）、路易斯（y）抗原、ley、lg、li細胞粘附分子（li-cam）、light、lmp2、淋巴細胞抗原6復(fù)合物、ltbr、基因座k?9（ly6k）、ly-6、淋巴細胞抗原75（ly75）、黑素瘤癌睪丸抗原-1（mad-ct-1）；黑素瘤癌睪丸抗原-2（mad-ct-2）、mage、黑素瘤相關(guān)聯(lián)抗原1（mage-a1）、由t細胞識別的mage-a3黑素瘤抗原1（melana或marti）、melana/martl、間皮素、magea3、黑素瘤細胞凋亡抑制劑（ml-iap）、黑素瘤特異性硫酸軟骨素蛋白聚糖（mcscp）、morab-009、ms4a1、粘蛋白1（mucl）、muc2、muc3、muc4、muc5ac、muc5b、muc7、muc16、粘蛋白canag、苗勒氏抑制物質(zhì)（mis）ii型受體、v-myc禽髓細胞瘤病毒癌基因成神經(jīng)細胞瘤衍生同源物（mycn）、n-羥乙酰神經(jīng)氨酸、n-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶v（na17）、神經(jīng)細胞粘附分子（ncam）、nkg2a、nkg2c、nkg2d、nkg2e配體、nkr-p?ia、npc-1c、ntb-a、乳腺分化抗原（ny-br-1）、ny-eso-1、癌胚抗原（h5t4）、嗅覺受體51e2（or51e2）、ox40、漿細胞抗原、聚sa、頂體蛋白酶結(jié)合蛋白sp32（oy-tes?l）、p53、p53突變體、泛連接蛋白3（panx3）、前列腺酸性磷酸酶（pap）、配對盒蛋白pax-3（pax3）、配對盒蛋白pax-5（pax5）、前列腺癌腫瘤抗原-1（pcta-1或半乳糖凝集素8）、pd-1h、血小板衍生生長因子受體α（pdgfr-α）、pdgfr-β、pdl192、pen-5、磷脂酰絲氨酸、胎盤特異性1（plac1）、聚唾液酸、前列腺酶、前列腺癌細胞、前列腺素、蛋白酶絲氨酸21（睪蛋白或prss21）、蛋白酶3（pr1）、前列腺干細胞抗原（psca）、前列腺特異性膜抗原（psma）、蛋白酶體（前體、巨蛋白因子）亞基β型、晚期糖基化終產(chǎn)物受體（rage-1）、rankl、ras突變體、ras同源物家族成員c（rhoc）、ron、受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1（ror1）、腎泛素1（ru1）、腎泛素2（ru2）、肉瘤易位斷點、t細胞3識別的鱗狀細胞癌抗原（sart3）、sas、sdc1、slamf7、唾液酰路易斯粘附分子（sle）、siglec-3、siglec-7、siglec-9、音猬因子（shh）、精子蛋白17（spa17）、階段特異性胚胎抗原-4（ssea-4）、steap、stn抗原、滑膜肉瘤x斷點2（ssx2）、存活素、腫瘤相關(guān)聯(lián)糖蛋白72（tag72）、tcr5y、tcra、tcrb、tcr?γ交替閱讀框蛋白（tarp）、端粒酶、tigit、tnf-α前體、腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物1（tem1/cd248）、腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物7相關(guān)（tem7r）、生腱蛋白c、tgf?β?2、tgf-β、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶5（tgs5）、血管生成素結(jié)合細胞表面受體2（tie?2）、tim1、tim2、tim3、tn?ag、trail-r1、trail-r2、酪氨酸酶相關(guān)蛋白2（trp-2）、促甲狀腺激素受體（tshr）、腫瘤抗原ctaa16.88、酪氨酸酶、ror1、tag-72、尿溶蛋白2（upk2）、vegf-a、vegfr-1、血管內(nèi)皮生長因子受體2（vegfr2）和波形蛋白、維爾姆斯氏瘤蛋白（wt1）或x抗原家族成員1a（xage1）或它們的組合。

14、在一個實施方案中，還提供了一種從供體受試者的血液樣品制備的細胞群體，該細胞群體包括cd4+?t細胞和cd8+?t細胞，其中：至少20%的該收獲的cd4+?t細胞是幼稚t細胞，并且不超過12%的該收獲的cd4+?t細胞是效應(yīng)記憶t細胞；至少10%的該收獲的cd8+?t細胞是幼稚t細胞，并且不超過30%的該收獲的cd8+?t細胞是效應(yīng)記憶t細胞；至少50%的該收獲的細胞是cd3+?t細胞；并且至少25%的所有t細胞是利用編碼car或tcr的多核苷酸載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的。

15、在一個實施方案中，還提供了一種從供體受試者的血液樣品制備的細胞群體，該細胞群體包括cd4+?t細胞和cd8+?t細胞，其中：至少80%的該cd4+?t細胞是ccr7+細胞；至少60%的該cd8+?t細胞是ccr7+細胞；至多20%的該cd4+?t細胞是效應(yīng)記憶t細胞和效應(yīng)t細胞的組合；并且至多40%的該cd8+?t細胞是效應(yīng)記憶t細胞和效應(yīng)t細胞的組合，利用編碼car或tcr的多核苷酸載體來轉(zhuǎn)導(dǎo)。

16、在一些實施方案中，至少25%的該收獲的cd4+?t細胞是幼稚t細胞，并且不超過9%的該收獲的cd4+?t細胞是效應(yīng)記憶t細胞。在一些實施方案中，至少20%的該收獲的cd8+?t細胞是幼稚t細胞，并且不超過20%的該收獲的cd8+?t細胞是效應(yīng)記憶t細胞。在一些實施方案中，該幼稚t細胞被表征為ccr7+和cd45ra+。在一些實施方案中，該效應(yīng)記憶t細胞被表征為ccr7-、cd45ro+和cd95+。在一些實施方案中，至少65%的該收獲的細胞是cd3+?t細胞。在一些實施方案中，至少15%的所有t細胞是利用該多核苷酸載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的。

17、在一些實施方案中，至少80%的該收獲的cd4+?t細胞是ccr7+細胞。在一些實施方案中，至多20%的該收獲的cd4+?t細胞是效應(yīng)記憶t細胞和效應(yīng)t細胞的組合。在一些實施方案中，至少60%的該收獲的cd8+?t細胞是ccr7+細胞。在一些實施方案中，至多40%的該收獲的cd8+?t細胞是效應(yīng)記憶t細胞和效應(yīng)t細胞的組合。

18、在一些實施方案中，該多核苷酸載體是病毒載體。在一些實施方案中，該病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體。在一些實施方案中，該car包括胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，該胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域是cd28的信號傳導(dǎo)區(qū)域。在一些實施方案中，該car識別腫瘤抗原。在一些實施方案中，腫瘤抗原是cd19。在一些實施方案中，包括該car的該細胞群體是阿基侖賽或brexucabtagene?autoleucel。

19、還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含如本文描述的細胞群體。

20、又一實施方案提供了一種用于向受試者施用t細胞的方法，該方法包括：向該受試者注射通過本公開的方法制備的收獲的樣品或該藥物組合物。在一些實施方案中，受試者患有癌癥。在一些實施方案中，該癌癥是b細胞惡性腫瘤。在一些實施方案中，該癌癥是非霍奇金淋巴瘤（nhl）、彌漫性大b細胞淋巴瘤（dlbcl）、小淋巴細胞性淋巴瘤（sll/cll）、套細胞淋巴瘤（mcl）、濾泡性淋巴瘤（fl）、邊緣區(qū)淋巴瘤（mzl）、結(jié)節(jié)外（malt淋巴瘤）、結(jié)節(jié)（單核細胞樣b細胞淋巴瘤）、脾臟彌漫性大細胞淋巴瘤、b細胞慢性淋巴細胞性白血病/淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴母細胞性淋巴瘤、急性髓樣白血病或多發(fā)性骨髓瘤。